DIVISIÓN ACADÉMICA DE CIENCIAS BÁSICAS
QUÍMICO FARMACÉUTICO BIÓLOGO
LABORATORIO DE HEMATOLOGÍA
PRÁCTICA N° 5
DETERMINACIÓN DE HEMOGLOBINA
ALUMNO
ARMANDO PÉREZ HERNÁNDEZ, 182A20134
PROFESOR
DR. CÉSAR MANUEL LANDA PINEDA
Fecha de realización: 28/09/2021 Fecha de entrega: 05/10/2021
NÚMERO Y NOMBRE DE LA PRÁCTICA: PRÁCTICA N° 5 -DETERMINACIÓN DE HEMOGLOBINA
FUNDAMENTO:
La sangre se diluye en líquido de Drabkin, el cual hemoliza los hematíes y
convierte la hemoglobina en cianometahemoglobina. La solución que se produce
se lee por medio de un espectrofotómetro. Su absorbancia es proporcional a la
cantidad de hemoglobina que contenga la sangre.
Los eritrocitos son lisados por acción del agente tensioactivo presente en el reactivo,
liberando su contenido de Hemoglobina en la solución. La Hemoglobina liberada es
oxidada a metahemoglobina por el ferricianuro, siendo esta última convertida en
cianometahemoglobina por la presencia de cianuro. La absorbancia de la
cianometahemoglobina es medida a 540 nm., siendo la intensidad del color obtenida,
directamente proporcional a la concentración de Hemoglobina en la muestra.
OBJETIVO(S):
Determinar la concentración de hemoglobina en sangre venosa.
INTRODUCCIÓN:
La determinación de Hemoglobina en sangre, es el análisis cuantitativo que se realiza
con más frecuencia en los Laboratorios Clínicos y conjuntamente con el índice
Hematocrito y la CHCM constituyen el medio más sencillo de descubrir la presencia y el
grado de anemia (2- 10). Sin embargo, a pesar de la importancia clínica de dicha
determinación, aún no hay en Costa Rica una estandarización de métodos de parte de
las autoridades y especialistas de Instituciones de Salud, con el objeto de llegar a
resultados concordantes, por lo que existen métodos y va· lores que se adoptan como
normales, métodos que van desde e' más sencillo hasta el más complicado con su
correspondiente grado de exactitud, en los que la sangre es tratada con diversos
reactivos y el color obtenido se compara con un patrón conocido. El presente trabajo
tiene como objeto dar a conocer las variaciones en los resultados que se obtienen de
determinar la hemoglobina por los métodos de la Hematina ácida y la
cianometahemoglobina usados por el Ministerio de Salud y la Caja de Seguro Social
respectivamente, con el fín de compararlos y determinar si los valores obtenidos por el
primer método son confiables y reproducibles respecto al método conocido y
estandarizado como lo es la cianometahemoglobina.
MATERIALES Y REACTIVOS:
MATERIALES REACTIVOS
Material para extracción de sangre Reactivo de Drabkin
2 Tubos al vacío con EDTA( Tubo tapa lila)
Pipeta de Sahli con boquilla Referencia para cianometahemoglobina
1 Pipeta graduada de 5 mL
8 Tubos de ensayo
Agua destilada
Espectrofotómetro Uv-vis
Tabla 5.1. Materiales y reactivos. En la tabla se enlista todo los materiales y reactivos para llevar acabo la determinación de
hemoglobina. Fuente: tabla tomada y modificada del Manual de Laboratorio de Hematología y Banco de Sangre.
EMBALAJE:
Una vez que se haya realizado la extracción sanguínea es importante vaciar la sangre
en un tubo de color lila con EDTA, (Figura 5.1) El tubo EDTA es el tubo estándar utilizado
adecuado para grupos sanguíneos, el aditivo EDTA actúa como un potente
anticoagulante al unirse al calcio en la sangre, el tubo ofrece una protección integral para
las células sanguíneas. Además la temperatura que se debe tener en el área de trabajo
es entre 26°C y 28°C.
Figura 5.1.Tubos tapón lila (EDTA). En la figura se presenta
los tubos de tapón lila con anticoagulante EDTA. Fuente:
imagen tomada y modificada de https://www.google.
com/url?sa=i&url=https%3A%2F%2Ftienda.venoestilsas.com
%2Fproduct%2Ftubo-tapa-lila-3-ml-edta-paq-x-100%2F&psi
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PROCEDIMIENTO:
A) Preparación del reactivo de Drabkin para dilución:
1.Disolver la tableta o polvo en 1 litro de agua destilada.
