Titulación de Aminoácidos – Página 1
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS & MATEMÁTICAS
Bioquímica
LABORATORIO:
TITULACION DE AMINOACIDOS
Prof. Harry Alices-Villanueva, Ph.D.
Los aminoácidos alfa son los bloques constituyentes de las proteínas.
Casi todas las proteínas consisten de varias combinaciones de los
mismos 20 aminoácidos. Los aminoácidos son compuestos que contienen
un grupo amino, ―NH2, y un grupo carboxilo, ―COOH. En adición hay
un grupo “R” que es diferente para cada aminoácido. El símbolo “R” se
utiliza aquí para representar una abreviatura generalizada para indicar
un grupo orgánico.
NH2
|
R―C―H
|
COOH
En sistemas fisiológicos donde el pH es casi neutral, el grupo amino de
un aminoácido estará protonado y el grupo carboxilo estará ionizado.
NH3+
|
R―C―H
|
COO-
Esto se conoce como la forma zwitterion del aminoácido.
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Titulación de Aminoácidos – Página 2
En soluciones fuertemente ácidas, el grupo carboxilo estará también
protonado, mientras en soluciones muy básicas ambos grupos, el
carboxílico y el amino, estarán en forma no-protonada.
NH3+ NH2
| |
R―C―H R―C―H
| |
COOH COO-
Ácido Básico
EL comportamiento ácido-base de los aminoácidos se describe mejor con
la teoría de Bronsted de ácidos y bases. Un aminoácido simple (que no
tenga un grupo ionizable ácido o básico en el grupo “R”) es un ácido
bibásico en su forma totalmente protonada; puede donar dos protones
durante su titulación completa con una base. La titulación con NaOH es
una titulación en dos pasos representada como:
+
NH3CHRCOOH + OH- +NH3CHRCOO- + H2O
+
NH3CHRCOOH + OH- NH2CHRCOO- + H2O
La sal hidrocloruro de un aminoácido simple contiene un mol de HCl por cada
mol de aminoácido tal que el mismo está totalmente protonado.
+
NH3CHRCOOH + Cl-
La curva de titulación será bifásica (vea diagrama abajo). Habrá dos
porciones separada o inflexiones en la curva de titulación. El punto
medio de la primera inflexión (B) es donde el aminoácido está mitad en
forma ácida y mitad en forma zwitterion. EL punto de inflexión C ocurre
cuando todo el aminoácido original ya está en forma de zwitterion. El pH
al cual esto ocurre se denomina el pH isoeléctrico (punto isoleléctrico) y
se le da el símbolo pI (asumiendo que el grupo “R” no tiene carga). En la
titulación de pH de un aminoácido con un grupo no ionizable “R”, el
punto de equivalencia ocurre en el pI del aminoácido. En el punto medio
de la segunda inflexión (D), la mitad del aminoácido está en forma de
zwitterion y la otra mitad está en forma básica.
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Titulación de Aminoácidos – Página 3
A: 100% +NH3CHRCOOH
B: 50% +NH3CHRCOOH y 50% +NH3CHRCOO-
C: 100% +NH3CHRCOO-
D: 50% +NH3CHRCOO- y 50% NH2CHRCOOH
E: 100% NH2CHRCOO-
Los valores aparentes de pK par alas dos etapas de disociación pueden
ser extrapolados de los puntos medio de cada inflexión. Esto se puede
demostrar con la ecuación de Henderson-Hasselbach:
[anión]
pH = pK a + log
[ácido]
El pKácido (el pK del grupo carboxílico) es el punto (B) donde la mitad del
grupo ácido ha sido titulado. En este punto la ecuación se vuelve:
pH = pKa
Del mismo modo, el punto (D) nos da el valor del pKamino.
En este experimento, usted titulará una muestra de un aminoácido
desconocido y determinará su pI, pKácido, y el pKamino y comparará estos
valores con los valores reales (teóricos).
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MATERIALES
Buretas de 50 mL Tres beakers de 150 mL
Barras magnéticas Tres beakers de 100 mL
Agitador magnético Pipeta de 25 mL
Medidor de pH con su electrodo Pipeta de 10 mL
Bulbo de pipeta Kimwipes™
SOLUCIONES
Solución de NaOH, 0.3 M
Solución de la sal de cloruro de un aminoácido A, 0.1 M
Solución de la sal de cloruro de un aminoácido B, 0.1 M
Soluciones amortiguadoras (buffers) para calibrar los medidores de pH.
PROCEDIMIENTO
Usted habrá de titular una sola de las soluciones de aminoácidos, A o B,
tres veces.
Titulación de la solución del aminoácido
1. Mantenga el electrodo de pH en agua destilada mientras prepara la
solución de aminoácido y monta la bureta.
2. Enjuague bien la bureta con dH2O. Repita.
3. Obtenga aproximadamente 100 mL de la solución de NaOH. Anote
la concentración. Enjuague y entonces llene la bureta (hasta la
marca graduada en el nivel superior) con la solución de NaOH.
Remueve cualquier burbuja de aire que pueda estar presente,
especialmente en la punta de la bureta. Anote el volumen con qué
va a comenzar.
4. Obtenga aproximadamente 35 mL de una de las soluciones de
aminoácido; anote la letra que la identifica. Enjuague la pipeta de
10 mL con dH2O y luego con dos pequeñas porciones de su
solución de aminoácido. Pipetee 10 mL de su solución de
aminoácido a un beaker limpio de 100 mL. Añada 25 mL de dH2O
(para un volumen total en su beaker de 35 mL.
