Practica Genética General BIO 204
2021 Practicas 4 y 5
Propiedades de los ácidos nucleicos:
• Cuantificación mediante espectrofotometría y medición de la curva
de absorción de los ácidos nucleicos
OBJETIVOS
• Determinar la calidad y el rendimiento de la extracción de los ácidos nucleicos obtenidos
mediante espectrometría:
o Realizar el espectro de absorción de ácidos nucleicos entre 230 a 290 nm y evaluar la
desnaturalización mediante cambios de absorbancia (Practica 4).
• Determinar la calidad y la concentración del DNA extraídos en la práctica previa mediante
electroforesis en geles de agarosa (Practica 5).
FUNDAMENTO y CONSIDERACIONES
CUANTIFICACIÓN DEL DNA
Una vez extraído el DNA se debe de conocer su concentración. Existen diversos métodos para ello:
Métodos cuantitativos por espectrofotométria: Los ácidos nucleicos absorben la luz ultravioleta debido a la
presencia de las bases nitrogenadas en las cadenas de DNA. La absorción de UV del DNA es una
característica que es ampliamente usada para determinar su concentración. Por lo tanto se usa la absorbancia
a 260nm a pH neutro. Una solución de DNA de 1 mg/ml tiene una absorción máxima a 260 nm de 20, cuando
se lee en un espectrofotómetro en una cubeta de cuarzo de 1cm. Se pueden detectar concentraciones de hasta
alrededor de 2.5μg/ml. Las medidas fiables de densidad óptica oscilan generalmente entre OD260 0 ,5 y 1,5.
Así, una solución de:
• dsDNA con una concentración de 50 μg /ml tiene una A260 de 1
• DNAss con una concentración de 33 µg / ml tiene unaA260 de1
• ssRNA con una concentración de 40 µg / ml tiene una A260 de 1
ds (doble cadena)
ss (simple cadena)
Para determinar la concentración de dsDNA de alto peso molecular, se realizan mediciones a 260 y 280 nm.
Por su parte, las proteínas tienen un máximo de absorción a A280 (debido al triptófano, tirosina y
fenilalanina), las lecturas a 280 nm muestran la presencia de contaminante de origen proteico.
Es útil el cálculo de la relación A260 /A280 que expresa la pureza del DNA. Un valor de 1.65 a 2 muestra
una preparación relativamente pura. Si usa fenol en la extracción considere que este tiene una absorción
máxima a 270nm. Las preparaciones que contienen residuos o trazas de fenol pueden dar lecturas más altas
a A260 y por ello la concentración de DNA estará sobrestimada. Por otra parte, valores mayores de 2,0
generalmente se deben a contaminación con RNA.
Asimismo, la absorción a 230 nm indica que la muestra está contaminada con hidratos de carbono, péptidos,
fenoles y compuestos aromáticos. El cociente A260/A230 de muestras puras es de 2,2 aproximadamente.
Cuando se calienta un DNA de doble cadena, se rompen las fuerzas de unión entre las dos hebras y estas se
separan, a este proceso se lo conoce como desnaturalización. Por tanto, el DNA desnaturalizado es de una
sola hebra. La forma más corriente de desnaturalizar el DNA es por calentamiento. Otro agente
desnaturalizante es el pH elevado porque cambia la carga de algunos grupos que forman parte de los puentes
de hidrógeno. En agua destilada (con una fuerza iónica muy reducida) se produce también la separación de
las hebras. Este fenómeno se debe a que, en agua muy pura, existe fuerte repulsión entre las cargas negativas
de los grupos fosfato no es contrarrestada por los correspondientes contra-iones presentes en las soluciones
salinas (Na+, Mg+2).
Métodos semi-cuantitativos:
1) visualización en gel de agarosa con estándares o marcadores de peso molecular y de concentración
conocida (próxima practica).
