UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS
(Universidad del Perú, DECANA DE AMÉRICA)
FACULTAD DE MEDICINA
SECCION BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR
ESCUELA PROFESIONAL DE TECNOLOGÍA MÉDICA
CURSO DE BIOQUIMICA y NUTRICION
PRACTICA DE LABORATORIO Nº 01
“ESPECTROFOTOMETRIA”
I. COMPETENCIAS.-
Al finalizar la Práctica de Laboratorio el alumno será capaz de:
● Explicar el fundamento de la Espectrofotometría.
● Determinar la Longitud de Onda de máxima absorción.
● Construcción de la curva de calibración.
● Determinar el Factor de Calibración de una solución Standard.
● Determinar analíticamente la concentración de una muestra problema.
II. PRE-REQUISITOS PARA LA PRÁCTICA DE LABORATORIO.-
● Conceptos Básicos:
- Longitud de Onda.
- Espectro de Absorción.
- Absorbancia.
- Transmitancia.
- Espectro Electromagnético.
- Ley de Lambert-Beer.
- Solución Estándar.
● Conocimiento de cálculos de concentración de soluciones.
III. GENERALIDADES.-
El Análisis Colorimétrico es un conjunto de métodos de análisis cuantitativo que se
fundamentan en la medición de la Intensidad de la luz transmitida a través de una solución
coloreada, ya sea que se trate de sustancias naturalmente coloreadas o que se han hecho de
tal calidad mediante reacciones químicas adecuadas.
La longitud de onda en la que las moléculas de una sustancia absorben con mayor
intensidad la luz, se le denomina "longitud de máxima absorción" o lambda máximo. La mayoría
de las sustancias en solución tienen una capacidad de absorción selectiva sobre las
radiaciones luminosas, cuando esta absorción se realiza en la zona espectral visible, las
soluciones tienen un color determinado.
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Blgo. Marco Antonio Núñez Fonseca Semestre 2021- II
Cuando un haz de luz (Luz Incidente, Io) atraviesa una solución, una parte de la radiación
queda absorbida por las moléculas del soluto coloreado, sufriendo una reducción de su
intensidad (Luz Transmitida, It), proporcional a la capacidad de absorción de dichas moléculas.
Io It
Luz Incidente Luz Transmitida
Si consideramos que cada molécula absorbe una determinada cantidad de luz, la
intensidad de la luz transmitida por una solución disminuirá en relación con el aumento del
número de moléculas que se interpongan entre la fuente luminosa y el observador.
Este número varía de acuerdo con la concentración del soluto y el espesor del recipiente
que contiene la solución, estos factores están considerados en la "Ley de Lambed y Beer", que
rige los principios de la Colorimetría y cuyas formas de expresión son:
Dónde:
Io = Intensidad de la Luz Incidente
It = Intensidad de la Luz Transmitida.
ε = Coeficiente de Extinción Molar.
Valor constante dependiendo de la naturaleza de la sustancia y de la longitud de onda.
l = Espesor del recipiente en cm.
c = Concentración de la solución
Abs = D.O. = Absorbancia = Densidad Óptica = Extinción
La Absorbancia (Abs) aumenta conforme disminuye la Transmitancia (T) y la relación entre
ambas es logarítmica.
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CÁLCULO DE LA CONCENTRACIÓN DE UNA SOLUCIÓN PROBLEMA
Para calcular la concentración de una solución problema con el empleo de un
Espectrofotómetro se realizará con los siguientes métodos:
METODO GARFICO - CURVA STANDARD:
Este método consiste en utilizar varios Estándares de concentraciones conocidas y
progresivas para luego construir un gráfico en un sistema de coordenadas en el que se colocan
las lecturas en las ordenadas (Eje Y) y las concentraciones en las abscisas (Eje X). En la recta
obtenida (Función Lineal), se puede extrapolar la Absorbancia o Densidad Óptica de la muestra
problema, hallando la concentración de la misma en el eje de las abscisas.
METODO ANALITICO - FACTOR DE CALIBRACION (Fc).-
El Factor de Calibración es un término que relaciona la cantidad o peso de una sustancia o la
concentración de la misma con su Absorbancia, es decir la intensidad de luz que absorbe una
sustancia de concentración conocida denominada Standard o Patrón. Matemáticamente es la
inversa de la pendiente de la curva de calibración.
Fc = [Standard] / [ Abs St ]
Dónde:
Fc = Factor de Calibración
AbsSt = Absorbancia del Standard
Standard = Concentración Standard
Con el Factor de Calibración se puede fácilmente determinar la concentración de una muestra
desconocida problema (MP).
[MP] = Abs MP x Fc
Dónde:
MP] = Concentración de la Muestra Problema.
Fc = Factor de Calibración.
AbsMP = Absorbancia de la Muestra Problema.
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IV. PARTE EXPERIMENTAL.-
Simulador : [Link]
• Ubicar en el simulador la solución permanganato de potasio, colocar la cubeta de lectura
a 1 cm de ancho y realizar la siguiente tabla.
• Determinar la concentración de cada tubo estándar, aplicando la formula [Link] = [Link].
Preparar la siguiente batería de tubos:
TUBOS N° 1 2 3 4
mL K2Cr2O7 500 uM 1.20 2.4 4.8 9.6
mL Agua Destilada 8.8 7.6 5.2 0.4
Concentración de K2Cr2O7 uM
Absorbancia a λ = 400 nm
Absorbancia a λ = 500 nm
Absorbancia a λ = 600 nm
Longitud de Onda Optima (λ) λ= nm
Factor de Calibración (Fc)
Factor de Calibración (Fc) Promedio Fc = uM
● Leer las Absorbancias de los 4 tubos a las longitudes de onda de 400 nm, 500 nm y 600
nm.
● Determinar la longitud de onda optima del K2CrO7.
● Leer la Absorbancia de la Muestra Problema en la longitud de onda óptima que el
Profesor responsable de la práctica le hará entrega.
● Con los datos obtenidos: Construir en un papel milimetrado las Gráficas de absorbancia
versus concentración de Dicromato de Potasio para las longitudes de onda y en una
sola gráfica. Con estas gráficas elegir la longitud de onda óptima.
● Determinar la concentración de la muestra problema por el Método de la Curva de
Calibración.
● Obtener el Factor de Calibración (Fc) Promedio con las Soluciones Standard utilizadas
para construir las Curvas de Calibración, utilizando las Absorbancias de la longitud de
onda de máxima absorción de luz.
● Determinar la concentración de la muestra problema por el Método del Factor de
Calibración.
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