ILUSTRACIONES REFERENTES A LA TÉCNICA DE DETECCIÓN DE
ANTÍGENOS EN TEJIDOS POR INMUNOHISTOQUÍMICA
ANTIGENOS UBICADOS EN LOS TEJIDOS
ANTICUERPO PRIMARIO QUE REACCIONA CON LOS ANTIGENOS DE LOS
TEJIDOS DESPUÉS DE LA PRIMERA INCUBACIÓN
ANTICUERPO SECUNDARIO (ESTE ANTICUERPO TIENE UNA MARCA DE
BIOTINA), REACCIONA CON EL ANTICUERPO PRIMARIO QUE HA
QUEDADO FIJADO AL TEJIDO
MARCA DE BIOTINA (UBICADA A NIVEL DEL ANTICUERPO
SECUNDARIO)
ESTREPTAVIDINA MARCADA CON PEROXIDASA DE RABANO PICANTE
PEROXIDASA DE RABANO PICANTE (ENZIMA UNIDA A LA
ESTREPTAVIDINA), REACCIONA CON EL SUSTRATO CROMOGENICO
DIAMINOBENCIDINA PARA DAR UN PRECIPITADO COLOR MARRON QUE
SE UBICA EN LOS TEJIDOS
SUSTRATO CROMOGENICO (DIAMINOBENCIDINA)
PROCEDIMIENTO DE INMUNOHISTOQUIMICA
PRIMER PASO.- INCUBACIÓN CON EL ANTICUERPO PRIMARIO. DESPUÉS
DE LA PRIMERA INCUBACIÓN EL ANTICUERPO PRIMARIO QUEDA
LIGADO A LOS TEJIDOS QUE TIENEN EL ANTIGENO CORRESPONDIENTE
SEGUNDO PASO.- INCUBACIÓN CON EL ANTICUERPO SECUNDARIO.
DESPUÉS DE LA SEGUNDA INCUBACION EL ANTICUERPO SECUNDARIO
BIOTINLADO (UNIDO A BIOTINA) QUEDA LIGADO AL ANTICUERPO
PRIMARIO
TERCER PASO.- INCUBACIÓN CON EL CONJUGADO ESTREPTAVIDINA –
ENZIMA PEROXIDASA DE RABANO PICANTE (QUEDA UNIDO AL
ANTICUERPO SECUNDARIO BIOTINLADO) Y LA ENZIMA PUEDE ACTUAR
SOBRE EL SUSTRATO CROMOGENICO DIAMINOBENCIDINA PARA DAR
UN PRECIPITADO COLOR MARRON CUANDO LA REACCION ES POSITIVA
CUARTO PASO.- INCUBACIÓN CON EL CROMÓGENO. LA ENZIMA
PEROXIDASA DE RABANO PICANTE ACTUA SOBRE EL SUSTRATO
DIAMINOBENCIDINA DANDO LUGAR A UN PRECIPITADO DE COLOR
MARRÓN
PROCEDIMIENTO DE INMUNOHISTOQUIMICA
- La Inmunohistoquímica tiene por finalidad la identificación de
proteínas específicas en tejidos, lo cual contribuye a precisar los
diagnósticos microscópicos y en algunos casos decidir tratamientos.
- Se parte de cortes histológicos de tejidos embebidos en parafina y no
coloreados, se les desparafiniza calentando el corte histológico en
una estufa a 60º
- Aclaramiento de los cortes histológicos con xilol (que disuelve la
parafina) y rehidratación posterior utilizando etanol en grados
decrecientes (95%, 90% y 85%), completando con agua destilada
- Incubación con peróxido de hidrógeno al 3% disuelto en agua
destilada durante 10 minutos para bloquear la actividad de
peroxidasa endógena
- Lavar el tejido con buffer TRIS (pH 7.6) para eliminar el H2O2
- Proceder a la RECUPERACIÓN DE ANTÍGENOS enmascarados
durante la fijación con formol, la fijación disminuye o elimina la
antigenicidad de las proteínas de los tejidos, el formol forma enlaces
cruzados entre proteínas (puentes hidroximetilenos), es un efecto
reversible
- Los fijadores que contienen alcohol o acetona afectan la
antigenicidad en un grado menor. Los fijadores para microscopía
electrónica (glutaraldehido y tetróxido de osmio), afectan la
antigenicidad incluso más que el formol
- La inclusión en parafina de los tejidos se realiza a altas temperaturas
y en este paso también se puede disminuir la antigenicidad de las
proteínas
- Existen dos métodos para la recuperación antigénica o
desenmascaramiento de los antígenos: digestión enzimática y calor
- Se mencionará solo uno: incubación en horno de microondas durante
30 minutos, utilizando buffer citrato a pH 6, terminado el
procedimiento lavar con buffer TRIS
- Incubación de los cortes histológicos con los anticuerpos primarios
(obtenidos comercialmente), que son generalmente del tipo
monoclonal durante 30 minutos.
- LOS ANTICUERPOS PRIMARIOS POLICLONALES SON UNA
MEZCLA DE ANTICUERPOS DE DIFERENTES
ESPECIFICIDADES sintetizados por distintos clones de células
plasmáticas, el animal que se usa con mayor frecuencia para la
fabricación de estos anticuerpos es el conejo. Hay problemas de
reproducibilidad por variaciones en los lotes de reactivos
- LOS ANTICUERPOS PRIMARIOS MONOCLONALES SE
FABRICAN MEDIANTE LA TÉCNICA DEL HIBRIDOMA,
TIENEN ALTA ESPECIFICIDAD, se reduce el riesgo de
reacciones cruzadas, la fuente de anticuerpos es ilimitada ya que los
hibridomas se pueden congelar, descongelar y volver a cultivar
- Producto de la incubación los antígenos del tejido reaccionan con los
anticuerpos añadidos (SI LOS ANTÍGENOS QUE SE ESTÁN
INVESTIGANDO NO ESTÁN PRESENTES EN EL TEJIDO EL
RESULTADO DEL PROCEDIMIENTO SERÁ NEGATIVO)
- Eliminar los anticuerpos no unidos mediante lavado con buffer TRIS
y realizar una segunda incubación con el anticuerpo secundario
biotinlado (anticuerpo con una marca de biotina), por 15 minutos,
este último se unirá a los anticuerpos primarios que queden fijos en
el tejido durante la primera incubación.
