UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA

FACULTAD DE CIENCIAS

LABORATORIO DE BIOQUÍMICA (2015585)

FORMATO DE INFORME DE LABORATORIO

PRÁCTICA: Extracción y Análisis de ácidos nucléicos

DOCENTES: Edgar Antonio Reyes Montanoy Luis Ernesto Contreras Rodriguez
ESTUDIANTES: Camilo Andres Rico Cortesy Danna Nataly Garzon Polania

OBJETIVOS:

- Comprender algunas propiedades de los ácidos nucleicos y aprovecharlas para su extracción,

cuantificación y análisis.
- Extraer ADN a partir de levadura
- Cuantificar el ADN por espectrofotometría
- Identificar el efecto hipercrómico debido a la temperatura
- Reconocer el corrido electroforético del ADN extraído y un plásmido de ADN digerido

CONTEXTO: Defina los siguientes conceptos:

Ácidos nucleicos (Estructura y clasificación) Ácidos nucleicos (Funciones)
Existen dos tipos de ácidos nucleicos, los ácidos La función primordial de los ácidos nucleicos es
ribonucleicos (ARN) y los desoxirribonucleicos (ADN) almacenar y transmitir la información genética,
que se encuentran en todos los tipos celulares tanto proceso que es la base para poder mantener la
animales como vegetales o bacterias, solamente los virus identidad de los organismos, sus características como
carecen de los dos, disponiendo bien de ADN o de ARN. especie, y las variaciones entre los individuos de la
La estructura primaria consiste en la secuencia de misma especie. Existen dos tipos de ácidos nucleicos,
nucleótidos de la cadena polinucleotídica y se los ácidos ribonucleicos (ARN) y los
caracteriza por estar formada por desoxirribonucleicos (ADN) que se encuentran en
todos los tipos celulares tanto animales como vegetales
desoxirribonucleótidos, cuyas bases son A, G, C y T. En
o bacterias, solamente los virus carecen de los dos,
los trabajos de Chargaff, se había mostrado la relación
disponiendo bien de ADN o de ARN. La información
que existía, próxima a la unidad, entre el número de genética de todas las células de un organismo se
bases púricas y el de pirimidínicas. encuentra almacenada en el genoma o conjunto de
Las moléculas de ADN presentan diferentes tamaños genes, que en el caso de las células eucariotas se sitúa
dependiendo de la célula u organismo del que procedan. en el núcleo celular. El segmento de ADN que contiene
Normalmente el tamaño del ADN se expresa en el la información necesaria para la síntesis de un producto
número de pares de bases, y debido a los valores tan biológico funcional, proteína o ARN, se denomina gen.
elevados que aparecen, se utiliza una unidad que es la Cualquier célula normal de los organismos
kilobase que corresponde a 1000 pares de bases, así una pluricelulares tiene miles de genes, dependiendo de la
molécula de ADN de Escherichia coli tiene 4200 utilización parcializada de toda esta información, es
kilobases, y una longitud que sería de 1 mm., superior al posible la diferenciación de células y tejidos para
tamaño de la bacteria, lo que implica que la molécula conseguir la estructura adecuada y el desarrollo de las
debe encontrarse empaquetada para ocupar el menor funciones correspondientes. Desde el punto de vista
espacio posible. químico, los ácidos nucleicos son polímeros lineales de
Richard Wheeler (Zephyris)) La estructura secundaria una unidad básica: el nucleótido. Repetida multitud de
del ADN fue establecida por Watson y Crick en 1953, a veces da lugar a unas moléculas cuyo estudio, siendo
partir de varios estudios previos en los que se había relativamente reciente si lo comparamos con el resto de
cuantificado las proporciones entre las bases biomoléculas orgánicas, ocupa una buena parte del
nitrogenadas y se habían realizado medidas entre las amplio campo de conocimientos de la biología
posiciones de los átomos mediante difracción de rayos molecular ( Perez,[Sf])
X. Los postulados de este modelo son:
1) La forma más habitual de la molécula de ADN es una
estructura de doble hélice, formada por dos cadenas
polinucleótidicas enrolladas en forma espiral sobre un
eje longitudinal imaginario.
2) Las dos cadenas se sitúan en sentido antiparalelo, sus
extremos no son coincidentes, la dirección de una
cadena se dice que es 5' a 3' y la paralela 3' a 5'.
3) En el exterior quedan los esqueletos de las cadenas
(pentosas-grupos fosfato) y hacia el centro,
perpendicularmente al eje, se colocan las bases.
4) Las cadenas se mantienen unidas mediante puentes
de hidrógeno establecidos entre las bases nitrogenadas.
La unión entre las bases sigue el principio de
complementariedad, una base púrica se enlaza con una
base pirimidínica, en concreto la adenina con la timina a
través de dos puentes de hidrógeno y la guanina con la
citosina.a través de tres puentes, manteniendo constante
la anchura de la hélice, unos 20 Aº.
5) La hélice es dextrógira, gira sobre su eje mayor hacia
la derecha, siendo el paso de rosca de la hélice de 34 Aº,
que corresponde a 10 nucleótidos o 10 pares de bases,
separadas 3,4 Aº medido a lo largo del eje de la hélice.
6) La hélice presenta dos surcos de distinta anchura, el
surco mayor y el menor