5. Calibre su medidor de pH. EL medidor permanecerá calibrado
mientras no se apage.
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6. Coloque una barra magnética en el beaker con el electrodo. Ajuste
el electrodo para que no tropiece con la barra magnética. Si el
electrodo no está debidamente sumergido, las lecturas de pH serán
erráticas.
7. Titule la solución de aminoácido con el NaOH en la bureta. Esta
corrida se hace añadiendo NaOH a intervalos de ~1.0 mL hasta que
pase el primer punto de equivalencia; es decir, se mantendrá
añadiendo incrementos de 1.0 mL hasta que el pH suba
abruptamente (el punto C en la gráfica). Anote toda esta data en la
tabla al final de este trabajo, Note que usted puede fácilmente
calcular el volumen de NaOH requerido para llegar al segundo
punto teórico de equivalencia con solo duplicar el volumen que
tomó llegar al primer punto.
8. Llene nuevamente la bureta con NaOH. Tome otro beaker limpio y
seco de 150 mL y “pipetee” 10 mL de su solución de aminoácido al
beaker. Añada 25 mL de dH2O. Titule la solución de aminoácido
nuevamente (Tabla de datos Titulación 1 ); esta vez use intervalos
de 0.5 mL justo hasta antes de llegar a cada punto de equivalencia
y luego gota a gota hasta llegar a cada punto. Esta será la data real
para construir su gráfica. Continúe hasta que se hayan añadido
2.5 equivalentes de NaOH o el pH lea 12.5.
9. Vuelva a llenar la bureta y repita el proceso de titulación (Tabla de
data Titulación 2) con una nueva solución de su aminoácido.
DISPOSICION DE DESPERDICIOS
Las soluciones deben estar a un pH entre 5 y 12 antes de ser
descartadas. Se puede bajar el pH añadiendo HCl o subirlo con peuqeñas
porciones de bicarbonato de sodio.
TABLAS DE DATOS
Concentración de la solución de NaOH _________
Aminoácido (letra) _____
Primera Titulación (alicuotas de 1 mL)
mL de NaOH pH
añadidos
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Por supuesto que la tabla tendrá más filas, al menos 12.
Primer punto de equivalencia _____ mL
Segundo punto de equivalencia ______ mL (esto tal vez sea mejor
calcularlo que medirlo)
Titulación 1
mL NaOH añadidos pH
Titulación 2
mL NaOH añadidos pH
(De nuevo, va a necesitar más filas).
INFORME DE LABORATORIO
1. Escriba un objetivo de dos oraciones para este experimento.
2. Los aminoácidos A y B utilizados en este laboratorio están
incluidos en la lista siguiente: glicina, ácido aspártico, ácido
glutámico, lisina). Vea la estructura en su texto. Identifique el
grupo “R” y dibuje la formula estructural (ácida, básica y
zwitteriónica) mientras la titulación procede. Note que algunos
aminoácidos tendrán tres formas y otros cuatro.
3. Explique si pueden coexistir el grupo amino y el grupo carboxilo sin
carga al mismo pH.
4. Prepare una gráfica con sus resultados, graficando mL de NaOH
versus pH. Construya cada gráfica en papeles separados;
recomiendo usar Excel™ para esto. Recuerde rotular los ejes y déle
un título apropiado a su gráfica.
5. A partir de la curva de titulación, determine los puntos de inflexión,
pI. Este es el punto en donde 1.0 equivalentes de base han sido
añadidos. En este experimento usted usará 10 mL de NaOH 0.1 M
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Titulación de Aminoácidos – Página 7
0 1.0 milimoles del aminoácido (totalmente protonado). Como se
dijo en la introducción, la forma totalmente protonada del
aminoácido puede donar dos protones durante la titulación.
Tomará entonces un equivalente (1.0 milimoles) de base para
titular el primer protón en el grupo ácido y otro equivalente para
titular el protón del grupo amino. Localice el pI y márquelo en la
gráfica.
6. Como el pKácido es el punto medio de la primera inflexión, puede
hallar el pKácido a 0.5 equivalentes de base. Así mismo, el pKamino se
puede hallar a 1.5 equivalentes de base. Rotule estos puntos en su
gráfica.
7. Calcule un promedio de los valores de pKácdio de las últimas dos
gráficas.
8. Calcule un promedio de los valores de pKamino de las últimas dos
gráficas (si posible).
9. Promedio los valores de pI de las últimas dos gráficas.
10. Si posible, calcule el pI hallando el promedio entre el pKácido
promedio y el pKamino promedio. Este es un mejor método para
hallar el pI del aminoácido. Compare los números obtenidos
en el paso 9 con el de este paso 10.
11. Identifique su aminoácido de los mencionados en la lista:
glicina, aspártico, glutámico o lisina. Compare con los valores
reales del pI y calcule un porcentaje de error.
12. Comente sobre la efectividad de este método para identificare
aminoácidos; específicamente, si no hubiera tenido una lista
de donde escoger, ¿sería capaz de diferenciar entre los veinte
aminoácidos? Si no pudo determinar el valor de pKamino,
mencione alguna razón.
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Titulación de Aminoácidos – Página 8
Los 20 Aminoácidos Standard
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