Práctica 7.
Cuantificación de muestras de DNA genómico y determinación de la
integridad por electroforesis
Romero-Beltrán Angela Darely, Rivero-López Luis Alejandro, Díaz-Cruz Víctor Daniel,
Mendoza-Sánchez Ian Alexei
Asignatura: Técnicas moleculares.
Licenciatura QFBT.
Universidad del Valle de México
Fecha de entrega: 11 de Octubre de 2021
Docente: Sergio Francisco Cornelio Martínez
Resumen
La electroforesis es una técnica que emplean los científicos en el laboratorio utilizada para
separar el ADN, el ARN, o moléculas o proteínas en base a su tamaño y carga eléctrica, se
utiliza una corriente eléctrica para mover las moléculas y que se separen a través de un gel.
En esta práctica se realiza una cuantificación del peso de las muestras de ADN extraídas en
la práctica pasada, en donde con ayuda de un equipo de electroforesis se observa el
desplazamiento de las muestras por el gel de agarosa con respecto a una marca de peso
molecular conocida.
Palabras clave: ADN, Agarosa, Centrifugación, Electroforesis, Extracción, Incubadora.
Introducción
La electroforesis en gel es una técnica corriente a través de un gel que contiene
utilizada para separar fragmentos de ADN las moléculas de interés. Con base en su
(u otras macromoléculas, como ARN y tamaño y carga, las moléculas se
proteínas) por su tamaño y carga. La desplazan por el gel en diferentes
electroforesis consiste en aplicar una direcciones o a distintas velocidades, con
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lo que se separan unas de otras. (Khan amortiguadora llena la cámara hasta un
Academy. 2021) nivel en el que apenas cubre el gel. (NHI.
2021)
Todas las moléculas de ADN tienen la
misma cantidad de carga por masa. El extremo del gel que tiene los pozos se
Debido a esto, la electroforesis en gel coloca hacia el electrodo negativo. El
separa los fragmentos de ADN extremo sin pozos (hacia donde migrarán
únicamente por su tamaño. La los fragmentos de ADN) se coloca hacia el
electroforesis nos permite ver cuántos electrodo positivo. (NHI. 2021)
fragmentos diferentes de ADN están
presentes en una muestra y cuán grandes Una vez que el gel está en la cámara,
son unos con respecto a otros. También cada una de las muestras de ADN que
podemos determinar el tamaño absoluto queremos analizar (por ejemplo, cada
de un fragmento de ADN examinándose reacción de PCR o cada plásmido
junto a una "escala" estándar de digerido con enzimas de restricción) se
fragmentos de tamaño conocido. (Khan transfiere cuidadosamente a uno de los
Academy. 2021) pozos. Un pozo se reserva para el
marcador de peso molecular, un estándar
Como su nombre lo indica, en la de referencia que contiene fragmentos de
electroforesis en gel participa un gel: un ADN de longitudes conocidas. Los
bloque de material similar a la gelatina. marcadores de ADN comerciales cubren
Los geles para separar ADN suelen estar diferentes intervalos de tamaños, por lo
hechos de un polisacárido llamado que trataremos de usar uno con buena
agarosa, que se consigue como hojuelas "cobertura" en el intervalo de tamaños en
secas pulverizadas. Cuando la agarosa se el que esperamos encontrar nuestros
calienta en una solución amortiguadora fragmentos. (AccessMedicina 2013)
(agua mezclada con algunas sales) y deja
enfriar, se forma un gel sólido ligeramente A continuación, se aplica energía eléctrica
blando. A nivel molecular, el gel es una a la cámara y empieza a fluir corriente a
matriz de moléculas de agarosa que se través del gel. Los grupos fosfato de su
mantienen unidas por puentes de esqueleto de azúcares-fosfato le otorgan
hidrógeno y que forman pequeños poros. una carga negativa a las moléculas de
(Khan Academy. 2021) ADN, por lo que comienzan a moverse a
través de la matriz de gel hacia el polo
En un extremo, el gel tiene muescas en positivo. Cuando el sistema está
forma de ranuras llamadas pozos, que encendido y pasa corriente por el gel, se
son donde se colocarán las muestras de dice que el gel está corriendo.
