Citogenética Convencional y Fish
Cargado por
Jason RosadoCitogenética Convencional y Fish
Cargado por
Jason RosadoCITOGENÉTICA
CONVENCIONAL Y
FISH
Unidad de Genética – INEN
Expositor: Int. TM. Jason Rosado
Sandoval
¿ Qué es un cariotipo?
Es el ordenamiento de los cromosomas de una célula metafásica
de acuerdo a su morfología, tales como el tamaño, la relación de
los brazos dependiendo de la constricción primaria, presencia de
constricciones secundarias, etc. Es característico de cada
especie, al igual que el número de cromosomas; el ser humano
tiene 46 cromosomas en el núcleo de cada célula, organizados en
22 pares autosómicos y 1 par sexual (hombre XY y mujer XX).
La Citogenética
Es el estudio, dentro del campo de la genética,
de los cromosomas, su estructura, su herencia
y del lugar donde se encuentran
Citogenética Convencional Citogenética Molecular
Bandas Q FISH clásico
Bandas R M-FISH
Bandas G
Bandas C SKY
Bandas NOR CGH
Bandeo de Alta
Resolución
EVOLUCIÓN DE LA CITOGENÉTICA
a, Jérôme Lejeune construyendo un
cariotipo humano en su laboratorio
de París (abril de 1966); c, Klaus Patau
observando cromosomas en el Laboratory
of Genetics de Madison
Cultivo y cosecha de Sangre periférica
Cariotipo Convencional
TIPOS DE BANDEO
CROMOSÓMICO
Bandas Q
•Demostrar la porcion
distal Yq
•Regiones
pericentromericas de 3
y 4 , y las regiones
Bandas Q satelitales y pericen-
troméricas de acrocén
El primer método de tinción tricos muestran
desarrollado polimorfismo
Requiere un microscopio
de fluorescencia
Bandas Q brillantes = bandas G oscuras
Bandas R
Bandeo inverso o R
("reverso")
•Opuesto al bandeo G
•Útil para teñir los
extremos distales de los
cromosomas (deleciones o
reorganizaciones distales)
Bandas G
Bandas G- Bandas G-
pálidas oscuras
•DNA rico en
•DNA rico en AT
GC •Replicación
• Replicación tardía
temprana •Pocos genes
• Muchos
genes
Ideograma
Bandas C
Bandas C
Tamaño de la región de
heterocromatina constitutiva
pericentroméricas
•Para 1,9,16 y brazos q del
cromosoma Y.
•Polimorfismos.
•Inv. pericentromericas.
Banda Método Características
Q Tinción con quinacrina Bandas fluorescentes
brillantes.
G Tinción con Giemsa, luego de Las bandas G oscuras
pre-tratamiento del cromosoma corresponden a las Q
brillantes
Patrón inverso al de las Q
R Varias técnicas y G, útiles para definir
los extremos de los
cromosomas.
T Varias técnicas Resaltan las regiones
teloméricas.
C Extracción de DNA/proteínas, Resaltan las regiones
tinción con Giemsa centroméricas.
Tiñen las regiones
NOR Tinción con plata organizadoras del nucléolo
(acrocéntricos en el
hombre)
APLICACIONES
Trisomía parcial de 21q
APLICACIONES
Dx prenatal Trisomía 13
APLICACIONES
LMC
ONCOLOGÍA
APLICACIONES
Leucemia Monocítica Aguda (M5)
ONCOLOGÍA
Ventajas y desentajas de la Citogenética
convencional
Ventajas
1- Permite ver al genoma entero en una sola vez.
2- Conveniente cuando se sospecha una anomalía
específica (ejm. Ph’ en LMC) y como herramienta de
Dx general para detectar el chr adicional.
Anormalidades comúnmente vistos en la progresión de
la enfermedad de LMC
Desventajas
1- Detecta anormalidades estructurales grandes
( una banda = 6Mb de DNA ~ 150 genes ).
2- Necesita mucho trabajo y alta experiencia y
habilidades por el operador
FISH
¿ Qué es FISH?
FISH es una técnica mixta
de citogenética molecular
que nos permite el diagnóstico
rápido de anomalías cromosómicas
en metafase o interfase. Utiliza para ello
una sonda de ADN marcado
PRINCIPIOS DE FISH
PRINCIPIOS DE FISH
Fluorescence in situ
hybridization (FISH)
Incrementa la sensibilidad ,
especificidad , y resolución
del análisis cromosómico.