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Figura 1. Estructura secundaria del ADN
La estructura descrita corresponde a la forma
denominada B-ADN o de Watson y Crick, la forma
mayoritaria en condiciones fisiológicas. Se han descrito
también otras estructuras que posiblemente
corresponden a cambios de conformación cuando se
desarrollan algunas de las funciones de la molécula. La
flexibilidad de la hélice permite estos cambios de forma,
proporcionando una idea del dinamismo y la capacidad
de modificación que presenta el ADN.
La estructura terciaria de la molécula de ADN puede en
una primera aproximación, adoptar dos tipos, el ADN
circular (ADN bacteriano, vírico o mitocondrial) en el
que los extremos de las cadenas están unidos; o bien, el
ADN lineal, mayoritario en células eucariotas, con
extremos libres. Tanto uno como otro experimentan
plegamientos para formar estructuras más compactas (
Perez,[Sf]).

Efecto hipercrómico Cuantificación de ácidos nucleicos

Las soluciones de ADN nativo cuidadosamente aislado La electroforesis de ADN es similar a la de las
son altamente viscosas a pH 7,0 y temperatura ambiente proteínas, se puede usar poliacrilamida como matriz
(25 ° C). Cuando tal solución está sujeta a extremos de gel en cadenas cortas de ADN( hasta unos pocos
pH o a temperaturas superiores a 80 C, su viscosidad cientos de nucleótidos), la agarosa es generalmente
disminuye drásticamente, indicando que el ADN se ha usada para cadenas más largas de ADN (Lehninger, A.
sometido a un cambio. Así como el calor y los extremos L. y al et., 2005).
de pH desnaturalizan las proteínas globulares, también
causan desnaturalización o fusión de ADN de doble Tanto en la secuenciación de Sanger como en la de
hélice. Ruptura de enlaces de hidrógeno entre bases Maxam-Gilbert, el principio general es reducir el ADN
emparejadas y de apilamiento de bases causa el a cuatro conjuntos de fragmentos marcados. La

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desenrollado de la doble hélice para formar dos hebras reacción que produce cada conjunto es base-específica,
simples,completamente separadas entre sí a lo largo de por lo que las longitudes de los fragmentos
toda la longitud o parte de la longitud parcial de la corresponden a posiciones en la secuencia de ADN
molécula( Desnaturalización parcial). Enlaces no donde una determinada base ocurre. Por ejemplo, para
covalentes en el ADN se rompen (Lehninger, A. L. y al un oligonucleótido con la secuencia pAATCGACT,
et., 2005). marcado en el extremo 5´(el extremo izquierdo), una
reacción que rompe el ADN después de cada residuo C
La renaturalización de una molécula de ADN es un genera dos fragmentos marcados: uno de cuatro
proceso rápido y de un solo paso, siempre que un nucleótidos y un fragmento de siete nucleótidos; una
segmento de doble helice de una docena de residuos o reacción que rompe el ADN después de cada G
más estén unidos a las dos hebras. Cuando la producirá sólo un fragmento de cinco nucleótidos
temperatura o el pH retornan al rango en el que la marcado. Debido a que los fragmentos están marcados
mayoria de los organismos viven, los segmentos radiactivamente en sus 5´extremos, sólo el fragmento
desenrollados de las dos hebras se vuelven a enrollar se visualiza en el lado 5´ de la rotura. Los tamaños de
(Lehninger, A. L. y al et., 2005). los fragmentos corresponden a las posiciones relativas
de los residuos C y G en la secuencia (Lehninger, A. L.
La estrecha relación entre las bases apiladas de un ácido y al et., 2005).
nucléico tiene el efecto de disminuir la absorción de luz Cuando los conjuntos de fragmentos correspondientes
ultravioleta en relación a una solución con la misma a cada una de las cuatro bases están
concentración de nucleótidos libres, y la absorción electroforeticamente separadas una al lado de la otra,
decrece aún más cuando dos hebras complementarias de producen una escalera de bandas las cuales se pueden
ácidos nucleicos están emparejadas. Esto es llamado el leer directamente (Lehninger, A. L. y al et., 2005).
efecto hipocrómico, desnaturalización del ADN produce
el efecto contrario el efecto hipercrómico ( aumento en
la absorción) (Lehninger, A. L. y al et., 2005).

