Laboratorio 4:

Tinción de microorganismos

Biol 3725L
 Repaso de diluciones
1 ml
0.1 ml 1 ml 1 ml
1 ml

9 ml 99 ml 9 .9ml 9 ml 9 ml
1 / 10 1 / 100 0.1/ 10
1/10 1/10
10-1 10-3 1/ 100 10-6 10-7
10-5
1 ml 1 ml 0.1 ml
1 ml

¿Cuántas colonias viables

tengo?
1. Escojo el plato que tenga 10-8
10-6 10-7
entre 25 – 250 UFC. TMTC 2 UFC
2. Utilizo la fórmula de: 265 UFC 25 UFC
UFC * (1/factor de
dilución)
Reportar datos:
1. Placas con estriado: obtuvo o no colonias discretas
2. Dilución en serie: reporte UFC/mL para las tres placas
utilizadas en su sub-grupo (incluya los cálculos)
Objetivos
• Conocer el mecanismo básico y ventajas de una
tinción.

• Aprender conceptos básicos relacionados a:

• Proceso de preparación de un frotis
• Tinción Gram
• Tinción Ácido-Resistente
• Tinción de Esporas
• Tinción de Cápsula (negativa).

• Identificar características en las bacterias en estudio

en base a las diferentes tinciones.
Tinciones de microorganismos
• Tinción Gram (práctica)

• Tinción de Cápsulas - Tinción Negativa (práctica)

• Tinción de Esporas (práctica)

• Tinción Ácido-Resistente (teoría)

• Tinción de flagelos (teoría)

 Morfología y agrupación de
bacterias

Ya se han discutido métodos

de clasificación por morfología
y medios de cultivo.
Ahora utilizaremos tinciones
con el fin de poder seguir
caracterizando a las bacterias.

Espiroquetas

Coco
Bacilo
Morfología y agrupación de bacterias:
Tinción
• La tinción es una de las técnicas más utilizadas en los
laboratorios de microbiología para clasificar microorganismos.

• El tinte es un compuesto orgánico que le da contraste a la

célula.
• cromógeno (solvente orgánico que le provee las
propiedades de color)
• auxócromo (grupo químico que se ioniza con el cromógeno
y forma sales que se pegan a las fibras y tejidos).
• La adhesión del tinte va a depender de la carga que posea.
Tinción
 Tipos de Tinciones
• Simple • Específica
•Diferencial
• Tamaño, arreglo •Para identificar
•Separar y clasificar
y forma estructuras:
los microorganismos
• Un solo tinte observados de
•Ejemplos: Tinción
• Directa acuerdo a sus
de flagelos,
• Tiñe bacteria características
cápsulas y esporas.
• Negativa
•Más de un tinte
• tiñe el fondo
pero no a la
bacteria •Ejemplos:
Tinción Gram y Ácido
resistente
 Tinción simple: un solo tinte , afinidad por carga con componentes
de la superficie de la célula

Ejemplo : azul de metileno

(-) (-)
(+) (-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-) (-)
methylene blue (-)
(-)
(-)
(-) (-)
Tinción diferencial: permite detectar tipos distintos de células
Azul-Violeta Rojo

Pasos de la
Tinción Gram
Cristal violeta (1
minuto)
Lavar con agua (Streptococcus sp.)
Yodo (1 minuto) (Escherichia coli)
Lavar con agua
Alcohol etílico al
95% (20 segundos) Desventajas de técnicas de
Lavar con agua tinción:
Safranina (1 minuto)
Lavar con agua • requieren fijar la muestra
Secar con bibolous con calor: (células mueren)
paper
Gram+= azul-violeta, • calor + químicos pueden
Gram – = rojo distorsionar la forma original
de las células
 Tinción Gram
• Tinte primario- Cristal Violeta (CV), tiñe la bacteria
color violeta.

• Agente mordante- Yodo, forma un complejo insoluble

con CV. Ayuda a adherir el tinte a la célula. Ayuda a
resistir la decoloración.

• Agente decolorizante- alcohol etílico al 95%, sirve

como solvente de lípidos y agente deshidratante de
proteínas. Remueve el cristal violeta.

