Técnicas de Biología
Molecular
Biol 3051L
Objetivos
El cortar el DNA con enzimas de restricción y hacer corridas de
geles usando electroforesis es muchas veces el primer paso
para estudiar un gen. En este laboratorio se hará lo
siguiente:
• Exponer al estudiante a tecnología actual.
• Explicar cómo las enzimas de restricción cortan el ADN.
• Exponer a los estudiantes al uso de técnicas de separación
de fragmentos de ADN mediante el uso de electroforesis.
• Familiarizarse con equipo usado en electroforesis.
Enzimas de restricción
• También conocidas como endonucleasas, cortan los enlaces
fosfodiester del material genético a partir de una secuencia que
reconocen.
• Esto permite, entre otros usos, realizar modificaciones en la molécula
de ADN, lo cual tiene muchas aplicaciones en la biotecnología.
• Uno de los usos es para crear ADN recombinante, por el cual se
introduce el ADN de un organismo en el de otro organismo.
• Esto se puede usar para estudiar la expresion de un gen, para
producir proteínas para tratamientos de enfermedades, vacunas, y
con otros fines.
• Se ha usado, por ejemplo, para producir insulina.
Enzimas de restricción
• La secuencia que reconocen es una secuencia palindrómica
(secuencia que se lee igual en ambas direcciones).
• Son extraídas de bacterias, donde actuan como mecanismo de
defensa para degradar material genético extraño que entre en la
célula.
• Las enzimas de restricción, como las que se van a usar en este
laboratorio - HindIII y EcoRI, toman el nombre de las bacterias que la
producen:
• EcoRI: E = género Escherichia.
co = especie coli
R = cepa RV 13
I = primera endonucleasa aislada de esta cepa
Las enzimas de restricción al cortar ADN
pueden producir dos tipos de cortes:
• Cohesivos o pegajosos: cortan a
manera escalonada en dos
puntos diferentes.
• Abruptos: cortan en un sólo
punto.
De User:Bryan Derksen - Trabajo propio, Dominio público,
https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=1443899
ADN recombinante:
• Luego de cortar un gen se pueden insertar los pedazos en otro
organismo para crear un ADN recombinante.
• La enzima ADN ligasa puede “pegar” los pedazos cohesivos de
pedazos de ADN con secuencias complementarias para formar una
sola molécula.
• Se han usado varios organismos para actuar como vectores para
crear ADN recombinante.
• Lambda es un ejemplo de un bacteriófago usado ampliamente como
vector para crear ADN recombinante por su tamaño relativamente
manejable (48,502 pares de bases).
El ADN se puede manipular para
beneficio humano
• Con la tecnología y técnicas de
biología molecular se puede insertar
genes en bacterias, levaduras, células
de plantas, etc.
• Las células recombinants se pueden
usar para crear grandes cantidades
del producto deseado y poder ser
usados para distintos fines.
• Ejemplos de usos:
• Organismos genéticamente modificados
(GMO): alimentos, producción de
semillas, insecticidas
• Vacunas
• Otros usos en el campo de la medicina
Varias preocupaciones con la
manupulación genética:
• Consideraciones éticas por mal uso o manejo.
• Preocupaciones ambientales de que organismos transgénicos afecten
las poblaciónes silvestres.
• Preocupaciones de efectos a corto y largo plazo de la manipulación
de genes sobre los organismos a los que se le insertan genes.
• Preocupaciones sobre efectos de consumir alimentos genéticamente
modificados.
Principios de electroforesis
• Técnica usada para separar y
purificar macromoléculas (i.e.
proteinas, ácidos nucleicos) que
varían en tamaño, carga o
conformación.
• Cuando moléculas cargadas son
colocadas en un campo
eléctrico, estas migran hacia el
polo positivo (ánodo) o polo
negativo (cátodo) de acuerdo a
su carga.
https://www.yourgenome.org/facts/what-is-
gel-electrophoresis
Geles comúnmente usados:
• Agarosa: polisacárido extraido de algas. No tóxico. Poco poder de
resolución pero alto grado de separación. Separa fragmentos de DNA
de 200 a 50,000 pb.
• Poliacrilamida: polímero de acrilamida. Tóxico. Menor grado de
separación pero alto poder de resolución. Usado para fragmentos de
DNA de 500 pb. Usado para separar mezclas de proteínas.
Eelectroforesis:
• Después de cortar el ADN con las enzimas de
restriccion, los fragmentos son separados por su
tamaño usando un gel de electroforesis.
• Luego de que la gel se “corre” el DNA se tiñe para
revelar los patrones de bandas formados en el gel que
corresponden a fragmentos de diferentes tamaños.
Gel luego de tinción de
Lambda cortado con
varias enzimas de
restricción:
• Fosa 1: Lambda cortado
con Bam H1
• Fosa 2: Lambda cortado
con EcoRI
• Fosa 3: Lambda cortado
con HindIII.
• Fosa 4: Lambda sin cortar.
Fuente: Carolina Biological
restriction enzime dna kit.
Pedazos de ADN al cortar con enzimas
de restriccion
Corte con Corte con
EcoRI HindIII
Práctica de uso de micropipetas:
• Apoye brazo que esté agarrando
micropipeta en superficie firme.
• Utilice la mano contraria para
apoyar la micropipeta
• Introduzca punta de
micropipeta dentro de fosa, sin
tocar el gel.
• Vierta el contenido en fosa,
presionando botón de la pipeta
hasta primer punto de
resistencia.
Electroforesis para separación de tintes:
• La mezcla de agarosa y
buffer tiene que ponerse a
calentar, agitando
frecuentemente hasta que
llegue al punto donde
comience a hervir.
• Una vez que el frasco con
la agarosa ya pueda
tocarse sin quemarse,
vertir con cuidado la
mezcla en la bandeja.
• Poner la peinilla en el
MEDIO de la cámara.
• Dejar que se torne opaco y
sólido.
• Cuando la gel solidifique y
se torne opaca, sacar la
peinilla y poner gel en
cámara de electroforésis
con fosas del lado del polo
negativo.
• Proceder a pipetear las
muestras en las fosas.
• Correr gel.
• Teñir y desteñir.
• Observar gel en
iluminador.