2.Conservarla en un frasco de vidrio oscuro.
3.Mantenerla a una temperatura estable.
B) Referencia Referencia para cianometahemoglobina (estandarizada):
4. Preparar diluciones con reactivo de Drabkin de tal manera que los patrones
contengan concentraciones de 60 mg, 40 mg, 20 mg de CNHi.
5.Leer los tubos en absorbancia con filtro verde a 540 nm, llevando el fotómetro a cero
con el reactivo de Drabkin.
6. Para calcular la concentración de hemoglobina en cada tubo, realizar el siguiente
cálculo: Hb en g/100 mL = (P x D)/ 1000P = Concentración del patrón.
D = Dilución de la muestra de sangre, que es 251 veces. Para una concentración de
patrón de: 60 mg 15 g/100 mL, 40 mg 10 g/100 mL y 20 mg 5 g/100 mL Después graficar
una curva patrón colocando en el eje de las ordenadas las lecturas en absorbancia
y en la abscisa la concentración de hemoglobina en g/100 mL.
C) Calibración del Espectrofotómetro Uv-vis:
7.Elaborar una curva de calibración.
D) Determinación de hemoglobina:
8. Colocar exactamente en un tubo de 13 x 100, 5 mL de reactivo de Drabkin.
9. La sangre que puede utilizarse es de punción del dedo (sangre capilar) o de
sangre venosa recién extraída.
10.Con una pipeta automática o pipeta de Salhi se toma 0.02 mL (20 L) de
sangre total, limpiar luego la punta de la pipeta y se vierte en el tubo que contenga
reactivo de Drabkin. Se enjuaga 3 veces y se mezcla.
11.Dejar en reposo por espacio de 5 a 15 minutos.
12. Leer en absorbancia a 540 nm llevando a cero el espectrofotómetro con agua
destilada / Drabkin. La lectura en absorbancia del problema debe ser comparada
en la curvapatrón para encontrar a que concentración de hemoglobina corresponde
expresándose en g/100 mL.
RESULTADOS:
Después de haber visto esta práctica de laboratorio, la interpretación de resultados para
esta misma, se puede observar a continuación en la (Tabla 4.2):
Espectrofotómetro Concentración de Interpretación Clínica
Hb (Valores normales)
Patrón A540 = 0,090 12,0 g/dL Hombres: 14-18 g/dl
Muestra 1 A540 = 0,177 16,0 g/dL Mujeres: 11-16 g/dl
Muestra 2 A540 = 0,114 14,5 g/dL Niños: 10-14 g/dl
Tabla 5.2 .Resultados de una determinación de Hb. En la tabla se representa los resultados obtenidos.
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7 :
DISCUSIÓN
El método de la Cianometahemoglobina, que en este estudio nos sirvió de referencia, es
una solución que permite ser medido con un-fotómetro de filtro, y como método
colorimétrico que se está sujeto a controles de calidad, ventajas que devienen en una
mayor exactitud en las determinaciones de Hemoglobina. La diferencias que se obtienen
los valores en otros métodos siempre son significativas, ya que cobra relevancia en el
diagnóstico y el tratamiento de algún tipo de anemia, y en este caso que se utilizó Sahli
se puede clasificar como anémico o no y por su puesto es preferible emplear
procedimientos colorimétricos como la Cianometahemoglobina por su exactItud y
economía a que realizarla por algún otro método.
CONCLUSIÓN:
Los métodos de determinación de la hemoglobina se basan en las propiedades fisico-
químicas de la molécula de hemoglobina. El método recomendado por el Comité
internacional para la estandarización de de la hematología es el colorimétrico de
cianometahemoglobina. Cabe mencionar que dentro de la determinación de
hemoglobina puede haber sustancias que interfieren al valor real en especial a las
drogas y bueno concluyendo se menciona que con el método que se utilizó para esta
práctica , que es la cianometahemoglobina es las recomendada por que es más
confiable y exacta a los resultados que propociona.
CUESTIONARIO
1-¿Qué es la hemoglobina?