2) comparación de “dots o gotas” conteniendo diferentes cantidades de muestra con un patrón de DNA de
concentración conocida, en presencia de intercalante fluorescente Bromuro de etidio u otro (o gel red). Sobre
todo cuando la cantidad disponible de ácidos nucleicos es escasa, se usa este método en una placa de agarosa
con bromuro de etidio o gel red.
Geles de agarosa El análisis del DNA genómico obtenido, se realiza mediante electroforesis en geles de
agarosa.
La electroforesis consiste en la separación de moléculas (proteínas, isoenzimas, ácidos nucleicos) a través de
una matriz/gel (agarosa, acrilamida) La matriz funciona como un filtro, separando las moléculas en un campo
eléctrico, de acuerdo al tamaño y la carga neta que poseen. En el caso de los ácidos nucleicos, el grupo fosfato
es el responsable por la fuerte carga negativa en condiciones de pH neutro o alcalino, que está uniformemente
distribuida a lo largo de las moléculas de DNA, RNA haciendo que los fragmentos migren hacia el polo
positivo (ánodo) durante la electroforesis.
La resolución y velocidad de separación de fragmentos de DNA por electroforesis se determinan a través de
la concentración de agarosa (o acrilamida) en el gel y el voltaje aplicado durante la electroforesis. La agarosa
funciona como un tamiz en el que los fragmentos de menor tamaño migran más rápidamente hacia el ánodo
que aquellos de mayor tamaño. Al aumentar la concentración de agarosa se dificulta el movimiento de los
fragmentos a lo largo del gel, permitiendo obtener una mayor resolución en los fragmentos de menor
longitud. El incremento del voltaje aumenta proporcionalmente la velocidad de migración de los fragmentos
en el gel
Para moléculas de DNA del mismo tipo de conformación, sometidas a las mismas condiciones
electroforéticas (voltaje, concentración de agarosa), la velocidad de migración de los fragmentos de DNA en
el gel depende sólo de su tamaño, puesto que las moléculas mayores tendrán más dificultad para atravesar
los poros del gel que las más pequeñas. Así, la movilidad electroforética de un fragmento de DNA es
inversamente proporcional al logaritmo de su longitud. Por lo que se utilizan los ladders o marcadores de
peso molecular con un patrón de tamaño conocido, para calcular la longitud de las moléculas analizadas.
Los ácidos nucleídos separados en geles de agarosa pueden visualizarse mediante tinción con colorantes
fluorescentes, lo cual permite evaluar su integridad y estimar su concentración mediante un análisis
comparativo con patrones de concentración conocida. Los colorantes fluorescentes actúan mediante
inserción entre las pares de bases que conforman el ácido nucleíco. El bromuro de etidio es el más conocido
y fue ampliamente utilizado para la visualización de DNA y RNA. Sin embargo, éste es un reactivo altamente
tóxico, con propiedades mutagénicas, por lo que debe ser manejado con extremo cuidado en el laboratorio.
En la actualidad existen colorantes fluorescentes alternativos, como el Gel Red, desarrollado
específicamente para reducir los riesgos potenciales de la mutagénesis. Asi, GelRed es extremadamente
estable en el tiempo, no mutagénico ni citotóxico y seguro para el medio ambiente.
La técnica para la cuantificación de DNA consiste simplemente en la utilización de una secuencia de
concentraciones de solución patrón de DNA con la que se comparan muestras de DNA de concentración
desconocida. El cálculo de las concentraciones puede realizarse sobre una fotografía digital del gel tomada
bajo luz ultravioleta y con un analizador de imágenes.
MATERIALES Y REACTIVOS
Tubos microcentrífuga DNA Guantes
2 mL
Agarosa Microcentrífuga Rollo de papel
toalla
Gel Red Micropipetas: Fuente de poder
100 -1000 uL,
10 -100 uL.
