TÉCNICAS HISTOLÓGICAS
El objeto de estudio de la histología son los tejidos (y las células que los
componen). A fin de estudiarlos y comprenderlos, cuenta con dos poderosas
herramientas que le permiten observar la microestructura celular y tisular: la
microscopía y la técnica histológica.
La técnica histológica es la serie de pasos ordenados que permiten preparar al
tejido para su observación a través del microscopio. El tejido se prepara para su
observación de acuerdo con el tipo de microscopio que será utilizado.
En el caso de la microscopía de campo claro, la técnica más común para preparar
las muestras es la técnica histológica ordinaria o de inclusión en parafina. En este
proceso, las muestras se infiltran en parafina, con el fin de que tengan la
consistencia adecuada para obtener los bloques con las muestras o especímenes.
Una vez que se tienen los bloques (inclusión), éstos se cortan en un equipo que se
llama micrótomo y con el que se obtienen cortes muy delgados (micrómetros de
espesor) lo que permite observar las estructuras celulares y tisulares. Un paso
más allá que ofrece la información más detallada corresponde al momento de
aplicar la tinción, que da colores a la muestra y gracias a ello es posible identificar
diversas estructuras mediante la observación de estas preparaciones con el
microscopio de campo claro.
PASOS DE LA TÉCNICA HISTOLÓGICAS
1-Obtención del material histológico para estudiar: El mismo generalmente
proviene de.
A) Biopsias quirúrgicas
B) Material obtenido de necropsias
C) Utilización de animales de laboratorio
D) Estudios experimentales en animales o vegetales
E) Material obtenido por cultivo de tejidos
F) Frotis o extendidos
En la obtención del material histológico hay que cumplir con varias reglas,
como ser:
* Realizar la toma del tejido del lugar correcto
* Es preciso hacerlo con cuidado y precaución, a fin de evitar la destrucción
de los tejidos
* Cortar la pieza de órganos macizos en trozos pequeños (entre 1 y 3 cm. x
0,5 cm.), teniendo en cuenta la configuración anatómica
* Los órganos huecos no deben ser muy distendidos para que se conserve
su aspecto normal
* Realizar éste proceso con la mayor rapidez posible para evitar la autodestrucción
del tejido
2-Proceso de fijación: En este paso el tejido obtenido se coloca en una
sustancia fijadora, generalmente líquida, para evitar los cambios post-mortem y
para lograr conservar la forma original del tejido. Unos de los fijadores más
usados es el formol al 10%. En el caso de que realicemos estudios mediante el
microscopio electrónico, deberemos usar otros fijadores más específicos como
paraformaldehido, glutaraldehido y tetróxido de osmio.
Lavados: Se debe lavar el tejido para quitar el exceso de fijador (químico). El exceso de
fijador durante el posterior proceso de infiltración, incluso en la microtomía, podría afectar los
cortes histológicos por eso se debe lavar con agua destilada
Deshidratación: La deshidratación se realiza empleando diferentes soluciones de alcohol a
concentraciones crecientes hasta llegar a alcohol puro. Se utiliza la técnica de parafina, para
así cortar fácilmente.
Aclaración: Una vez obtenida deshidratación absoluta de la pieza, se le coloca a la
misma en el seno un líquido, que mezclándose con alcohol, tenga el mismo tiempo
la propiedad de disolver la parafina es por esa propiedad que recibe el nombre de
“Liquido intermediario”. Pertenecen a este grupo de sustancias el cloroformo,
toluol, xilol y benzol. Tiene como finalidad proporcionarle al tejido un soporte sólido
que posibilite realizar un corte muy fino, por lo que es de suma importancia que el
medio utilizado para la inclusión penetre al interior del tejido. Aquí se forman
bloques de parafina dentro de los cuales están las muestras a estudiar
Microtomia: Se realizan cortes histológicos muy delgados según lo requerido o la
costumbre del laboratorio donde se realice la técnica. Los cortes van de 0,5 micras
hasta 8 u 10 micras, Los cortes se echan al baño de flotación y se ´pescan´ con un
portaobjetos, se marcan con la fecha, el tipo de tejido y la tinción con que se van a
procesar. El ángulo de corte entre el cuchillo del micrótomo y el bloque ha de estar
entre 10º y 15º. Una vez realizado el corte se da un baño de agua destilada, para
que la parafina se estire. Un buen corte histológico debe tener un grosor
aproximado de 3-5 micras para que sea fácilmente atravesado por la luz del sol y
atraviese los poros celulares.