La Hemoglobina es una proteína globular, que se encuentra en grandes cantidades
dentro de los glóbulos rojos y importancia fisiológica, para el aporte normal de oxigeno a
los tejidos. Está constituida por cuatro cadenas polipeptídicas (fig. 1): dos α y dos β
(hemoglobina adulta- HbA); dos α y dos δ (forma minoritaria de hemoglobina adulta-
HbA2- normal 2%); dos α y dos γ (hemoglobina fetal- HbF). En el feto humano, en un
principio, no se sintetizan cadenas alfa ni beta, sino zeta (ζ ) y epsilon (ξ) (Hb Gower I).
Al final del primer trimestre la subunidades α han reemplazado a las subunidades ζ (Hb
Gower II) y las subunidades γ a los péptidos ξ. Por esto, la HbF tiene la composición
α2γ2. Las subunidades β comienzan su síntesis en el tercer trimestre y no reemplazan a
γ en su totalidad hasta algunas semanas después del nacimiento.
2.- ¿ Que sustancias interfieren en la Determinación de Hemoglobina?
Se han descrito varias drogas y otras substancias que interfieren en la determinación de
la hemoglobina como:
-Una concentración alta de lípidos puede elevar falsamente el valor de la hemoglobina
en unos 3 g/dL, debido a la turbidez.
-Cuando se emplea EDTAK3 líquido como anticoagulante el contenido en hemoglobina
puede disminuir un 0,5% por efecto de la dilución de la muestra.
-Otros medicamentos y sustancias pueden interferir
3.- ¿ Que significado clínico tiene la Determinación de la hemoglobina?
La Hemoglobina es una proteína conjugada normalmente presente sólo en los eritrocitos.
Esta constituida por cuatro grupos heme (porfirinas), unidos a una cadena polipeptídica.
Los grupos heme son capaces de ligar reversiblemente oxígeno ó dióxido de carbono.
La Hemoglobina transporta el oxígeno desde los pulmones a los diferentes tejidos
corporales, donde es utilizado en el metabolismo energético, y retira de ellos el dióxido
de carbono producido por dicho metabolismo. La cuantificación de la Hemoglobina ya
sea en sangre venosa, arterial o capilar, es de utilidad para el diagnóstico de variadas
patologías que alteran su concentración, puesto que su concentración en la sangre es
esencial para que el transporte de los gases sea adecuado.
4.-¿ Cual es el fundamento de la Electroforesis?
La electroforesis es una técnica de separación muy usada en las investigaciones de
proteínas y ácidos nucleicos (ADN y ARN), que se basa en la movilización de las
moléculas disueltas en una solución de electrolitos a través de un gel por la acción de la
corriente eléctrica.
5.- El análisis de Electroforesis de hemoglobina que mide y cuando se debe
de solicitar:
La electroforesis de hemoglobina mide los niveles de hemoglobina y detecta los tipos de
hemoglobina anormales. Se suele usar para diagnosticar anemia, anemia de células
falciformes y otros trastornos de la hemoglobina. Y se debe solicitar cuando si se
presenta síntomas de un trastorno de la hemoglobina, como:
• Fatiga.
• Palidez.
• Ictericia, que causa un tono amarillento en la piel y los ojos.
• Dolor intenso (anemia de células falciformes).
• Problemas de crecimiento (en niños).
BIBLIOGRAFÍA:
1-Brandan, N., et al,. (2008).Hemoglobina. Recuperado el 04 de Octubre del 2021 del sitio web
de la Cátedra de Bioquímica Faculta de Medicina UNNE: https://docs.moodle.org/all/es
/images_es/5/5b/Hemoglobina.pdf
2-SPINREACT.( 06 de Septiembre del 2016).Determinación cuantitativa dela hemoglobina.
Recuperado el 04 de Ocutbre del 2021. https://spinreact.com.mx/public/instructivo/
QUIMICA%20CLINICA/LIQUIDOS/1001230%20HEMOGLO.pdf
3-Electroforesis de Hemoglobina.(2020, 24 de Junio). MedlinePlus. https://medlineplus.gov/spa
nish/pruebas-de-laboratorio/electroforesis-de-hemoglobina/
4-CROMATEST.(2001, 09 de Febrero). Hemoglobina. Recuperado el 04 de Octubre de 2021.
http://www.linear.es/ficheros/archivos/46_1134015C.pdf