La transición del ADN de doble hebra al monocatenario

se puede seguir controlando la absorción de luz
ultravioleta (Lehninger, A. L. y al et., 2005).

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 DATOS Y CÁLCULOS: Complete la siguiente tabla de datos para el análisis de la solución Stock de ADN:
A260/A280
Volumen (mL) Absorbancia 260 nm Absorbancia 280 nm
17 1,223 0,605 2,021
Calcular la concentración y masa total de ADN obtenido:

61,15± 0,05 μg/mL y 1039,5 ± 0,1 μg

Efecto hipercrómico por pH.

pH 8.5 pH 9.5 pH 10.5 pH 11.5 pH 12.5
Absorbancia 260
0,751 0,755 0,757 0,795 0,776
nm
Graficar curva Abs 260 nm -vs- pH

Gráfica 1. efecto hipercrómico en la muestra de ADN de Saccharomyces cerevisiae por efecto del pH

Efecto hipercrómico por temperatura.

20ºC 37ºC 60ºC 80ºC 90ºC

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Absorbancia 260
0,820 0,840 0,960 0,792 0,889
nm
Graficar curva Abs 260 nm -vs- Temperatura

Gráfica 2. efecto hipercrómico en la muestra de ADN de Saccharomyces cerevisiae por efecto de la temperatura

Análisis por electroforesis del ADN extraído (solución Stock) y del ADN digerido
Indique el gel de electroforesis virtual para la digestión del Indique el gel de electroforesis real, los marcadores de peso
plásmido de ADN molecular (PM) y el orden de siembra

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 Figura 3. Electroforesis real en gel de agarosa

Figura 2. Electroforesis virtual para la digestión del

plásmido de ADN

DISCUSIÓN: Interpretar los resultados obtenidos.

La extracción del ADN de Saccharomyces cerevisiae consistió en la ruptura de la pared celular con disrupción
física por medio de arena y un mortero frío. Posterior a ello, se realizaron varios procedimientos que permitan
purificar el ADN objetivo, en primer lugar fue usada una solución salina de ácido etilendiamino tetraacético
(EDTA), ácido que en su forma desprotonada (2- y 4-) es un agente quelante de cationes divalentes, como Mg2+,
que es un importante cofactor requerido por la mayoría de nucleasas, ello hace que el ADN no sea degradado por
la acción de estas enzimas.

Con el uso del dodecilsulfato sódico (Sodium Dodecyl Sulphate, SDS, laurilsulfato sódico) se desnaturaliza las
proteínas que están en la mezcla de extracción de la Saccharomyces cerevisiae. El SDS es un detergente aniónico
que se une a las proteínas, desnaturalizándolas en una conformación extendida recubierta de moléculas de SDS.
Como consecuencia, el tamaño de la molécula de proteína es directamente proporcional a su longitud en
aminoácidos y su carga queda enmascarada por la mayor carga del SDS que la recubre.

Los grupos fosfato están cargados negativamente y son polares, lo que le confiere al ADN una carga neta negativa
y lo hace altamente polar, características que son aprovechadas para su extracción. Los grupos fosfato tienen una

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fuerte tendencia a repelerse, debido a su carga negativa, lo que permite disolver al ADN en soluciones acuosas y
formar una capa hidratante alrededor de la molécula. Por ello, es añadido el perclorato de potasio el cual añade
cationes al medio que se unen a las cargas negativas del ADN generando que este no sea mojado.

La adición de cloroformo y alcohol isoamílico permite la separación de los ácidos nucleicos que se encontraran en
la fase acuosa. En la interfase estarán contenidas las proteínas desnaturalizadas y los carbohidratos contaminantes
y en la fase orgánica se hallaran los lípidos de membrana, inhibidores y otros contaminantes. El cloroformo va a
eliminar trazas de fenol y desnaturaliza las nucleasas y el alcohol isoamílico reduce la formación de espuma y
facilita la formación de las fases (Gutiérrez G, 2021).

Finalmente, en presencia de etanol se rompe la capa hidratante y quedan expuestos los grupos fosfatos. Bajo estas
condiciones se favorece la unión con cationes como Na+ que reducen las fuerzas repulsivas entre las cadenas de
nucleótidos y permiten que el ADN precipite (Sambrook et al. 1989).