Tinción: Las células por sí mismas, no poseen coloración, por lo tanto, para poder
observar la morfología tisular deben "teñirse”. Existen muchos tipos de tinciones
para diferenciar las distintas estructuras o sustancias en los tejidos. La tinción
más usada o también llamada “de rutina” es la de hematoxilina y eosina. Se usa
un colorante llamado hematoxilina que tiñe las sustancias acidas o que las
contengan. Como se mencionó existen muchas tinciones otros ejemplos serian:
Masson, Pas, Perls, Plata metenamina.
Se observa que en la laminilla al microscopio y se busca lo que se necesite ver
para así llegar a un diagnóstico.
La técnica histológica es muy empleada en los laboratorios y hospitales ya que
nos permite determinar tener el diagnóstico de distintas enfermedades.
Examen inmediato o en vivo:
Al estado fresco: Animales microscópicos uní o multicelulares, células libres de
animales superiores, componentes celulares que quedan libres por métodos que
desintegran la célula, órganos muy delgados, células obtenidas de cultivos de
tejidos. En éstos casos, para evitar la desecación y prolongar las posibilidades de
observación, se agregan líquidos como suero sanguíneo, suero fisiológico a
temperatura semejante a la del animal, usando platinas calientes a 36º - 37º C.
Examen con coloración vitar: Usando soluciones muy diluidas de colorantes no
tóxicos, que se introducen por vía digestiva o por inyecciones, que actúan sobre
células libres.
Examen mediato o de post – mortem: Tejidos y células muertas y seguir una
serie de pasos que constituyen la Técnica Histológica Universal, ya que se utiliza
en todos los laboratorios y sus resultados se interpretan de la misma manera.
CARACTERÍSTICAS GENERALES DEL MÉTODO EN VIVO
Características del método in vivo
° Es un experimento hecho en un tejido vivo de un organismo vivo.
° Da información de lo que está pasando dentro de una célula.
° Es todo lo contrario del método in vitro.
° Sus experimentos son realizados con animales usualmente ratas.
° Sus experimentos son empleados más a menudo en in vitro, ya que es más
adecuado para la observación de los efectos globales de un experimento sobre un
tema de vida.
° La persona técnica de ensayos in vivo es la responsable de llevar a cabo
experimentos y ensayos en organismos vivos, células o tejidos.
Coloraciones
Cabe de destacar que la coloración es un proceso en donde a las células se les
aplica colorante, la cual es una sustancia de color propio, por consiguiente, puede
cederlo a otros cuerpos. Según la teoría física esta ocurre por fenómenos de
absorción, mientras que la teoría química dice que la coloración se debe a la
interacción iónica de los cationes y aniones.
En ciertos casos, cuando se requiera destacar alguna estructura celular se pueden
emplear colorantes inocuos para la vida de las células, estas no modifican la
estructura de ellas ni interfieren en sus funciones. A este procedimiento se le
conoce como coloración vital y sirve para el estudio de las manifestaciones vitales
de las muestras.
Tipos de coloraciones
Coloración supravital, es donde se emplean colorantes que se aplican a células o
tejidos provenientes de organismos vivos. En esta se demuestran: mitocondrias
con el verde de Jano, los gránulos de las células cebadas con el rojo neutro, la
sustancia granulofilamentosa de los reticulocitos con el azul brillante de cresyl,
ramificaciones nerviosas con el azul de metileno; o el ADN y el ARN de las células
con naranja de acridina (empleando el microscopio de fluorescencia).
Coloración intravital, es la que consiste en la administración de colorantes vitales a
través de las vías digestiva o intratraqueal; mediante inyecciones sanguíneas,
linfáticas, subcutánea, o intraperitoneal. Las soluciones de uso más frecuente son:
tinta china, carmín de litio o azul tripan.