• Contratinte- Safranina, tiñe de rojo la bacteria.

Resultados - Tinción Gram

Gram Negativo Gram Positivo

 Su pared celular contiene una
capa gruesa de
peptidoglicano

Gram +

Reacción se basa en la
diferencia en la composición
química de la pared bacteriana.

Gram -
Su pared celular contiene una
capa fina de peptidoglicano
 Pared celular procariota

Peptidoglicano: polímero de dos azúcares modificadas (N-acetil glucosamina

y N-acetil ácido murámico ) y tetrapéptidos

enlace β, 1-4

G M G M G M G M
3 4

M G M G M G M G M
G = N-acetil glucosamina tetrapéptido (4 amino ácidos)
M = N-acetil ácido murámico (mureína)
 Pared celular procariota

G M G M G M G M

M G M G M G M G M

G M G M G M G M G M G M G M G M

M G M G M G M G M M G M G M G M G M

G M G M G M G M

M G M G M G M G M
 Tinción Gram
Fundamento
• Membrana externa de las Gram –
• es soluble en solventes orgánicos como el alcohol
• la capa de peptidoglicano es demasiado delgada como para
retener el complejo cristal violeta/yodo que se formó
• por lo que va perdiéndose el color azul-violeta.

• Las Gram + no tienen su capa susceptible a la acción

de solventes orgánicos
• se deshidratan los poros y se cierran
• reteniéndose el complejo cristal violeta/yodo y por
consiguiente el color azul-violeta.
Preparación de la muestra para
proceso de Tinción
Preparación de frotis:
Limpiar la laminilla con papel de
lentes.
Prepara el frotis
Medio líquido- solo se coloca una
porción del cultivo con el “loop” en
la laminilla.
Medio sólido- se coloca una gotita
de agua destilada en la laminilla y
se diluye la porción de cultivo en
ella. Se esparce bien.
Secar a temperatura ambiente
Fijación por calor
 Tinción Gram
Laminilla

Control positivo Desconocido Control negativo

Gram + (Bacillus cereus) Gram – (E. coli)

1. Cubrir frotis con tinte cristal violeta (1 minuto).

2. Enjuague con agua destilada para remover el exceso de tinte.
3. Cubrir frotis con yodo (1 minuto).
4. Enjuague con agua destilada.
5. Enjuague la laminilla con alcohol etílico 95% (no exceder los 30 seg).
6. Enjuague la laminilla con agua destilada.
7. Cubrir frotis con tinte safranina (1 minuto).
8. Enjuague con agua destilada para remover el exceso de tinte.
9. Secar laminillas con papel “bibulous” para remover el exceso de agua.
Secuencia de reacciones
Tinción de Cápsulas
• Cápsula- estructura gelatinosa secretada por algunas
bacterias
• capas de polisacáridos o proteínas que revisten el exterior
de un bacteria
• Función: adherencia y formación de biopelículas (capas de
crecimiento bacteriano) y protección contra fagocitosis
(macrófagos, sistema inmunológico)

• La cápsula se compone de polisacáridos, glicoproteínas

y polipéptidos.

• La mayoría de las cápsulas están compuestas de

polisacáridos, por lo que son solubles en agua.
Tinción de Cápsulas

cápsula
 Tinción de Cápsulas

Tinte primario- Cristal Violeta 1%- tiñe todo el frotis color oscuro

Decolorante y Contratinte- Sulfato de Cobre 20%-se usa para enjuagar el

tinte primario

No se enjuaga con agua porque la cápsula es soluble en agua -

función de decolorante

El CuSO4 es absorbido en el material de la cápsula que ha sido
decolorada - función de contratinte.

La cápsula aparece azul clara en un fondo oscuro.
Tinción de Cápsulas
• Preparación de un frotis cargado (“heavy”).

• Dejar secar a temperatura ambiente.

• Cristal violeta 1% (5-7 minutos).

• Enjuagar con CuSO4

• Secar con “bibulous paper”

• Cryptococccus laurentii
 Tinción de Cápsulas
Tinción simple-negativa
• La tinción se logra mediante una mezcla del tinte y el cultivo
de bacteria.