La estabilidad de la estructura secundaria del ADN de la Saccharomyces cerevisiae se evaluó a partir del efecto
hipercrómico como se observa en las gráficas 1 y 2, por efecto del cambio de pH y de la temperatura. Este efecto
ocurre debido a la desnaturalización del ADN por calor, también llamada fusión. La desnaturalización hace que la
estructura de doble hélice se desenrolle para formar ADN monocatenario. Cuando el ADN en solución se calienta
por encima de su temperatura de fusión (generalmente más de 80 oC), el ADN bicatenario se desenrolla para
formar ADN monocatenario. Las bases se desapilan y, por lo tanto, pueden absorber más luz. En su estado nativo,
las bases del ADN absorben luz en la región de longitud de onda de 260 nm. Cuando las bases se desapilan, la
longitud de onda de la absorbancia máxima no cambia, pero la cantidad absorbida aumenta en un 30-40%
(Contreras-Moreira,B., 2018).

La hipercromicidad se puede utilizar para rastrear el estado del ADN a medida que cambia la temperatura. La
temperatura de transición / fusión (T m ) es la temperatura en la que la absorbancia de la luz ultravioleta es del 50%
entre el máximo y el mínimo, es decir, donde el 50% del ADN está desnaturalizado (Contreras-Moreira,B., 2018).

La Tm de los ácidos nucleicos es proporcional al contenido en bases GC de su secuencia, ya que estos pares de
bases establecen entre sí 3 enlaces de hidrógeno, mientras que los AT/AU sólo 2. Si la temperatura supera Tm, las
moléculas de ADN se separan en dos hebras polinucleotídicas (como se muestra en la figura 3), pero si se baja
lentamente ambas hebras vuelven a unirse de forma complementaria en una reacción llamada hibridación la cual es
posible para algunas proteínas pequeñas (Contreras-Moreira,B., 2018).

Con respecto a la especie Saccharomyces cerevisiae el contenido de GC es del 38% según se reporta en la
literatura, este es el responsable de estabilizar la estructura, a medida que se aumenta la temperatura la absorbancia
va aumentando hasta que llega a un punto máximo y esta empieza a descender. Los datos experimentales no
muestran la tendencia esperada pues hay una súbita disminución de la absorbancia a 80 °C y luego vuelve a subir
en 90°C, una situación que pudo relacionarse con posibles contaminantes en el tubo de ensayo usado.

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 Figura 4. Desnaturalización y renaturación del ADN (Hernandez L., et al., 2012)

A excepción de este punto anómalo, las medidas permiten observar el efecto hipercrómico en la muestra de
ADN de la Saccharomyces cerevisiae debido a la modificación de la temperatura, con respecto al pH el efecto
puede verse respecto a la desnaturalización como aumenta gradualmente la absorbancia.

ENZIMA DE DIGESTIÓN KnpI

El sistema KpnI R – M perteneciente a las REasas tipo IIP reconoce la secuencia palindrómica bicatenaria . KpnI
REase cataliza la hidrólisis del enlace fosfodiéster entre dos citosinas dentro de la secuencia GGTACC, dejando un
saliente 3 'de cuatro bases ( Chandrashekaran, 2004).
La KpnI REase es capaz de discriminar el ADN que contiene una secuencia específica del que contiene una
secuencia inespecífica incluso en ausencia de cualquier ión metálico [Link] el contrario, la MTasa se une a
oligonucleótidos específicos y no específicos ( Chandrashekaran, 2004).
La mayoría de las REasas de tipo II funcionan como homodímeros que reconocen secuencias de ADN simétricas
no metiladas y catalizan la escisión simultánea de enlaces fosfodiéster en ambas cadenas de ADN. Las MTasas,
por otro lado, suelen actuar como monómeros, ya que su sustrato normal es el ADN hemimetilado (
Chandrashekaran, 2004).
Es por esto que la enzima endonucleasa KnpI usada para la digestión realiza la escisión del ADN en un solo punto
en 3923 bp, dando como resultado un fragmento con un peso de 6881 bp, según la electroforesis virtual ( Fig 2)
pero analizando el resultado de la electroforesis en gel de agarosa ( Fig 3) podemos ver que tal fragmento no se
evidencia, no se evidencia el corte de la enzima de restricción, ya que se presenta una banda por encima de las
10000 bp .

ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA

La electroforesis en gel de agarosa es la forma más eficaz de separar fragmentos de ADN de diferentes tamaños
que van desde 100 pb hasta 25 kb . La agarosa se aísla de los géneros de algas Gelidium y Gracilaria , y consta de
subunidades repetidas de agarobiosa (L- y D-galactosa) . Durante la gelificación, los polímeros de agarosa se
asocian de forma no covalente y forman una red de haces cuyos tamaños de poros determinan las propiedades de
tamizado molecular de un gel ( Yun Lee, 2012).

