DETERMINACIÓN DE VITAMINA C EN MUESTRAS BIOLÓGICAS
OBJETIVO: Determinar cuantitativamente el contenido de ácido PROCEDIMIENTO.
ascórbico en el zumo de frutas o en verduras, mediante el método
de Mohr. Cada grupo de laboratorio traerá una fruta cítrica, una fruta no
cítrica y una verdura. (Verduras = perejil, espinaca, acelga,
INTRODUCCIÓN. La vitamina C es esencial para la formación del pimentón rojo, ají, brócoli; Frutas cítricas= naranja, tangelo, toronja,
tejido conectivo, como es el caso de los huesos, cartílagos y la mandarina, lima (No traer limón); Frutas no cítricas = fresas,
dentina. La vitamina C también estimula las funciones de defensa uchuvas, kiwi, guayaba, tomate de guiso)
del organismo. Además, el ácido ascórbico es un buen reductor y NOTA. Los grupos deben ponerse de acuerdo para no repetir frutas
esta es una de las funciones que lo catalogan como uno de los ni verduras. Las frutas y las verduras deben estar lo más frescas
mejores antioxidantes con que cuenta el organismo. Su forma posible. Traer también un cuchillo pequeño y sus jeringas
oxidada, el ácido dehidroascórbico, se puede reducir nuevamente pipeteadoras)
por acción de reductores como el glutatión reducido (GSH).
Preparación de la muestra:
En las fuentes vegetales, el ácido ascórbico se puede hallar en
formas libres o combinadas (ascorbígenos) a partir de las cuales
puede ser cuantificado. Para obtener la muestra biológica proceda de la siguiente
manera:
MATERIALES Y REACTIVOS.
En el caso de las frutas cítricas se toma 1 ml de jugo y luego
Instrumental: Balanza, centrífuga, espectrofotómetro. se agregan 4 ml de ácido oxálico al 0.15%, se mezcla bien y
Materiales: Mortero con su mango, embudo de vidrio, papel se filtra. El filtrado (D1) se conserva para realizar la
de filtro. determinación colorimétrica.
Muestras biológicas: Frutas o verduras (concertarlo con el
profesor) Para otras frutas y verduras se pesa 1g de la muestra, la cual
se macera en un mortero, lo mas exhaustivamente posible,
Reactivos: con 4 ml de solución de ácido oxálico al 0.15%. Después de
filtrar se completa el filtrado con ácido oxálico al 0.15% hasta
o-nitroanilina al 0.16% en ácido acético-HCl. Se disuelven un volumen final de 5 ml. De allí se toma 1 ml de cada
80 mg de o-nitroanilina en 4 ml de ácido acético glacial y se extracto para los tubos D2 (fruta no cítrica) y D3 (verdura).
diluye la solución a 50 ml con ácido clorhídrico al 10%
Ácido oxálico al 0.15% Si cualquiera de los extractos exhibe demasiada coloración se
Carbón activado recomienda adicionar una pequeña cantidad de carbón
Nitrito de sodio al 0.08% (preparar fresco!) activado (aproximadamente 0.5 g por cada 5 ml de extracto
Etanol al 96% coloreado), se agita y luego se filtra. Se utiliza el
Solución patrón de vitamina C al 0.02% en ácido oxálico al sobrenadante y el residuo se desecha.
0.15% (Recién preparada)
Hidróxido de sodio al 10% Curva de calibración:
Rotule 10 tubos de ensayo así: B, 1, 2, ..6, D1, D2, D3 y
agregue en su orden los reactivos tal y como se indica en la
siguiente tabla:
Reactivos Tubo Tubo Tubo Tubo Tubo Tubo Tubo Tubo Tubo Tubo
(ml) B 1 2 3 4 5 6 D1 D2 D3
o-nitroanilina 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
Nitrito de sodio 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
Mezcle bien y espere a que se decolore. Si en 5 minutos no ocurre decoración agregue
otros 0.1 ml de nitrito de sodio y descuente este volumen del agua destilada que se
agregará posteriormente.
Etanol al 96% 3.8 3.8 3.8 3.8 3.8 3.8 3.8 3.8 3.8 3.8
Patrón de vitamina C 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
Ácido oxálico 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2
EXTRACTO 1.0 1.0 1.0
Mezcle bien y deje en reposo durante 5 minutos
NaOH 10% 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2
Agua destilada 3.8 3.8 3.8 3.8 3.8 3.8 3.8 3.8 3.8 3.8
Mezcle bien el contenido de cada tubo y páselo a una celda del espectrofotómetro. Utilizando el tubo B como blanco se lee la
absorbancia de cada tubo a una longitud de onda de 540 nm.