Colorantes
Los colorantes tienen dos componentes, uno que aporta el color,
denominado cromógeno, y otro que posibilita la unión a elementos del tejido
denominado auxocromo. El cromóforo se conoce como la organización
molecular dentro del cromógeno responsable de la absorción de un espectro
determinado de longitudes de onda, por otro lado, el auxocromo es que se une
al cromógeno puede influir en su coloración.
Este puede llegar a ser un grupo ionizable, un grupo que reacciona
covalentemente con iones metálicos o puede reaccionar covalentemente con el
sustrato, en este caso el tejido. Los colorantes son normalmente hidrosolubles,
aunque hay colorantes que carecen de grupos ionizables y sirven para teñir
sustancias grasas, como gotas de lípidos.
Tipos de colorantes
Según la naturaleza química se clasifican en:
Básicos: Los cuales son sales en las que la base, normalmente una amina,
aporta el color, mientras que la parte ácida es incolora; esto quiere decir, son
colorantes catiónicos. Tienen apetencia por sustancias ácidas del tejido como el
ADN o ciertos componentes de la matriz extracelular como los
glicosaminoglicanos. La unión de esta se produce por atracción eléctrica. Así,
ponen de manifiesto el núcleo y el ARN, sobre todo el ARNr presente en los
ribosomas por ser muy abundante, así como ciertas matrices extracelulares
ricas en componentes ácidos. Un ejemplo de colorantes básicos son la tionina,
safranina, azul de toluidina, el azul de metileno o la hematoxilina.
Ácidos: son sales con el anión coloreado y la base incolora. Son derivados de
grupos sulfónicos, carboxilos o hidroxilos fenólicos. Tienen apetencia por
sustancias básicas, sobre todo estructuras proteicas localizadas en el
citoplasma celular y también por el colágeno de la matriz extracelular. Su se
debe unión se debe gracias a la atracción eléctrica. Ejemplos de colorantes
ácidos son la fucsina ácida, verde rápido, naranja G o la eosina.
Características del método en vivo
° Es un experimento hecho en un tejido vivo de un organismo vivo.
° Da información de lo que está pasando dentro de una célula.
° Es todo lo contrario del método in vitro.
°Sus experimentos son realizados con animales usualmente ratas.
° Sus experimentos son empleados más a menudo en in vitro, ya que es más
adecuado para la observación de los efectos globales de un experimento sobre un
tema de vida.
° La persona técnica de ensayos in vivo es la responsable de llevar a cabo
experimentos y ensayos en organismos vivos, células o tejidos.
Coloraciones
Cabe de destacar que la coloración es un proceso en donde a las células se les
aplica colorante, la cual es una sustancia de color propio, por consiguiente, puede
cederlo a otros cuerpos. Según la teoría física esta ocurre por fenómenos de
absorción, mientras que la teoría química dice que la coloración se debe a la
interacción iónica de los cationes y aniones.
En ciertos casos, cuando se requiera destacar alguna estructura celular se pueden
emplear colorantes inocuos para la vida de las células, estas no modifican la
estructura de ellas ni interfieren en sus funciones. A este procedimiento se le
conoce como coloración vital y sirve para el estudio de las manifestaciones vitales
de las muestras.
Tipos de coloraciones
Coloración supravital, es donde se emplean colorantes que se aplican a células o
tejidos provenientes de organismos vivos. En esta se demuestran: mitocondrias
con el verde de Jano, los gránulos de las células cebadas con el rojo neutro, la
sustancia granulofilamentosa de los reticulocitos con el azul brillante de cresyl,
ramificaciones nerviosas con el azul de metileno; o el ADN y el ARN de las células
con naranja de acridina (empleando el microscopio de fluorescencia).
Coloración intravital, es la que consiste en la administración de colorantes vitales a
través de las vías digestiva o intratraqueal; mediante inyecciones sanguíneas,
linfáticas, subcutánea, o intraperitoneal. Las soluciones de uso más frecuente son:
tinta china, carmín de litio o azul tripan.
