Actividad de extensión: CUANTIFICACIÒN DE TIMOL POR CROMATOGRAFÍA LÌQUIDA DE
ALTA RESOLUCIÓN (HPLC) A PARTIR DE ESENCIA DE TOMILLO PATAGÓNICO (A.
seriphioides)
Cromatografía
La cromatografía es un método, usado para la separación de los componentes de una muestra en la
cual los componentes se distribuyen en dos fases, una estacionaria y otra móvil.
La fase estacionaria puede ser: un solido Liquido retenido en un solido
Figura 2. Silica gel contenida en distintos soportes. Figura 1. Fase estacionaria liquida, en distintos
soportes.
La fase móvil puede ser: O gaseosa:
Liquida: solventes de distinta polaridad
Figura 3. Gases utilizados como fase
Figura 4. Fases móviles comunes en móvil en cromatografía
cromatografía
De la combinación de estas es que se obtienen las distintas cromatografías, l-l, l-s, g-l
Introducción a la cromatografía liquida de alta resolución (HPLC).
La HPLC es un método versátil, sensible (permite el análisis trazas del componente a analizar), rápido
y que permite realizar análisis cuantitativos.
En la cromatografía liquida de alta resolución, la fase móvil
atraviesa la columna a presión elevada. Es necesario un
equipamiento especial, que consta de distintas partes, las
mismas se detallan a continuación. Actualmente los equipos
son modulares. Se arman de acuerdo a las necesidades y
como ventaja adicional presenta que pueden arreglarse
individualmente.
Figura 5. Cromatógrafos para cromatografía liquida de alta resolución
En la parte superior del equipo de encuentra el
reservorio de la fase móvil, se ubica encima de la
bomba. Cuenta con una bandeja en la cual se colocan
frascos/ botellas de vidrio. Las botellas tienen una tapa
adecuada que evite el ingreso de cualquier partícula, y
al menos un orificio que permite la entrada de la tubería
por la que circula la fase móvil (FM) y se conecta con la
bomba. En el extremo de la tubería tiene un filtro (buzo)
para evitar el paso se partículas.
Figura 6. Reservorios de fase movil
Las tuberías conectan el reservorio con la bomba, el
inyector, columna, detector/es, y colector de
desperdicios. Las mismas pueden ser de distintos
materiales y resistentes a altas presiones.
Las bombas impulsan la FM desde el reservorio al
inyector, su caudal de trabajo puede ser muy variable
de acuerdo a la escala de trabajo (0,1-10 ml/ min,
6000 psi). Existen dos tipos de bombas, las de pistón
y las de desplazamiento continuo (jeringas). Las de
pistón son las más utilizadas. Una bomba puede tener
más de un pistón y esto permite realizar mezclas de
FM en una corrida. En algunos casos se puede
observar en el cromatograma ruido. El mismo se debe
a las pulsaciones de las bombas reciprocantes y
Figura 7. Bomba de pistón, HPLC conducen a las variaciones en el caudal.
[mAU]
Las separaciones cromatográficas C:\ClarityChrom\Bench\astaxantina Marti\muestras\martes 221117\cascaras 2 11nov17 - S 2500: Channel 1
C:\ClarityChrom\Bench\astaxantina Marti\muestras\martes 221117\cascaras 2 11nov17 - S 2300: Channel 1
por HPLC pueden realizarse de dos 40
2
1,87 Peak 2,13 1
formas: por una lado manteniendo
3,37
30
constantes las condiciones
Absorbance
cromatográficas, que se denominan 20
isocraticas (flujo, FM, T° constantes).
Este tipo de separación es limitada, 10
3
6,52
pueden separarse entre 10-12 0
señales. La otra posibilidad es la
separación en gradiente, en este 0 2 4
Time
6 8 10
[min.]
caso la composición de la FM va
variando a lo largo de la corrida, se
comienza con un solvente débil en
mayor proporción y finaliza con mayor
proporción de un solvente fuerte. Esta
variación puede ser lineal, cóncava o
convexa o una mezcla de éstos. La
programación de solventes define la
fuerza de elución. La separación en
gradiente, permite separar un mayor
número de componentes, y
componentes cuya polaridad sea muy
diferente. En algunos cromatogramas
puede observarse esta información.
