UNIVERSIDAD TÉCNICA DE AMBATO
FACULTAD DE CIENCIA E INGENIERÍA EN ALIMENTOS
INFORME DE PRÁCTICA DE LABORATORIO
DATOS INFORMATIVOS:
DATOS INFORMATIVOS:
Carrera: Biotecnología Nivel: Segundo “B”
Integrantes: Naomi Cajiao, Nathaly Romero, Eder Paredes, Bryan Silva, Diana Vallejo
Asignatura: Bioquímica Practica de laboratorio N°: 4
Fecha de realización: 04/12/2020 Fecha de presentación: 11/12/2020
Docente: Lorena Nuñez, PhD Auxiliar de laboratorio: Ing. Paola Chuquilla
Ciclo académico: 2020-2021
TEMA:
CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA DE AMINOÁCIDOS
1. OBJETIVOS.
Objetivo General
• Evidenciar a la cromatografía como un método físico para la separación de
aminoácidos.
Objetivos Específicos
• Identificar la influencia de la polaridad para diferenciar aminoácidos en las pruebas de
cromatografía.
• Comprender la relación entre el factor de retención en una cromatografía y la velocidad
que esta tenga.
2. DATOS Y RESULTADOS
2.1 Datos
Tabla 1
Distancia recorrida por cada uno de los pigmentos de un extracto de arce otoño-invierno
al realizar cromatografía de papel
Muestra Solvente Pigmentos Distancia recorrida
(Fase Móvil) Presentes (cm)
Éter-cetona Caroteno 4.70
Extracto Arce
Otoño-Invierno Antocianina 4.10
Alcohol Isopropilo Caroteno 4.70
Antocianina 3.90
Nota: La información fue proporcionada del simulador
[Link]
2.2 Cálculo demostrativo
• Fórmula para el cálculo del factor de retención
𝐷𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑒𝑙 𝑐𝑜𝑚𝑝𝑢𝑒𝑠𝑡𝑜 𝑑𝑒𝑠𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑙í𝑛𝑒𝑎 𝑑𝑒 𝑎𝑝𝑙𝑖𝑐𝑎𝑐𝑖ó𝑛 ℎ𝑎𝑠𝑡𝑎 𝑠𝑢 𝑑𝑒𝑠𝑝𝑙𝑎𝑧𝑎𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜
𝑅𝑓 =
𝐷𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑞𝑢𝑒 𝑟𝑒𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖ó 𝑒𝑙 𝑒𝑙𝑢𝑦𝑒𝑛𝑡𝑒 Ec.1
• Cálculo del factor de retención del caroteno presente en el extracto de arce otoño-
invierno en un solvente de éter-cetona usando cromatografía de papel
4.70 𝑐𝑚
𝑅𝑓 =
5 𝑐𝑚
𝑅𝑓 = 0.94
Figura 1
Cromatografía para la separación de aminoácidos-Fase Inicial
Nota: Se visualiza el inicio de una cromatografía para la separación de aminoácidos, se encuentran 3
muestras (Asparagina, Fenilalanina y Valina) ubicadas en papel de celulosa para posteriormente ser
expuestas a un solvente Apolar Desconocido. Es importante mencionar que, las muestras no presentan
una coloración tan intensa como en la imagen, estas se presentan de forma incolora y se necesita el
uso del revelador ninhidrina para poder verlas, sin embargo, para una mejor apreciación didáctica se
utilizó colores semejantes a los reales.
Figura 2
Cromatografía para la separación de aminoácidos-Segunda Fase
Nota: Las muestras de Asparagina, Fenilalanina y Valina después de exponerse al solvente apolar
presentan su debido desplazamiento con lo que se observa que la fenilalanina es el aminoácido que
viajó más por el papel mientras que la asparagina es el que viajó menos. Si recordamos que el solvente
usado en la fase móvil es apolar, la fenilalanina es el compuesto menos polar entre los tres, es por ello
que se tuvo mayor desplazamiento, al contrario de la asparagina que es un compuesto polar y es el
aminoácido que menos se movilizó.