Buffer de carga de la muestra Cámara de electroforesis Transiluminador
horizontal
buffer TBE (Tris-borato) 5x Marcador de peso molecular Baño María
: 54 g Tris base, 27.5 g ácido
bórico, 20 ml 0.5M EDTA
Agua destilada
PROCEDIMIENTO
NOTA: Es obligatorio utilizar guantes a lo largo de todo el protocolo. Traer al menos 2 pares de
guantes y barbijo
Parte I
1. CUANTIFICACIÓN y ESPECTRO DE ABSORCION DEL DNA
• Después de calibrar el espectrofotómetro contra el blanco, diluir 5 μl de la solución de DNA en 65 μl
de agua (volumen total de 70ul).
• Añadir la solución de ácidos nucleicos, tapar la cubeta y mezclar la solución Para reducir los errores
de pipeteo, realizar la medición al menos 2x y siempre con 5 ul de solución de DNA, como mínimo.
• Medir la absorbancia: Registrar la densidad óptica y determinar el espectro de absorción desde 230 a
290 nm. Si fuera necesario, diluir la muestra en buffer TE hasta que la medida de densidad óptica se
encuentre dentro del rango apropiado (0.3-0.7). No se consideran los valores de A260 inferiores a
0,05 o mayores a 1,5 por el margen de error que contienen
• Para la determinación del efecto de la temperatura en la absorción del DNA de la luz UV, tome una
muestra del DNA aislado y diluya en buffer TE hasta obtener una D.O. entre 0.7 y 1.0. Caliente la
solución en un tubo en baño María hasta 100 Co y luego enfrié inmediatamente el tubo sobre hielo.
Luego, registre la lectura del espectrofotómetro a 260nm. Compare con la muestra control (no
calentada).
Parte II ELECTROFORESIS DEL DNA EN AGAROSA.
Preparación del gel para la electroforesis.
Se utilizará agarosa al 0,7% en buffer TBE.
• Pesar 1,4 g de agarosa en un erlenmeyer, añadir 200 ml de buffer TBE, colocar a horno microondas.
• Una vez fundida la agarosa se añade gel red
• Verter la mezcla en la cubeta de electroforesis y colocar el peine cerca de uno de los bordes. Dejar que
la agarosa solidifique sin mover la cubeta.
• Una vez solidificado el gel, retirar el peine y observar los pocillos formados. Colocar el gel en el tanque
de electroforesis sumergiéndolo en buffer TBE. Gel red se intercalará entre las bases del DNA y emitirá
fluorescencia al ser irradiado con luz UV, permitiendo visualizar los fragmentos de DNA.
Preparación de la muestra.
Una vez transcurrido el tiempo de digestión de la muestra de DNA, añadir, antes de cargar en el gel, 5 μl de
buffer de corrida. Esta solución contiene glicerol (un agente de alta densidad que sirve para que las
muestras sedimenten en el fondo de los pocillos) y azul de bromofenol (un colorante de tamaño molecular
pequeño que sirve para controlar la migración del frente de la electroforesis).
Electroforesis.
Colocar cuidadosamente cada muestra en un pocillo distinto del gel mediante una micropipeta automática.
Reservar un pocillo, para colocar la muestra que contiene el marcador de peso molecular.
Conectar los electrodos del tanque de electroforesis a la fuente de alimentación, aplicando un voltaje
constante de 80 V durante 1 hora.
Visualización y fotografía de los fragmentos de DNA.
Usar lentes de protección.
Una vez terminada la electroforesis, se coloca el gel sobre un transiluminador que emite radiación
ultravioleta de una longitud de onda de 300 nm. Fotografiar el gel
Determinación del tamaño de los fragmentos de DNA.
Sobre la fotografía del gel de electroforesis, medir la distancia recorrida por las bandas, desde el centro del
pocillo hasta la banda, y comparar con los patrones de peso molecular.
Representar gráficamente las distancias migradas por las bandas patrón frente al logaritmo de su tamaño
(en pares de bases).
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BIBLIOGRAFÍA
Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., 1989. Molecular cloning. In: A Laboratory Manual, second ed. Cold Spring
Harbor,
New York.