ADN, antes de agregar las muestras de (AccessMedicina 2013)
ADN, el gel debe colocarse en una
cámara. Uno de los extremos de la Conforme corre el gel, los fragmentos más
cámara se conecta a un electrodo positivo cortos de ADN viajarán más rápido a
y el otro extremo se conecta a un través de los poros de la matriz del gel
electrodo negativo. El cuerpo principal de que los fragmentos más grandes.
la cámara, donde se coloca el gel, se Después de un rato que ha corrido el gel,
llena con solución amortiguadora con los fragmentos más cortos de ADN
sales que puede conducir la corriente. estarán más cerca del extremo positivo
Aunque tal vez no puedas verlo en la del gel y los más largos se mantendrán
imagen superior (gracias a mis fabulosas cerca de los pozos. Los fragmentos de
habilidades artísticas), la solución ADN muy pequeños podrían correr hasta
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salirse del gel si lo dejáramos corriendo Hipótesis
por demasiado tiempo (AccessMedicine
2013) Se consigue armar correctamente el
equipo de electroforesis, así como
Planteamiento del problema preparar el gel de agarosa para su uso en
el equipo de electroforesis, Las muestras
Conocer el armado y uso correcto de la de ADN previamente extraídas y
cámara de electroforesis, así como la almacenadas de forma correcta no se
correcta preparación del gel de agarosa degrada dándonos así como resultado
para el estudio y la integridad del material una muestra visible de ADN.
genético por electroforesis.
Método
Justificación
Buffer de carga 6x (loading buffer):
Mediante la electroforesis podemos
separar fragmentos de ADN y ARN en En un matraz de 500mL colocar 100mL
función de su tamaño, visualizarlos de agua destilada (estéril) y añadir 0.5 mg
mediante una sencilla tinción, y de esta de azul de bromofenol (0.05% w/v), 200
forma determinar el contenido de ácidos microlitros de EDTA (0.5M pH 8 estéril), 5
nucleicos de una muestra, teniendo una mg de SDS y glicerol (30% en la solución
estimación de su concentración y grado final).
de entereza.
Buffer de corrida (TAE 50x):
Objetivos
En un matraz de 500mL, colocar 24.2 g
General de Tris base, 5.71 mL de ácido acético
glacial y 10 mL de EDTA 0.5 M (pH 8
Conocer el fundamento y el correcto estéril) y aforar a 100mL. A partir de esta
manejo de la Analizar de forma solución stock preparar la solución de
cuantitativa por medio de electroforesis trabajo (TAE 1x).
con geles de agarosa diferentes muestras
de ADN extraídas en la práctica anterior. Preparación del gel de agarosa al 0.8%
Específicos En un matraz de 100 ml, con una probeta
colocar 30 ml de buffer TAE y 0.24 g de
● Analizar por métodos cuantitativos agarosa. Disolver la agarosa con
y cualitativos la pureza e integridad temperatura y agitación constante, es
del DNA extraído en la práctica importante cuidar la temperatura ya que la
anterior solución no debe llegar a ebullición.
● Cuantificar DNA genómico por Añadir 5 μl de bromuro de etidio, mezclar
espectrofotometría perfectamente sin hacer burbujas y dejar
enfriar la solución de agarosa (aprox.
● Comprender los fundamentos de la 40°C). Sellar con cinta adhesiva el
electroforesis de ácidos nucleicos soporte donde se verterá el gel de
en geles de agarosa agarosa y colocar el peine que servirá
para formar los pocillos del gel. Verter la
solución de agarosa con bromuro de
etidio en el soporte sellado. Se deja
polimerizar el gel entre 20 y 30 minutos.
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Preparación de las muestras de DNA Para esto se realizaron dos buffer con
diferentes concentraciones, aunque solo
Mientras se deja polimerizar el gel, calcula el buffer 2x fue el usado en el armado de
el volumen que se debe tomar de la la cámara de electroforesis.
muestra de DNA para tener 500 ng/μl. En
un pedazo de parafilm tomar el volumen
de la muestra de DNA y mezclarlo con 2
μl de loading buffer 6X.
Electroforesis
Una vez polimerizado el gel, quitar la cinta
adhesiva y el peine con cuidado para no
romper los pozos. Colocar el soporte del
gel en la cubeta de electroforesis. Los
pozos deben estar cerca del cátodo (polo
negativo de color negro). Se añade el
buffer TAE de tal forma que cubra bien el
gel de agarosa. Colocar en el primer pozo,
1 μl del marcador de peso molecular. Fig. 2 Buffer 2x.
Posteriormente, colocar la muestra
A Continuación se agregó la solución de
preparada (ADN + 2 μl de loading buffer).
agarosa ya solidificada para su uso en la
Se tapa la cámara de electroforesis y se
electroforesis, así como buffer TE hasta
conectan los electrodos a la fuente de
esta tocar el gel.
poder. Se programa la fuente a 50 V por
aproximadamente una hora. Una vez
terminada la electroforesis, visualizar el
ADN con la luz UV del transiluminador y
tomar una fotografía de la imagen.
