Cromatografia Líquida

Cromatografía Líquida

Instrumental II
Cromatografía Líquida de
Alta Eficiencia (HPLC)

Fase móvil líquida

Alta presión (> 1000 psi)

Fase estacionaria sólida

 Cromatografía Líquida - Aplicaciones

GENERAL: separación y análisis de mezclas de compuestos

no volátiles o termo-inestables

EJEMPLOS: → Química ambiental

→ Química forense
→ Petroquímica
→ Bioquímica
→ Cosméticos
→ Fármacos
% cresciente en las técnicas analíticas

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 Cromatografía Líquida
Teória Básica

Sim importancia
en CG, pero con
gran importancia
SOLUTO en CLAE

FASE MÓVIL

⇌ FASE ESTACIONARIA

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 Cromatografía Líquida
Teoría Básica

El parámetro directamente medible en la retención de un analito es el

TIEMPO DE RETENCIÓN CORREJIDO, tR’

tR’ = tR - tM
SINAL

tM

TEMPO

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 Cromatografía Líquida
Cuantificación de la Eficiencia
Columna como una serie de etapas separadas donde ocurre el equilibrio del
analito entre la FE y la FM.

Cada “etapa” de equilibrio es conocido

como PLATO TEÓRICO

tR

wb
N Columna más eficiente

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 Teoría Básica- Cromatografía Líquida
Resolución

RESOLUCIÓN Rs entre dos picos

adjacentes

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 Cromatografía Líquida

ANÁLISIS QUÍMICO

columna

detector registrador

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 Cromatografía Líquida

columna
registrador

señal analítico

detector
tiempo
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 Cromatografía Líquida - CLAE

Aplicabilidad

Cuáles mesclas pueden ser

separadas por CLAE ?

para una sustancia cualquiera pueda ser “arrastrada” por un líquido

ella debe disolverse en ese líquido.

Líquidos y sólidos, iónicos o covalentes, con masa molar de

32 hasta 4.000.000.

DE FORMA GENERAL:
CL es aplicable para separaciones y análisis de mezclas cuyos
constituyentes sean solubles en la FM. No hay limitación de volatilidad o de
estabilidad térmica.
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 Cromatografía Líquida
Aumento de polaridad
Insoluble en agua Soluble en água
Apolar Iónico
Polar no iónico

Partición
Tipos y 102
Partición Partición Inter.
Aplicaciones de la Adsorciónen fase en fase
103 reversa
iónico
normal
Masa molecular
Cromatografía
104
Líquida
Permeación Filtración
en gel Exclusión en gel
105

106

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 Instrumentación

Mezclador Horno Detector

Columna
Inyector
Bomba

Procesador

▪ Una bomba puede ser usada para controlar

Fase móvil hasta cuatro reservorios;

▪ La mezcla es hecha antes del bombeo.

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Instrumentación

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 Fase móvil para CLAE

Solvente puros o mesclas de solventes de acuerdo con la polaridad

requerida en la separación.

• Elución isocrática:
• Cuando la separación es hecha utilizando un único solvente de
composición constante

• Eluición con gradiente:

• Son utilizado dos o tres sistemas de solventes que difieren bastante
entre si en polaridad.
• Después que la elución comienza, la rata entre los solventes es
variada de modo programado, de forma continua o en pasos.

A elución con gradiente produce efectos similares a los producidos por la

programación de temperatura en GC.

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Elución con gradiente
Columna C18, 5 mm, fase reversa
Detector fluorescencia: excit. 334 nm – emis. 425 nm

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 Separación isocrática de alta velocidad

Columna de - 4 cm de Largo
alta velocidad - 0,4 cm d.i. 100.000 platos/metro
y alta eficiencia - FE: spherisorb 3 mm
FM: 4,1% EtAc em n-Hexano

1– p-xileno
2- anisol
3- acetato de benzila
4- dioctil-ftalato
5- dipentil-ftalato
6- dibutil-ftalato
7- dipropil-ftalato
8- dietil-ftalato

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 Classificación de la Fase Móvel

✓Elevado grado de pureza;

✓Disolver la muestra sin descomponer los analitos;

✓No descomponer o disolver la fase estacionaria;

✓Baja viscosidad;

✓Compatible con el detector;

✓Polaridad adecuada;

✓El agua debe ser grado HPLC (MiliQ).