Figura 3
Cromatografía para la separación de aminoácidos-Tercera Fase
Nota: Para finalizar, se toman diferentes medidas en la cromatografía resultante para así hallar el
factor referencial de cada compuesto, entre ellas la medida del desplazamiento del solvente por el papel
de celulosa y así mismo el desplazamiento que tuvo cada aminoácido después de someterse a esta
solución. Haciendo los cálculos respectivos se llegó al resultado que la Asparagina tiene un factor de
retención de 0.32, la Fenilalanina de 0.61 y la Valina de 0.41. Cabe decir que los resultados y datos
han sido basados de fuentes bibliográficas.
2.2 Resultados
Tabla 2
Resultados de la separación de pigmentos de un extracto de arce otoño-invierno por medio
de cromatografía de papel
Muestra Solvente Pigmentos Factores de
(Fase Móvil) Presentes Retención
Éter-cetona Caroteno 0.94
Extracto Arce
Otoño-Invierno Antocianina 0.65
Alcohol Isopropilo Caroteno 0.88
Antocianina 0.60
Nota: La información fue proporcionada del simulador
[Link]
Tabla 3
Resultados de la separación de aminoácidos al realizar una cromatografía en capa fina-
Asparagina
Muestra Solvente Factor de Presentación en la
(Fase Móvil) Retención naturaleza
-Fuentes animales como
productos y sueros
lácteos, carne de ternera,
aves de corral, huevos,
pescado y mariscos
Asparagina Cloroformo,Metanol 0.859
o Amoniaco -Fuentes vegetales como
espárragos, patatas,
legumbres (incluida la
soja), frutos secos y
semillas
-Y, se produce a partir de
la Biosíntesis
Navarro (2014)
Nota: La información fue proporcionada del simulador
[Link]
Tabla 4
Resultados de la Separación de Aminoácidos al Realizar una Cromatografía en Capa Fina-
Fenilalanina
Muestra Solvente Factores de Presentación en la
(Fase Móvil) Retención naturaleza
-Fuentes Animales
principalmente en
alimentos ricos en
proteínas, carnes rojas,
pescado, huevo y
Fenilalanina Cloroformo, Metanol 0.954 productos lácteos
o Amoniaco
-Fuentes Vegetales como
los espárragos, garbanzos,
lentejas, cacahuetes, soja
y dulces.
-Así mismo se encuentra
en muchas de las drogas
psicotrópicas usadas
habitualmente.
Plimmer, R. H. A. (1912)
Nota: La información fue proporcionada del simulador
[Link]
Tabla 5
Resultados de la Separación de Aminoácidos al Realizar una Cromatografía en Capa Fina-
Valina
Muestra Solvente Factores de Presentación en la
(Fase Móvil) Retención naturaleza
-Fuentes Animales como
carnes, aves, pescados,
lácteos, requesón y
huevos.
Valina Cloroformo, 0.919 -Fuentes vegetal como
Metanol o Amoniaco arroz integral, plátano,
cacahuetes, cereales
integrales, legumbres,
levadura de cerveza,
melocotón, semillas de
sésamo, los frutos rojos,
chocolates y algunas
especias.
Valle (2010)
Nota: La información fue proporcionada del simulador
[Link]
1. DISCUSIÓN
La cromatografía es una técnica dedicada al fraccionamiento de los analitos presentes
en una muestra, se fundamenta en dos propiedades principales; la adsorción y la partición. La
adsorción es el fenómeno por el cual los componentes de la muestra se adhieren a la superficie
de la fase estacionaria gracias a los enlaces dipolo-dipolo formados y puentes de hidrogeno, en
el caso de la partición, esta representa la distribución selectiva basada en la solubilidad de los
componentes de las muestras, de modo que a medida que la fase móvil avanza sobre la fase
estacionaria, va arrastrando al analito que es soluble en ella (Lamarque, Zygadlo, López, Torres
y Maestri, 2008).