• El tinte utilizado es “ India Ink” (Se puede utilizar también

eosina o nigrosina).

• Se le conoce como efecto de cielo estrellado.

Efecto de Cielo estrellado
Tinción de Cápsulas
Tinción simple-negativa
• Célula vegetativa- forma metabólicamente activa = bacterias.

• Esporas- forma metabólicamente inactiva y altamente

resistente.

• Los miembros del género anaerobio Clostridium y del género

aerobio Bacillus pueden existir metabólicamente activos o
inactivos.
Formación de esporas como
método de sobrevivencia
En condiciones
ambientales hostiles
ocurre esporogénesis la
cual forma la endospora.

En condiciones
ambientales favorables,
ocurre germinación, lo cual
forma la célula vegetativa
(bacteria).
Formación de esporas como
método de sobrevivencia
Endosporas
• La esporogénesis y la germinación no son medios de
reproducción, son mecanismos de supervivencia de
la célula.
• La composición química de la bacteria la hace
resistente a:
• Calor extremo o excesivo
• Congelación
• Radiación
• Desecación
• Agentes químicos
 Tinción de Esporas
• Tinte primario- Verde Malaquita, requiere calor para la
penetración de este tinte.

• Agente decolorante- Agua, remueve el exceso de tinte, decolora la

célula vegetativa.
• Contratinte- Safranina, tiñe las células vegetativas.

• Note: De obtener una coloración roja al final del proceso de tinción

observando bajo el microscopio, solo se puede determinar que se
tienen células vegetativas. No se puede concluir que es Gram -, eso
sería otro procedimiento a realizar si se quisiera determinar si es
Gram + o -.
 Tinción de Esporas
Parrilla de
metal Laminilla con
frotis

1. Cubrir frotis con tinte verde malaquita y

permita que el colorante humee, pero no
hierva.
“Beaker”
Agua 2. Espere 5 minutos. Si durante los 5 minutos
el tinte se seca añada más tinte.

3. Enjuague la laminilla con agua destilada.

4. Coloque tinte safranina (30 seg).

Hot Plate
5. Seque la laminilla en papel “bibulous”.

6. Observe y dibuje la coloración, morfología y

arreglo de las bacterias bajo el microscopio.
Resultado

Bacillus cereus
Espora (color
verde)
Célula vegetativa (color rojo)
Tinción Ácido-Resistente
• Las familias Mycobacteriae
y Nocardiaceae son ácido
resistente.

• Los microorganismos ácido-

resistentes se caracterizan
por tener una pared celular
gruesa de cera (lipoidal) que
contiene ácido micólico.
Tinción Ácido-Resistente
• Tinte primario- Carbolfucsina-tinte rojo fenólico (5%).
Puede penetrar la pared celular de las micobacterias.

• Agente decolorizante- alcohol ácido

(3% HCl +95% alcohol etílico).

• Contratinte-Azul de metileno- se utiliza para teñir de azul

las bacterias que quedaron incoloras.

• Los organismos que son decolorados por el alcohol ácido

no son ácido resistente.
• Azules: no son ácido resistentes (no tienen ácido micólico en la
pared)
Tinción Ácido-Resistente

Mycobacterium tuberculosis
Observar laminillas!!!
Tinción de flagelos
• Tipo de tinción en la que se pueden visualizar el (los) flagelo(s).
• Utiliza 2 tintes:
• Ácido tánico (agente mordante: engruesa los flagelos)
• Rosalina (colorante que los define)

Mobiluncus spp.
 Resumen resultados de tinciones

Tinción Gram (estructura de pared celular)

Tinción de esporas Tinción de cápsula

Recapitulación
• ¿Cuál es la diferencia entre una tinción simple y una
diferencial?

• ¿Qué tipo de tinción es la Gram?

• ¿Cuál es el fundamento?

• Reactivos utilizados en la tinción Gram

• ¿Qué otro tipo de tinciones puede mencionar?

• ¿Cuales son algunas limitaciones de las tinciones?