INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE
BIOTECNOLOGÍA
Asignatura:
TÓPICOS SELECTOS DE BIOTECNOLOGÍA I
Examen tipo B
Profesor:
Noé Duran Figueroa
Alumnos:
Garrido Carreón Martin Rubén
García Juárez Saúl
Grupo: 6BV3
10 de Noviembre del 2021
Problema 1
Obtención del tejido.
Para el propósito de este protocolo se propone el uso de embriones inmaduros (de 9 a 11 días después de la polinización).
El primer paso es la desinfección de mazorcas, se propone el empleo de etanol al 70% (v/v) durante tres minutos,
posteriormente sumergir en hipoclorito de sodio al 50% (v/v) durante diez minutos y dar tres enjuagues con agua destilada
y estéril en ambas etapas. La extracción de los embriones inmaduros debe ser llevada a cabo en una campana de flujo
laminar, se realiza un corte longitudinal a lo largo de la mazorca (Olote) y con una pinza de punta y aguja de disección se
aísla el embrión.
Transformación.
Primero se deben diseñar los plásmidos para expresar RNA de
guía única (sgRNA) y la endonucleasa de Streptococcus
pyogenes Cas9 para eliminar el gen “UNTASTY” de esta
variedad de maíz. El gen sgRNA según la literatura, puede
consistir en un promotor de polimerasa III U6 de maíz, un ARN
CRISPR unido a un ARN CRISPR trans-activante y un
terminador, todos los fragmentos se ensamblarán utilizando
fragmentos de ADN sintetizados químicamente. Uno de los
plásmidos utilizados para la modificación a través de CRISPR
en maíz es pB-nCas9-PBE , que contiene el gen de resistencia
a kanamicina.
El método empleado para realizar la transformación del maíz, será la biobalística, para esto se ocupan partículas de oro de
6μm de diámetro lavadas con etanol al 100% y agua destilada, este método implica precipitar el ADN sobre las partículas
de oro, para esto se puede hacer uso de un lípido catiónico soluble en agua TransIT-2020 (Mirus Bio LLC). Las partículas de
oro recubiertas de ADN se centrifugan a 8.000 g y el sedimento se enjuaga con 100 μl de etanol al 100% y se resuspende
mediante sonicación breve, inmediatamente se cargan las partículas en un macroportador.
Los embriones inmaduros se bombardean con una pistola de helio PDS1000 (Bio-Rad) con una presión de ruptura de 425
psi.
Regeneración
Para la incubación de los embriones después de la transformación se usará el medio MS, al 100% de su concentración, con
un pH ajustado a 5.6 ± 0.01, complementado con 3% de sacarosa , 0.6% de agar y se utilizará kanamicina como agente
selectivo . Con 16 horas luz y 8 de oscuridad y temperatura constante de 28 ± 2 °C , el tiempo de incubación será de 1 a 2
semanas de acuerdo con la respuesta de la elongación de la radícula y coleoptilo.
Para la aclimatación de plántulas transformadas desarrolladas in vitro a invernadero, se usará una mezcla de Peat Mossy
(ya que este sustrato permite el enraizamiento de la plántula) y lombricomposta (1:1), el trasplante se desarrollará cuando
las plántulas alcancen una altura promedio de tamaño 7 cm, lo mismo que la longitud de la raíz de 4 cm y se aplicarán riegos
cada tercer día con solución MS al 50%. Una vez que las plántulas de maíz alcancen en promedio una altura de 15 cm, se
podrán transferir al terreno experimental donde se les proporcionará riego y fertilización.
Problema 2
Etapa 0: Para llevar a cabo el desarrollo de una técnica de micropropagación de una especie de la cual no se tienen datos
estandarizados, se propone tomar explantes juveniles de meristemo apical, cotiledones y yemas axilares aislados de plantas
de pino azul Pinus maximartinezii cultivados en los viveros, de igual forma se pueden utilizar puntas de brotes.
Etapa I (Establecimiento de cultivo aséptico): Lo que se pretende obtener en esta etapa es establecer cultivos viables. El
éxito de esta etapa está determinado por la edad de la planta donadora, por su estado fisiológico y el tamaño del explante.