En esta práctica se utilizó la cromatografía de papel y de capa fina, aunque estas dos
presenten un sólido adsorbente como fase estacionario, manifiestan particularidades que las
diferencian: la cromatografía en papel suele ser más lenta, es susceptible a la corrosión de
soluciones muy básicas o muy ácidas y a pesar de ser un material ordinario presenta una
sensibilidad bastante importante en el análisis de muestras con marcadores enzimáticos o
radiactivos de hasta 1 mg, por otra parte, en las cromatografías de capa fina su capa adsorbente
puede ser de sílica gel, hidróxido de aluminio, alúmina, etc. y depende de un soporte que la
mantenga erguida (Lamarque et al., 2008).
Para la determinación de aminoácidos de distintas muestras sometidas a cromatografía
en capa fina y de papel (poseen características relativamente polares), aquí el diluyente
hacienda por capilaridad y permite manifestar a analitos que se han adherido rápidamente al
adsorbente gracias a su afinidad polar, por lo contrario, los analitos apolares serán desplazados
rápidamente hasta llegar a tramos superiores ya que tienen poca afinidad polar por ende menor
adherencia. La relación entre la distancia recorrida por el analito y la distancia alcanzada por
el eluyente es conocida como factor de retención (Rf). Los aminoácidos poseen grupos
funcionales y cadenas laterales cargados que permitirán reconocer su polaridad; los
aminoácidos con cadena de alquilo más larga tendrán una menor polaridad con respecto con
los que tienen más cortas (Yurkanis, 2008).
En la Tabla 1 se presentan la distancia que han recorrido las muestras a través del papel,
para el análisis se utilizó el extracto de una hoja de arce de Otoño-Invierno. El extracto
manifestó dos pigmentos vegetales: el caroteno y la antocianina. El caroteno es un pigmento
liposoluble formado por fragmentos de isopreno, de modo que es una molécula apolar
(Yeverino Gutiérrez, 1997), a su vez, según Toledo Matus (2018) las antocianinas son iones
flavilio, con dos anillos aromáticos, uno benzopirilico y uno fenólico unido a tres carbonos.
Tales muestras se sometieron a solventes diferentes: éter-cetona y alcohol isopropilo.
Al utilizar éter-cetona el caroteno se desplazó 5cm mientras que la antocianina recorrió 4.10
cm, evidenciando que el caroteno tiene menor polaridad en relación con la antocianina, este
último presenta una mayor polaridad relativa por su actividad aniónica permitiendo la
interacción con la fase estacionaria. Al exponer los analitos a Alcohol isopropilo hubo una
disminución en la distancia recorrida pues el caroteno recorrió 4.70 cm y la antocianina 3.90
cm, valores que son relativamente menores que al utilizar éter-cetona como disolvente esto se
da ya que el alcohol isopropilo tiene mayor polaridad por la presencia de su grupo OH por ende
no habrá una partición significativa desde la fase estacionaria hacia la fase móvil. En base a
tales datos, se manifiesta los factores de retención en disolución de éter-cetona donde para
caroteno es de 0.94 y para antocianina es 0.65, en disolución alcohol isopropilo el caroteno
presenta un Rf de 0.88 y la antocianina un Rf de 0.60.
Toledo Matus (2018) en su estudio analiza la presencia de antocianinas presentes en las hojas
de Pseudobombax ellipticum en sus distintas fases de desarrollo foliar, para esto utiliza la
cromatografía de papel donde se constata que la antocianina varía su polaridad a media que
cambia su fase de desarrollo, y por lo tanto el valor de Rf varía, encontró que la fases más
intensas la antocianina presenta una mayor polaridad con un Rf de 0.52. Los valores se acercan
a los de la presente práctica, pero no van a ser los mismos, ya que los factores como las
dimensiones del papel, humedad, temperatura y presión atmosférica intervienen directamente
en la técnica, además, hay escasos estudios que analicen los pigmente de las hojas de arce en
Invierno/Otoño.