Colorantes
Los colorantes tienen dos componentes, uno que aporta el color,
denominado cromógeno, y otro que posibilita la unión a elementos del tejido
denominado auxocromo. El cromóforo se conoce como la organización
molecular dentro del cromógeno responsable de la absorción de un espectro
determinado de longitudes de onda, por otro lado, el auxocromo es que se une
al cromógeno puede influir en su coloración, este puede llegar a ser un grupo
ionizable, un grupo que reacciona covalentemente con iones metálicos o puede
reaccionar covalentemente con el sustrato, en este caso el tejido. Los
colorantes son normalmente hidrosolubles, aunque hay colorantes que carecen
de grupos ionizables y sirven para teñir sustancias grasas, como gotas de
lípidos.
Tipos de colorantes
Según la naturaleza química se clasifican en:
Básicos: Los cuales son sales en las que la base, normalmente una amina,
aporta el color, mientras que la parte ácida es incolora; esto quiere decir, son
colorantes catiónicos. Tienen apetencia por sustancias ácidas del tejido como el
ADN o ciertos componentes de la matriz extracelular como los
glicosaminoglicanos. La unión de esta se produce por atracción eléctrica. Así,
ponen de manifiesto el núcleo y el ARN, sobre todo el ARNr presente en los
ribosomas por ser muy abundante, así como ciertas matrices extracelulares ricas
en componentes ácidos. Un ejemplo de colorantes básicos son la tionina,
safranina, azul de toluidina, el azul de metileno o la hematoxilina.
Ácidos: son sales con el anión coloreado y la base incolora. Son derivados de
grupos sulfónicos, carboxilos o hidroxilos fenólicos. Tienen apetencia por
sustancias básicas, sobre todo estructuras proteicas localizadas en el
citoplasma celular y también por el colágeno de la matriz extracelular. Su se
debe unión se debe gracias a la atracción eléctrica. Ejemplos de colorantes
ácidos son la fucsina ácida, verde rápido, naranja G o la eosina.
Ventajas y desventajas
Una de las ventajas que tienen es que es estos experimentos pueden dar más
información de lo que realmente está pasando dentro de la célula (propiedades
fisicoquímicas son diferentes a la de soluciones acuosas diluidas, lo que puede
haber un problema con los estudios in vitro ya que las constantes estimadas in
vitro pueden ser muy diferentes a la real in vivo). Todas las células contienen
varios tipos de maquinaria y pequeñas moléculas que pueden ayudar a su
experimento.
Al mismo tiempo esto es una desventaja porque tienen demasiados parámetros
que no se pue den controlar bien. Por lo tanto, no podría ser capaz de darse
cuenta (por lo menos completamente) por lo que está observando. Por otra parte,
los organismos vivos exhiben una gran variabilidad, incluso con el tiempo, que no
puede ser realmente controlada
Una de las ventajas que tienen es que es estos experimentos pueden dar más
información de lo que realmente está pasando dentro de la célula (propiedades
fisicoquímicas son diferentes a la de soluciones acuosas diluidas, lo que puede
haber un problema con los estudios in vitro ya que las constantes estimadas in
vitro pueden ser muy diferentes a la real in vivo). Todas las células contienen
varios tipos de maquinaria y pequeñas moléculas que pueden ayudar a su
experimento.
Al mismo tiempo esto es una desventaja porque tienen demasiados parámetros
que no se pue den controlar bien. Por lo tanto, no podría ser capaz de darse
cuenta (por lo menos completamente) por lo que está observando. Por otra parte,
los organismos vivos exhiben una gran variabilidad, incluso con el tiempo, que no
puede ser realmente controlada
Coloración vital:
Consiste en el empleo de soluciones muy diluidas de sustancias colorantes no
tóxicas, para estudiar a una muestra de células o tejidos. Los colorantes utilizados
son el Verde Jano, Azul tripán, Rojo congo, Rojo neutro, Azul pirrol, etc.