Estos explantes serán de entre 1 cm y 2 cm de longitud, serán lavados con agua potable para retirar cualquier partícula que
pudiera estar presente, después el material se lavará con agua destilada con detergente Tween 80, en agitación constante
durante 10 min, posteriormente se continúa con tres lavados con agua destilada para retirar el detergente, se sumergen a
diferentes concentraciones y tiempos de exposición según el explante en la solución desinfectante que contiene
antibióticos. Finalmente se realizan tres lavados con agua destilada esterilizada para eliminar cualquier traza desinfectante.
Los explantes ya desinfectados fueron establecidos en medio semisólido MS, con pH entre 5.5-6.5, suplido con sacarosa,
myo- inositol, Tiamina-HCl y Agar-agar, en ausencia de reguladores de crecimiento. Todo se llevará a cabo en cabinas de
flujo laminar.
Etapa II (Multiplicación de explantes): Los explantes se transfieren a un medio de cultivo similar al de etapa de
establecimiento pero adicionando con diferentes concentraciones de citoquininas, como la benciladenina (BA) que
promueve la brotación lateral ya que induce división celular. Estos cultivos serán almacenados a una temperatura de 18°C
a 22°C, en una cámara de fotoperiodo con luz artificial blanca fluorescente por un periodo de 6 horas diarias. Repitiendo
los tratamientos varias veces y utilizando diseños al azar. Se registran el número de nuevos brotes por explante, número de
nudos y número de hojas producidas.
Etapa III (Germinación de embriones o regeneración de raíces y brotes): De los brotes producidos en la etapa anterior se
toman tallos de aproximadamente 3 cm de longitud para evaluar el efecto de diferentes concentraciones de dos auxinas,
el ácido naftalenacético y el ácido indolbutírico, bajo condiciones similares a la etapa de multiplicación. Después de ocho
semanas se registran datos de variables como el número de raíces por tallo, longitud de raíces producidas por tallo y el
porcentaje de enraizamiento. Las plantas enraizadas in vitro y brotes micropropagados serán utilizados en la siguiente
etapa.
Etapa IV (Transplante a tierra de plántulas y aclimatación): Este proceso se llevará a cabo de forma gradual para incrementar
las probabilidades de éxito, la temperatura, sustrato, humedad se determinaron de acuerdo a la distribución natural del
Pinus maximartinezii (Zona sur de Zacatecas, Sierra de Morones). Las plantas serán transplantadas a macetas con suelo del
tipo Feozem háplico PHh, según la clasificación FAO-Unesco (1989), con un contenido relativamente alto de carbono
orgánico (más del 50%), con baja proporción de bases por lo que tiene poca acumulación de carbonato de calcio y gípsico
(acumulación de yeso). Las unidades serán regadas con agua destilada y se cubrirán con bolsas plásticas durante cuatro
semanas para mantener una alta humedad relativa, después de transcurrido este tiempo, se realizarán perforaciones a las
bolsas hasta eliminar completamente y tener una humedad relativa del 55%. Estas estarán ubicadas en una casa malla con
50% de luminosidad y tres riegos diarios durante las primeras dos semanas. La temperatura en el invernadero será de 22°C
durante el día y 18°C en la noche. Al mes del trasplante se evaluará el número de plantas sobrevivientes para los distintos
tratamientos.