Las Tablas 3, 4 y 5 indican los resultados obtenidos al realizar una cromatografía de capa fina
en los aminoácidos: asparagina, fenilalanina y valina, con solución
cloroformo:metanol:amoniaco en proporción [Link]. Estos no presentaron una mancha
inmediata en la fase estacionaria por lo que fue necesario rociar ninhidrina hasta que se coloree
de color purpura, esto se da por la reacción de dos moléculas de ninhidrina con un aminoácido
donde la cadena lateral del aminoácido se desprende en forma de aldehído, este se descarboxila
y se deshidrata para formar un ión dipolar y este ión dipolar se hidroliza para dar lugar a la
amina que al condensarse con otra molécula de ninhidrina forma el color púrpura (Chávez y
Camayo, 2017).
CONCLUSIONES
• La cromatografía se evidencia como un método para identificar aminoácidos debido a
que es un proceso físico de separación, gracias a esto, se pudo observar que al dividirse
las biomoléculas analizadas existe una fase estacionaria y otra móvil en donde dicha
diferencia muestra de que aminoácido se trata.
• Se identificó que en el proceso de cromatografía la molécula que alcanza un mayor
desplazamiento es la menos polar mientras que la se encuentra más cerca de la línea de
referencia es la más polar, siendo así, al identificar un aminoácido la polaridad que la
biomolécula tenga va a influir directamente sobre los resultados de la cromatografía.
• Se concluye que, al tener un factor de retención con velocidad constante, el tiempo será
directamente proporcional a la distancia, por lo que esto permite identificar cuando una
molécula que atraviesa por el proceso de cromatografía se encuentra en fase
estacionaria o móvil.
CUESTIONARIO
4.1 Cuál es la función de la fase móvil, fase estacionaria y ninhidrina en la cromatografía
de capa fina de aminoácidos?
La fase móvil dentro de la cromatografía de capa fina cumple con la función de desplazar a los
analitos a través de la fase estacionaria debido a la diferencia de polaridad haciendo que unos
compuestos se desplacen una distancia más larga que otra. Por otra parte, la fase estacionaria
al estar constituida por celulosa retendrá a moléculas de carácter polar.
La función de la ninhidrina es la de servir como revelador de la presencia de aminoácidos (AA),
esto es posible debido a que la ninhidrina reacciona con los grupos amino de los AA dando
lugar a la formación de un complejo coloreado que indica la presencia de los AA.(Polo Díez,
L. M. 2015).
Para esta cromatografía los AA con grupos R apolar tienen la tendencia a desplazarse en
conjunto con la fase móvil(apolar), mientras que los AA polares se mantendrán retenidos por
la fase estacionaria.
4.2 Consulte y describa otro método de separación de aminoácidos
Un método apto para la identificación de aminoácidos es la espectroscopía de absorción
atómica pues esta es capaz de funcionar con muestras bastante pequeñas y determinar la
concentración de los analitos presentes, esta técnica utiliza la Ley de Beer que se basa en cuanta
radiación de una longitud de onda es absorbida por el analito y así poder conocer de manera
precisa su concentración, depende de uso de equipos costosos por lo que los laboratorios
pequeños prefieren realizar cromatografías para determinar la presencia de los aminoácidos
Yurkanis, 2008). La electroforesis, aunque sirva como método de separación de compuestos,
no es apto para tratar aminoácidos ya que se especializa en la separación de macromoléculas,
es decir, fragmentos de ADN y ARN, proteínas o polipéptidos Solomon, Berg y Martin, 2013).
4.3 Realice un esquema que explique el ciclo de la urea
Figura 4
Ciclo de la Urea
Fuente: Universidad De Alcalá. (2014). Bioquímica-2° Farmacia. Uah.
[Link]
El ciclo de la urea está dado en 6 etapas, empieza en la matriz mitocondrial, formándose
el carbamoil fosfato por la unión de amoniaco,CO2 y dos moléculas de ATP, pasa al segundo
paso como citrulina, qué es formada por el carbamoil fosfato más la L-ornitina, que es
considerado un aminoácido no proteico, seguido por acción de una encima se libera el grupo
fosfato y sale de ésta, pasan al citosol a formar la argininosuccinato, a través de la unión de la
L arginina y el aspartato, finalmente se disocia y se forma la L-arginina más un fumarato
siendo estas precursores directos de la urea.