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Columnas para CLAE

•Remoción de material particulado

Pre- columna
•Contaminantes del solvente
•Contaminantes de la muestra

Aumenta la vida útil de la columna

COLUMNAS TÍPICAS
•Material: acero inox
•Largo: 10 a 30 cm
•Diámetro: 4 a 10 mm
•FE: Partículas de 5 a 10 mm
•Eficiencia: 40 mil a 60 mil
platos/metro
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 Fase estacionaria para CLAE

Basicamente son dos tipos de FE:

• Pelicular:
• Consiste de base de polímero o vidrio no-poroso, esférico, con diámetros
típicos del orden de 30 a 40 mm, recubierto con una capa fina e porosa de:
• Sílice
• Alúmina
• Resina de poliestireno-divinil-benzeno
• Resina intercambiadora de iones
• Partícula porosa:
• Consiste de micropartículas porosas con diámetros de 3 a 10 mm. Las
partículas son constituidas de los mismos materiales del recubrimiento pelicular.

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Fase Estacionaria modificada

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Fase Estacionaria modificada

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 Fase Estacionaria modificada – C18

Si-OH + ClSi R Si-O-R + HCl

Tipo Grupo unido

Octadecil
Apolar Octil
Metil

Fenil
Polaridad Media Éter
Alquilnitrila

Aminonitrila
Polaridad Alta Poliamida
Alquilamina

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 Modo de Separación

▪ Normal

▪ Reversa

▪ Intercambio iónico

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 Cromatografia Líquida
Modo de Separación

Fase Normal Fase Estacionaria Polar

Fase Móvil Apolar

Fase Reversa Fase Estacionaria Apolar

Fase Móvil Polar

Fase
Móvil

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 Modo de Separación

FASE NORMAL

MECANISMO DE INTERACIÓN

ADSORCIÓN

▪ Fase estacionaria: más POLAR que la fase móvil

▪ Fase móvil: mezcla de solventes orgánicos (hexano, diclorometano)

Columnas: Sílica, ciano, fenil, amino

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 Modo de Separación

FASE REVERSA

INTERACIÓN DE LA PARTE NO POLAR DEL

ANALITO Y LA FASE ESTACIONARIA

HIDROFOBICIDAD

▪ Fase estacionaria: APOLAR

▪ Fase móvil: H2O, MeOH, CH3CN

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Tiempo de Retención e Hidrofobicidad

OH

C18 (ODS)
Interación
débil

fuerte
OH

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Tiempo de Retención e Hidrofobicidad

C8

media
C18 (ODS)

Muestra

fuerte
C4

Muestra

débil

Muestra

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 Tiempo de Retención e Hidrofobicidad

◆ Si la muestra posee
❖ CH3CH2CH2--- : cadena de carbonos
La hidrofobicidad será
❖ : grupo aromático fuerte

◆ Si la muestra posee
❖ -COOH : grupo carboxílico
La hidrofobicidad será
❖ -NH2 : grupo amino
débil
❖ -OH : grupo hidróxilo

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 Análisis Químico

ANÁLISIS CUALITATIVO

Tiempo de retención (tr)

- Comparación con valores de tr tabulados

- Comparación con estándar inyectado

- Adición de estándar

- Aplicaciones de métodos instrumentales después de la

separación

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 Análisis Químico

ANÁLISIS CUANTITATIVO

Área  Concentración

- Curva de Calibración

- Adición de estándar

- Patrón Interno

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 Análisis cuantitativo
El parámetro directamente relacionado a la cantidad de analito es:

• Altura de la banda cromatográfica: no recomendado, pues la banda necesita ser

perfectamente simétrica.
• Área de la banda cromatográfica.
SEÑAL

Área Altura

TIEMPO

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 Curva de Calibración

Área
Muestra

Concentración

tiempo
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 Adición de Patrón

concentración

Área
en la muestra

Muestra

Concentración Adicionada

tiempo
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 Patrón Interno/Externo

patrón
pico de externo
interés
patrón interno

Utilización de la relación
Área del analito
Área del PI

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Patrón Interno/Externo

Área del analito

Área del PI
Concentración

tiempo
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