CUESTIONARIO.
1. ¿Por qué razón no se recomienda utilizar tejidos de origen animal en el desarrollo de esta práctica?
2. ¿Cuál es el papel que desempeña la vitamina C en los organismos vivos?
3. Construya una curva de calibración con los valores de absorbancia obtenidos para los 6 tubos correspondientes a las soluciones de los patrones de vitamina
C
4. Utilizando la curva de calibración obtenida, determine el contenido de ésta vitamina en las muestras utilizadas, expresado en miligramos de vitamina C por g
de muestra sólida (mg/g) y en mg/ml en las muestras líquidas.
5. Cuál de las muestras vegetales tuvo el mayor contenido de vitamina C?. ¿Está acorde este resultado con la literatura? Si no lo está explique la razón de la
diferencia.
6. Entre las muestras que se puede utilizar en esta práctica se encuentran frutas cítricas, frutas no cítricas y verduras. En cual de eso tipos de materiales
vegetales se espera encontrar un mayor contenido de vitamina C.
7. ¿Qué factores influyen en el contenido que se obtenga de vitamina C en frutas y verduras?
8. ¿Por qué razón entre las frutas cítricas sugeridas en esta práctica no se recomienda utilizar el limón, si se sabe que tiene un alto contenido de vitamina C?
9. ¿Cuál es el fundamento del método de Mohr para determinar el contenido de vitamina C?
RESPUESTAS
7. La vitamina c o acido L-ascórbico, es una vitamina esencial y un importante agente antioxidante
hidrosoluble, que se sintetiza químicamente a partir de la glucosa mediante una serie de reacciones
enzimáticas.
Entre las diferentes propiedades del ácido ascórbico cabe mencionar su capacidad de absorber radiación
ultravioleta y evitar el daño fotoquímica en órganos expuestos, como la vista.
los factores Para la determinación de la cantidad de ácido ascórbico en muertas biológica, se toma en cuenta el
1 ml de jugo de fruta acida, 1 gr del vegetal y 1 gr de la fruta no acida, se tiene en cuenta también como factor
importante la maceración de la muestra de la fruta no acida y la muestra vegetal.
luego se procedió a agregar acido oxálico el cual es uno de los principales metabólicos del ácido ascórbico es
decir que la vitamina c es desechada del cuerpo en forma de este acido, después se realizan varios procesos de
filtrado para purificar la muestra, por último, se agregan varios tipos de reactivos y se mide su concentración
de vitamina c en un espectrofotómetro.
8. La vitamina C se encuentra principalmente en alimentos de origen vegetal y puede presentarse en
dos formas químicas interconvertibles: ácido ascórbico (forma reducida) y ácido dehidroascórbico (forma
oxidada), siendo ambas formas funcionales biológicamente y manteniéndose en equilibrio fisiológico. el limón
no es una fruta útil para este tipo de prácticas porque tiene la forma reducida del ácido ascórbico. La Oxidada
se trasmite de mejor manera a través de la glucosa y la glucosa es azúcar entonces el limón tiene poca
presencia de glucosa y no puede transportar bien la vitamina c.
9
Para la determinación de esta vitamina se utiliza un método conocido como el método de Mohr, el cual
consiste en un proceso de doble precipitación en donde se presenta la formación de un primer solido, que es la
especie a cuantificar, y alcanzado el punto estequiometrico se forma otro precipitado que corresponde a la
especie que señala el punto final de la valoración, este en un método espectrofotométrico, es decir que se basa
en la absorción de radiación ultravioleta y visible por el analito, como consecuencia de lo cual se origina un
estado activado que posteriormente elimina su exceso de energía en forma de calor El la determinación del
acido ascórbico el método de Mohr funciona de la siguiente manera: el acido ascórbico presenta un máximo de
absorción a 260 nm, en este se utiliza como reactivo principal la 2 –nitroanilina, y cuyo máximo de absorción
se lee a 540 nm, para la determinación de la vitamina c total se precisa la conversión del acido ascórbico en
deshidro-ascorbico. Es relativamente específico y aceptable.