4.4 Investigue y describa enfermedades que pueden ser causadas por alteraciones en el
metabolismo de aminoácidos
Según la Organización Panamericana de la salud (1995) las distintas alteraciones
producidas por un mal metabolismo de los aminoácidos a corto o largo plazo pueden producir
diferentes enfermedades, de acuerdo con el tipo de aminoácidos o su conformación, a
continuación, se nombran las más importantes como:
Transtorno de aminoacidos de cadena ramificada.
Acidemia: No se puede descomponer proteinas y grasas, por ende se acumula
un acido en la sangre lllamado acido metilmalónico.
Hipervalinemia Niveles elevados de una encima llamada valina tanto en
sangre como en la orina .
Isoleucinemia hiperleucínica Afecta la funcion de glandulas endocrinas.
Trastornos del metabolismo de los ácidos grasos.
Adrenoleucodistrofia [Addison Schilder) Daña la membrana que separa las
células nerviosas del cerebro.
Deficiencia de carnitin-palmitiltransferasa muscular Se manifiesta problema
con una o dos enzimas, la CPT1 o la CPT2.
Trastornos por el ciclo de la urea.
Aciduria argininosuccínica Se manifiesta en neonatos con vomitos diarreas enr los
primeros dias de nacimiento.
Argininemia Se caracteriza por la deficiencia de arginasas.
Citrulinemia Se trata de una deficiencia en una de las enzimas necesarias para la
incorporación del amoníaco en la urea.
RECOMENDACIONES
• Se debe usar las cromatografías en capa fina cuando se requiere separar los
componentes de las muestras obteniendo resultados cualitativos o sus características
químicas.
• Cuando un disolvente que es usado en la fase móvil desplaza a los analitos hasta un
Rf=1 es recomendable cambiar el tipo de eluyente que se está usando para poder
observar bien a los analitos de la muestra.
• Se debe tener cuidado con el tipo de revelador que se emplea en la cromatografía en
capa fina, ya que un mal revelador puede afectar los compuestos UV de los analitos.
BIBLIOGRAFIA
Chávez, A., & Camayo, T. (2017). Pruebas generales para carbohidratos. Universidad del
Cauca
Navarro, F ( 2014). «¿Asparagina, asparragina o esparraguina?». En Diario Médico, ed.
Laboratorio del lenguaje. Consultado el 3 de febrero de 2016
Lamarque, A., Zygadlo, J., López, L., Torres, M., Maestri, D. (2008). Fundamentos teórico-
prácticos de química orgánica (1ra ed). Editorial Encuentro.
Plimmer, R. H. A. (1912) [1908]. Plimmer, R. H. A.; Hopkins, F. G., ed. The Chemical
Composition of the Proteins. Monographs on Biochemistry. Part I. Analysis (2nd
edición). Londres: Longmans, Green and Co. pp. 93-97. Consultado el 4 de junio de
2012.
Polo Díez, L. M. (2015). Fundamentos de cromatografía. Dextra Editorial.
[Link]
Organización Panamericana de la salud. (1995). Clasificación Estadística Internacional de
enfermedades y problemas de la Salud CIE-10.
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es+por+metabolismo+de+aminoácidos&hl=es&sa=X&ved=2ahUKEwiOsu-
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Toledo Matus, X. (2018). Antocianinas y fotosíntesis durante el desarrollo foliar de
Pseudobombax ellipticum (Kunth) Dugand. UNIVERSIDAD DE CIENCIAS Y
ARTES DE CHIAPAS. 10.13140/RG.2.2.10526.36166.
Valle, C. (01 de Enero de 2010). Nutritienda: ¿Pará que sirve la Valina? Beneficios y
propiedades. Obtenido de [Link]:
[Link]
rojos%2C%20chocolates%20y%20algunas%20especias.
Yeverino Gutiérrez, M. L. (1997). Determinación cuantitativa de carotenoides en hojas de
cinco especies del género leucaena (Doctoral dissertation, Universidad Autónoma de
Nuevo León).
Yurkanis, P. (2008). Química orgánica (5ta ed). Pearson Education.
Solomon, E.P., Berg, L.R. y Martin, D.W. (2013). Biología (9ª ed). CENGAGE Learning.