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Para separar el ADN mediante electroforesis en gel de agarosa, el ADN se carga en pocillos prefabricados en el gel
y se aplica una corriente. La columna vertebral de fosfato de la molécula de ADN (y ARN) está cargada
negativamente, por lo tanto, cuando se colocan en un campo eléctrico, los fragmentos de ADN migrarán al ánodo
cargado positivamente. Dado que el ADN tiene una relación masa / carga uniforme ( Yun Lee, 2012).
El modelo principal para el movimiento del ADN a través de un gel de agarosa es la "reptación sesgada", mediante
la cual el borde delantero se mueve hacia adelante y arrastra el resto de la molécula a lo largo . La velocidad de
migración de una molécula de ADN a través de un gel está determinada por lo siguiente: 1) tamaño de la molécula
de ADN; 2) concentración de agarosa; 3) conformación del ADN ; 4) voltaje aplicado, 5) presencia de colorante ,
6) tipo de agarosa y 7) tampón de electroforesis ( Yun Lee, 2012).

EtBr es el reactivo más común utilizado para teñir el ADN en geles de agarosa . Cuando se expone a la luz
ultravioleta, los electrones en el anillo aromático de la molécula de etidio se activan, lo que conduce a la liberación
de energía (luz) a medida que los electrones regresan al estado fundamental. EtBr actúa intercalando en la
molécula de ADN de una manera dependiente de la concentración. Esto permite una estimación de la cantidad de
ADN en cualquier banda de ADN en particular en función de su intensidad. Debido a su carga positiva, el uso de
EtBr reduce la tasa de migración del ADN en un 15%. EtBr es un mutágeno y carcinógeno sospechoso, por lo que
se debe tener cuidado al manipular geles de agarosa que lo contienen. Además, el EtBr se considera un residuo
peligroso y debe eliminarse de forma adecuada. Las tinciones alternativas para el ADN en geles de agarosa
incluyen SYBR Gold, SYBR green, Crystal Violet y Methyl Blue. De estos, el azul de metileno y el violeta cristal
no requieren la exposición del gel a la luz ultravioleta para visualizar las bandas de ADN, lo que reduce la
probabilidad de mutación si se desea recuperar el fragmento de ADN del gel. Sin embargo, sus sensibilidades son
más bajas que las de EtBr. El oro SYBR y el verde SYBR son tintes altamente sensibles y dependientes de los
rayos ultravioleta con menor toxicidad que el EtBr, pero son considerablemente más caros ( Yun Lee, 2012).

Figura [Link] de una electroforesis post-gel. Se añadió EtBr al gel antes de la electroforesis hasta una
concentración final de 0,5 µg / ml, seguido de separación a 100 V durante 1 hora. El gel se expuso a luz
ultravioleta y la fotografía se tomó con un sistema de documentación de gel.

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CONTAMINACIÓN DEL ADN

En cuanto a la electroforesis en gel de agarosa podemos observar bandas muy intensas y de una forma circular ,
que pueden estar debidas a la contaminación con ARN ( Fig 3) .
Según ( Cardinalli, 2001) la cantidad de ARN presente en células de levadura excede en gran medida el ADN, por
lo tanto, se requiere de la ayuda de enzimas de digestión, ensayos con varias combinaciones de RNasa A, B y T1
han demostrado que la máxima eficiencia se obtiene utilizando simultáneamente todas estas ribonucleasas, de
hecho la ausencia de una de las tres RNasas resultó en la presencia de ARN residual, esto también se debe a que en
el primer gel , las primeras muestras sembradas no estaban digeridas por la enzima KnpI , además también
sabemos que la enzima no tuvo el desempeño deseado.

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CONCLUSIONES

● A la temperatura de 60 ° C y pH 11,5 se observa la mayor desnaturalización probable de la muestra de

ADN de Saccharomyces cerevisiae y el mayor efecto hipercrómico.
● La enzima de restricción KnpI no realiza la escisión del ADN en 3923 pares de bases como era lo
esperado.
● El ADN extraído presenta contaminación con ARN, evidenciado en las bandas de la electroforesis en las
cuales se presenta una gran intensidad en la banda y una forma circular.

BIBLIOGRAFÍA

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pressure-driven DNA denaturation. PLoS ONE, 7(4):e33789. URL
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[Link] el 2 de octubre de 2021.

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[Link] el 3/10/2021.

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