Problema 3
Las condiciones de crecimiento que presenta la planta de interés, este caso el arroz se describen a continuación. El arroz
necesita para germinar un mínimo de 10 a 13oC, considerándose su óptimo entre 30 y 35 oC. Por encima de los 40oC no se
produce la germinación. El crecimiento del tallo, hojas y raíces tiene un mínimo de 7o C. Bajo estas condiciones la maleza
que le presenta un mayor problema por su alta presencia y competitividad de nutrientes es la Rottboellia cochinchinensis,
además de evitar el crecimiento de este tipo de hierba debemos prevenir las enfermedades como Pyricularia (presencia de
hongos de este género de la especie oryzae, ataca a las hojas y produce inflorescencias del arroz), el Añublo del arroz
(enfermedad provocada por el patógeno de las plantas Rhizoctonia solani, causante de marchitamiento fúngico) y el
saroclaudio (pudrición de la vaina del arroz provocada por el hongo Sarocladium oryzae en etapas tempranas de
crecimiento). En el caso de Rottboellia cochinchinensis también conocida como caminadora, se ha encontrado que en
suelos con concentraciones altas de carbón se ve limitado su crecimiento. Estudios realizados constan que el carbón en los
suelos, era extremadamente específico respecto a sus huéspedes (49 especies/variedades entre ellas incluidos: arroz, caña
de azúcar, maíz, sorgo) y no provocan un déficit significativo en su crecimiento, sin embargo, la caminadora, no lograba
germinar ya que consideran al carbon como patógeno sistemático infectando sus plántulas antes de que emerjan del suelo.
Por lo tanto al no competir con el carbón proponemos su uso.
Varios estudios apuntan a que altas dosis las auxinas se transformaban en fitotóxicas y que sirven como herbicidas. Como
es el caso del 2,4 D (ácido 2,4-dichlorofenoxiacético) que afecta a las dicotiledóneas. Se debe tener presente que las
variedades de arroz que se han generado son resistentes al grupo de las imidazolinonas, por lo que son resistentes a los
herbicidas en todas las etapas de desarrollo.
El ácido indolacético, AIA, la auxina más común, se suele formar cerca de los brotes nuevos, en la parte superior de la planta,
y fluye hacia abajo para estimular el alargamiento de las hojas recién formadas. Los científicos han obtenido compuestos
químicos, llamados estimulantes del crecimiento, basados en las auxinas naturales. Estas sustancias sintéticas, que se
aplican en forma de aerosol o de polvo, se usan para frenar el brote de los ojos o yemas de las patatas almacenadas, para
destruir las malas hierbas de hoja ancha y para evitar la caída prematura de frutos y pétalos de flores. De igual forma está
el uso de herbicidas comerciales como el glifosato, pero este se encuentra regulado por posibles efectos cancerígenos, por
lo que se propone el uso de urea como adyuvante la cual aumenta su acción a dosis bajas de glifosato y provee un control
eficaz de malezas.
También se propone la generación de una variedad transgénica del arroz, con la adición del gen que codifica la EPSPS, que
determinan resistencia a glifosato en cultivos celulares o plantas. Para la transformación genética se propone el uso de
Agrobacterium. Este sistema tendrá la capacidad de transferir e integrar en el genoma del arroz el gen EPSPS mediante un
plásmido. Este sistema se basa en la capacidad única que posee Agrobacterium tumefaciens para transferir e integrar en el
genoma de las células vegetales DNA (T-DNA) proveniente de un plásmido de la misma bacteria. Agrobacterium tumefaciens
naturalmente infecta plantas dicotiledóneas, razón por la cual este método no se había intentado emplear para la
transformación de monocotiledóneas, sin embargo actualmente convertido en una técnica confiable y altamente
reproducible para la transferencia de genes e interés al genoma en el arroz, además de ser el sistema preferido por las
ventajas que presenta frente a las otras técnicas de transformación empleadas (Tyagi y Mohanty, 2000; Ignacimuthu et al.,
2000; Bajaj y Mohanty, 2005). La forma de asegurarse de que el gen ha sido expresado es utilizando un gen marcador en
este caso se propone a GFP el cual se considera como la herramienta más importante y más potente para vigilar la expresión
génica en diversas clases de células.
Es importante mantener un control biológico de maleza, en este caso podemos recurrir a un control inundativo, el cual
incluye el uso de bioherbicidas aunque su efecto es temporario y suele requerir sucesivas aplicaciones. Una técnica
empleada es el recubrimiento del terreno con una capa de un grosor significativo de restos de plantas. Esto provoca que
las semillas de la maleza al no recibir luz, no llegan a germinar o si en caso de haber germinado, debido a la deficiencia de
luz solar llegan a secarse.