Resultados
Principalmente se preparó el gel de
agarosa siguiendo los pasos estipulados
en la metodología del práctico.
Fig. 3 Preparación de la cámara de
electroforesis.
Se mezcla nuestra muestra de material
Fig. 1 Preparación de las soluciones.
genético de 5 microlitros con sample
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loading buffer de la misma medida con Una vez este se dejó por un tiempo
ayuda de una micropipeta, y este se prolongado, se observa como las
introduce a los canales previamente muestras de material genético avanzaron
hechos en el gel de agarosa, siendo un uniformemente por el gel de agarosa.
total de 6 muestras las cuales se
completan con un RF el cual es una
mezcla de proteínas de peso molecular
conocido que nos sirven como patrón.
Fig. 6 Recorrido de la muestra.
Para finalizar en este se puede observar
como solo dos de las seis muestras de
material genético no se habían
degradado, pudiendo compararse con la
Fig. 4 muestras del material genético con muestra patrón ya mencionada con
una muestra patrón. anterioridad.
Se agregan los electrodos y se conecta la
cámara de electroforesis mediante los
ánodos y cátodos, a un voltaje de 20
voltios.
Fig. 7 Muestra del material genético.
Fig. 5 cámara de electroforesis armada.
Análisis de resultados
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El primer paso es quitarle la piel a los La electroforesis es muy útil para la
chiles. Para ello, se colocan los poblanos separación tanto de proteínas como de
directos al fuego, deben quedar de ADN y ARN, en el ámbito clínico nos
aspecto quemado por todos lados. Se puede servir para medir la cantidad de
colocan dentro de una bolsa de polietileno anticuerpos en la sangre y puede detectar
para que suden, por una media hora. un anticuerpo monoclonal. Así como se
Luego, con ayuda de un paño, se procede utiliza para identificar la presencia de
a rasparlo para retirarles la piel. Se proteínas anómalas, para identificar si
termina este proceso bajo el chorro de falta alguna de las proteínas normales y
agua y tallando con las manos para determinar si diferentes grupos de
delicadamente. Hacerles un corte proteínas en sangre están aumentados o
longitudinal para extraer las semillas (bajo disminuidos. Esta técnica también nos
el chorro de agua). Escurrirlos y permite ver el tamaño de los diferentes
rellenarlos de queso. Reservar. tamaños de ADN en la muestra
Elaboración del caldillo: Asar los jitomates comparándolos con una muestra estándar
(tomates) con el trozo de cebolla y el ajo. con tamaño conocido.
Licuar y colarlos. En una olla, colocar un
chorrito de aceite y sazonar esta salsa por
10 minutos a fuego bajo. Agregar 3 Referencias
cucharadas de pan molido, mezclar,
agregar el caldo de pollo y hervir por 15 Khan Academy. (2021). Retrieved August
minutos a fuego medio/bajo revolviendo 28, 2021, from Khanacademy.org website:
ocasionalmente. Reservar. Para capear https://es.khanacademy.org/science/ap-bi
los chiles: Batir las claras a punto de ology/gene-expression-and-regulation/biot
nieve, agregar una a una las yemas y echnology/a/gel-electrophoresis
batir unos minutos más. Pasar los chiles
ya rellenos de queso por la harina, luego National Human Genome Research
por el huevo batido y freírlos en una Institud. (2021). Retrieved August 28,
sartén con aceite caliente. Voltearlos para 2021, from Genome.gov website:
freir de todos lados. Escurrir sobre papel https://www.genome.gov/genetics-glossar
de cocina. Sumergir los chiles ya y/Electrophoresis
capeados en el caldo de tomate, hervir
Electroforesis | Biología molecular.
dos minutos y servir bañado en la salsa.
Fundamentos y aplicaciones en las
La electroforesis en gel de agarosa es de ciencias de la salud | AccessMedicina |
las más utilizadas para analizar y McGraw Hill Medical. (2013). Retrieved
caracterizar ácidos nucleicos de distintas August 28, 2021, from Mhmedical.com
procedencias. Los geles se comportan website:
como un tamiz molecular y permiten https://accessmedicina.mhmedical.com/co
separar moléculas cargadas en función de ntent.aspx?bookid=1473§ionid=10274377
su tamaño y forma. 1
Conclusión