Las sondas de DNA marcados
con fluorocromos son usados
para detectar o confirmar
genes o anormalidades
cromosómicas que van más
allá de la citogenética de
rutina
Metafase FISH
Interfase FISH
Metafase- FISH Interfase-FISH
TIPOS DE SONDAS
SONDAS CENTROMÉRICAS (CEP)
SONDAS DE LOCUS ESPECÍFICO (LSI)
SONDAS PAINTING (WCP)
SONDA TELOMÉRICA (TEL)
TIPOS DE SONDAS
FISH CONVENCIONAL
Centromérico
Locus específico
Pintado cromosómico
Sondas “Dual-fusion”
Patrón normal
Cromosomas en metafase Núcleo en
interfase
Sondas “Dual-fusion”
Translocación recíproca
Cromosomas en metafase Núcleo en
interfase
Sondas “Break-appart”
Patrón normal
Cromosomas en metafase Núcleo en
interfase
Sondas “Break-appart”
Translocación recíproca
Cromosomas en metafase Núcleo en
interfase
APLICACIONES
Detección de Trisomía y Determinación del sexo
Sondas para
cromosomas
13,18,21,X,Y
y SRY.
APLICACIONES
X- e Y-sondas centroméricas
Verde = X
Rojo = Y
Determinación de probable cariotipo. 46,XY
APLICACIONES
X-sonda centromérica – identificación de cromosoma
pequeño supernumerario (chr. Marcador)
Qué se debería
concluir del hallazgo
con FISH?
Marcador es un
derivativo del
cromosoma X ;
Posible Cariotipo:
47,XX,der(X)
APLICACIONES
Oncología
Sondas de locus únicos( deleción o amplificación)
P58 CLK-1 Locus (1p36).
D7S486 (7q31).
Retinoblastoma (13q14).
P53 (17p13.1).
Her-2/ neu (17q11.2-q12).
FISH / HER 2
Amplificado
No Amplificado
APLICACIONES
Oncología
bcr/abl translocación t(9;22)(q34;q11.2).
M-bcr/abl translocación t(9;22)(q34;q11.2).
IGH/CCND1 translocación t(11;14)(q13;q32).
PML/RARA translocación t(15;17)(q22;q21.1).
TEL/AML1 translocación t(12;21)(p13;q22).
APLICACIONES
LMC – SONDA DE FUSIÓN
t9;22(q34;q11)
APLICACIONES
NEGATIVO PARA FUSIÓN GÉNICA PML/RARA POSITIVO PARA FUSIÓN GÉNICA PML/RARA
PML
RARA RARA
PML/RARA
PML SONDA PML PML/RARA
SONDA
RARA
APLICACIONES
Dual Fusion- Translocaciones
Translocación 14;18
IgH 14
Fusión
Bcl2 18
FISH normal FISH t(14;18)
APLICACIONES
Break appart - Translocaciones
Translocación en Bcl2
Split
Bcl 2
Normal Translocación en Bcl2
FISH
Ventajas:
La resolución es buena (› ~ 2mb).
Puede ser aplicada a células en células en división como en no
división.
La técnica es confiable.
La hibridación con múltiples sondas permite la detección de
productos de translocación.
Puede identificar un rango de mutaciones.
Monitoreo periódico o enfermedad residual en MO.
Desventajas:
No puede detectar pequeñas mutaciones.
Omite Uniparental disomías.
Omite Inversiones.
Sondas no están comercialmente disponibles para todos las
regiones cromosómicas.
Cariotipación espectral ( SKY)
SKY
Ventajas:
Mapeo de puntos de quiebre cromosómicos.
Detección de translocaciones sutiles.
Identificación de cromosomas marcadores, regiones
homogéneamente pintadas,y cromosomas doble minute
Caracterización de rearreglos complejos.
Desventajas:
Equipos muy costosos.
La técnica es laboriosa.
No se pueden detectar rearreglos cromosómicos con 1
sólo cromosoma.
Baja resolución (mayor a 15 Mb ).
Específico, pero no como método de screening.
Hibridación Genómica
comparativa ( CGH)
CGH
Ventajas:
Requiere sólo DNA genómico tumoral.
Puede ser aplicado a tejidos frescos o
congelados, lineas celulares, y muestras
archivadas fijadas con formalina y
parafinadas.
Desventajas:
No puede detectar anormalidades
balanceadas.
Copias de cambios cromosómicos < 10 mb. No
son resueltos
¿ Cuando aplicar FISH?
Ausencia de tejido fresco
Si se ha aplicado citogenética:
• “Cariotipos normales” (linfocito T)
• Metafases con cromosomas de mala
calidad
• Cariotipos muy complejos difíciles de
definir
CITOGENÉTICA CONVENCIONAL vs FISH
CITOGENÉTICA FISH
• Requiere células • No requiere células
en división en división
• Requiere tejido • Permite estudiar
fresco material parafinado o
• Permite detectar congelado
alteraciones • Solo aporta
de todo el genoma información de la
• Bajo coste sonda que se utiliza
económico • Moderado coste
económico