La coloración vital se clasifica en:
a) Coloración intravital: Se basa en la introducción de colorantes no tóxicos en el
organismo vivo por vías digestiva, subcutánea, al torrente sanguíneo o linfático.
Luego se mata al animal y se sigue los pasos de la Técnica Histológica corriente.
En la observación microscópica se verán determinadas estructuras que contienen
b) Coloración supravital: Se realiza sobre células libres, extraídas del
organismo, como el caso de células sanguíneas, células de raspado de la mucosa
bucal o vaginal, cortes finos de tejido cartilaginoso que conserva su vitalidad. Hay
que proceder a la observación rápida antes de que comiencen los procesos de
post – mortem.
TIPOS Y CARACTERÍSTICAS GENERALES DEL MÉTODO
POST MORTEN:
Pasos de la técnica histológica con microscopio óptico:
1- Recolección del material:
Biopsia: biopsia excisional, biopsia incisional, bipsia endoscópica, biopsia
colposcopia, punción aspiración con agua fina (PAAF) y biopsia por punción con
aguja gruesa (tru-cut).
Necropsia: autopsia.
2- Fijación: el tejido se coloca en una sustancia fijadora, generalmente liquida,
para preservar la muestra y conservar la forma original del tejido. Los
fijadores más usados son el formol al 10% (formaldehído). En caso de
microscopio electrónico para formaldehído, grutaraldehído y tetróxido de
osmio.
3- Deshidratación: baños en alcohol para eliminar agua.
4- Aclaramiento: la muestra se sumerge en xileno para eliminar el alcohol y
hacer que el tejido se trasparente.
5- Inclusión: tiene como finalidad proporcionarle al tejido un soporte sólido que
posibilite realizar un corte precisó. Se forman bloques de parafina para
ocupar los espacios donde se encontraba el agua.
6- Coloración o tinción: las células por si solas no poseen coloración, por lo
tanto necesitan teñirse para poder observar su morfología.
7- Observación: Se observa la laminilla al microscopio.
Fijadores y tipos:
Fijadores simples: formol 10%, alcohol etílico absoluto o al 96%, alcohol metílico,
ácido ósmico 1-2%, dicromato de potasio 3-5%
Fijadores compuestos:
Solución de Bouin (ácido pícrico, formol, ácido acético).
Solución Zenker (dicromato de poasio, cloruro de mercurio y ácido acético).
Solución de Helly (dicromato de potasio, cloruro de mercurio y formol).
Clasificación de los fijadores:
Físicos: ° Desecación
° Calor seco
° Calor
° Húmedo
° Congelación
Químicos: ° Fijadores simples
° Fijadores compuestos
Clasificación de los colorantes:
Por su origen:
° Naturales……………. Animal/Vegetal ° Carmín
° Hematoxilina
° Orceína
Artificiales: Derivados de la anilina: que a su vez es un derivado de la destilación
de la hulla. El colorante artificial más usado es la eosina.
Por el radical con color:
° Colorante básico
° Colorante ácido
° Colorante neutro
Por los componentes celulares que colorea:
° Colorantes nucleares
° Colorantes citoplasmáticos.
Tipos de coloraciones:
De rutina: coloración hematoxilina-eosina (H-E).
Ortocromáticas: los tejidos adquieren el color del colorante empleado.
Metacromáticas: los tejidos o componentes de los tejidos adquieren un color
distinto al del colorante.
Progresivas: el colorante es aplicado en concentraciones crecientes.
Regresivas: los tejidos se sobrecolorean para someterlos después a la acción de
una sustancia denominada diferenciador, con la finalidad de extraer el exceso de
colorante.
Impregnación: involucra la deposición de sustancias metálicas (cobre, plata, oro)
en la superficie de las células y tejidos, por. lo que no se considera una verdadera
coloración.
Coloraciones específicas: para los componentes celulares o tisulares.
Coloración con hematoxilina-eosina:
Es la coloración más utilizada en la histología. Consiste en la aplicación de dos
colorantes, uno que es la hematoxilina, que se encarga de teñir el núcleo celular y
la eosina, que tiñe el citoplasma y los componentes citoplasmáticos, según la
afinidad de cada componente celular.