- De esta manera el anticuerpo primario puede actuar como un
antígeno para el anticuerpo secundario que se une a la fracción Fc
(fracción constante) del primario
- El siguiente paso es el lavado correspondiente para eliminar los
anticuerpos segundarios no unidos e incubación con la enzima
peroxidasa de rábano picante conjugada con estreptavidina por 15
minutos. La estreptavidina se unirá a la biotina adherida a los
anticuerpos secundarios
- A cada molécula de anticuerpo primario se pueden unir varios
anticuerpos secundarios con lo que se amplifica la reacción
- Lavar nuevamente con el buffer ya mencionado y añadir el sustrato
cromogénico (Diaminobencidina, DAB) en una solución que
contiene peróxido de hidrógeno
- Si la reacción es positiva se depositará un material granular de color
marrón en el citoplasma de las células epiteliales
- La estreptavidina es una proteína tetramérica no glicosilada que es
producida por el microorganismo Streptomyces avidinii, tiene una
avidez sorprendente por la biotina, que es una molécula pequeña y
forma parte del complejo B (B7), al ser un tetrámero tiene 4 sitios
potenciales de unión con la biotina (cada monómero se une a una
molécula de biotina) y el complejo formado por estas dos moléculas
es muy estable. No se conocen las interacciones moleculares que dan
lugar a esta unión tan fuerte
- La peroxidasa de rábano picante reduce el peróxido de hidrógeno
hacia oxígeno molecular y agua, con el primero el cromógeno DAB
es oxidado dando un precipitado de color marrón que se deposita en
las células en las que ha habido reacción positiva
- Se efectuará también una CONTRA-TINCIÓN CON
HEMATOXILINA para colorear los núcleos
- Deshidratar y proceder al montaje de la muestra para su observación.
- Debe haber controles de calidad tanto internos (en el mismo tejido
que se está analizando) como externos (usando otro corte
histológico)
- Una de las variantes de esta técnica consiste en el uso de polímeros:
el polímero tiene unidas varias moléculas de enzima y varias
moléculas de anticuerpos secundarios
- Variantes de esta técnica que usan tiramida marcada con biotina: la
tiramida es un compuesto fenólico que por acción de la peroxidasa de
rábano picante se convierte en un radical libre que se une a
aminoácidos aromáticos tales como la tirosina y el triptófano de las
proteínas, por lo que donde se encuentre la peroxidasa habrá tiramida
marcada con biotina unida a proteínas (donde se ubica el anticuerpo
primario), para su detección debe volverse a añadir complejos
estreptavidina – peroxidasa
- Otra enzima que se puede usar además de la peroxidasa de rábano
picante: FOSFATASA ALCALINA, su acción es hidrolizar los
ésteres de naftol fosfato para dar lugar a compuestos fenólicos y
fosfatos, los fenoles reaccionan con sales incoloras de DIAZONIO
(cromógenos) para producir colorantes insolubles del tipo azo, un
ejemplo de estas sales es la FUCSINA NUEVA, el resultado es de
color rojo y no marrón como en la diaminobencidina. El bloqueo de
la fosfatasa alcalina endógena se realiza con levamisol
APLICACIONES DE LA INMUNOHISTOQUIMICA EN EL
CANCER DE MAMA
- Identificación de factores pronósticos (relacionados con la
supervivencia global después del diagnóstico y la supervivencia libre
de enfermedad):
• Tasa de proliferación (Ki-67), identifica a las células que están
en el ciclo celular (positividad nuclear), se informa el
porcentaje de positividad, a mayor tasa de proliferación peor
pronóstico pero hay mayor posibilidad de respuesta a la
quimioterapia.
• P53: gen supresor tumoral: La expresión inmunohistoquímica
de proteína p53 se ha comportado como un factor
independiente de mal pronóstico en el cáncer de mama,
(positividad nuclear), se informa el porcentaje de positividad.
Las mutaciones se asocian a positividad por IHQ, mientras que
en los casos en los que la proteína es normal es negativa por
Inmunohistoquímica.
• Densidad vascular: Se pueden utilizar marcadores endoteliales
(los más comunes son CD31 y CD34).
- Identificación de factores predictivos (relacionados con la
probabilidad de respuesta a determinados tratamientos):
• Receptores de Estrógenos y Progesterona: La positividad es
nuclear, se informa el porcentaje de positividad, el mínimo es
5%, predicen buena respuesta a la manipulación hormonal con
antiestrógenos (tamoxifen, raloxifen, etc.).
• c-ERB-B2: Es un tipo de receptor del factor de crecimiento
epidérmico, la positividad es de membrana, se informa en
cruces según la intensidad de la coloración. Su positividad
indica respuesta a anticuerpos contra esta proteína (terapia
biológica)
POSITIVIDAD DE MEMBRANA
POSITIVIDAD DE MEMBRANA
POSITIVIDAD NUCLEAR
POSITIVIDAD NUCLEAR
POSITIVIDAD CITOPLASMÁTICA
POSITIVIDAD CITOPLASMÁTICA
RESULTADO NEGATIVO