Figura 8. Cromatogramas obtenidos de una separación isocratica (superior), en gradiente (inferior).
El inyector es el dispositivo que permite el
ingreso de la muestra en solución a la
columna. El ingreso de la muestra no debe
interrumpir el caudal, debe ser preciso en
cuanto a la cantidad de muestra introducida en
el sistema, no debe provocar diluciones. Los
inyectores son válvulas que orientan el caudal
hacia la columna pasando o no según su
posición, a través de un loop (graduado) en el
cual se introduce la solución a inyectar. En
nuestro caso el inyector es manual pero los
hay automáticos.
Para realizar el llenado del loop el inyector
debe estar en la posición de carga, el loop se
llena parcial o totalmente con una jeringa. Una
vez realizada la inyección, se mueve el
inyector hacia la posición de descarga y de
esta manera se ingresa hacia la columna.
Figura 9. Inyector manual
El o los detectores son los que permiten “ver” y ubicar en tiempo y espacio a cada componente de una
mezcla. Los detectores deben tener ciertas características entre las que se encuentran: tener un
amplio rango dinámico de respuesta, es decir que permita el análisis de un amplio rango de
concentraciones de la sustancia que se está analizando y que un cambio de la concentración produzca
un cambio en la señal. Debe poseer una respuesta lineal. No contribuir al ensanchamiento de banda
extracolumnar (perdida de la eficiencia). Debe responder a todos los solutos, es decir se necesita un
instrumento capaz de discernir entre un líquido (FM) y un sólido disuelto. Debe tener la sensibilidad
apropiada, no afectarse por cambios de temperatura. Poseer una buena relación señal ruido. No
destruir la muestra y tener una constante de tiempo baja (velocidad con la que responde a un cambio
en la concentración del analito). Los detectores pueden clasificarse como generales y selectivos. Los
generales miden el cambio de alguna propiedad física de la FM que contiene el analito en comparación
a la FM pura, ejemplo índice de refracción y conductividad. Los selectivos son sensibles a alguna
propiedad propia del soluto por ejemplo detector UV-Vis que producirá una señal proporcional de
absorbancia delsoluto a una longitud de onda dada. Otros ejemplos son el de fluorescencia y el
electroquímico.
El detector de índice de refracción mide
la diferencia en el índice de refracción
entre el solvente puro y el solvente con
la muestra. El detector de índice de
refracción es universal y no destructivo.
Como desventaja presenta que es muy
poco sensible y se ve afectado por la
temperatura y no puede ser utilizado en
determinaciones en gradiente.
Figura 10. Detector de índice de refracción
El detector UV-Vis es muy empleado en HPLC posee buena
sensibilidad, rango lineal y permite detectar analitos en el orden
de los ng, no es destructivo y puede usarse con gradiente de
solventes. El volumen de celda es de 1-12ul volumen pequeño
para evitar que se mezclen los componentes separados. La
concentración de la muestra de determina por aplicación de la
ley de Lambert y Beer. El detector es un espectrofotómetro en
donde se reemplaza la celda fija por una celda de flujo. La luz
emitida por la lámpara se enfoca en un monocromador y la luz
monocromática escogida se dirige hacia la celda de medida y
de allí al fotomultiplicador. Previamente al realizar el análisis
debe designarse la longitud de onda a la que se desea trabajar.
Algunos detectores UV-Vis de HPLC se encuentran acoplados
a un “arreglo u ordenamiento de diodos”, en estos dispositivos
el sistema óptico se encuentra invertido, es decir la celda se
ilumina con luz blanca (no monocromada) y la luz emergente de
Figura 11. Detector UV-Vis la celda llega a la red de difracción y allí es dispersada a hacia
el elemento fotosensible. Se utiliza un conjunto de fotoceldas o
fotodiodos de esta forma no solo se mide a luz absorbida a una
determinada longitud de onda si no que se mide todo el
espectro de absorción del eluido a tiempo real.
Para poder analizar los
resultados es necesario
disponer de un software
integrador. El mismo
permite no sólo la
recolección de los datos
para realizar un gráfico
(cromatograma), sino
también permite realizar
los tratamientos
matemáticos para realizar
la cuantificación.
Figura 12. Software, integrador
El resultado de un ensayo cromatográfico es por un lado la obtención de fracciones separadas de una
muestra y por otro un cromatograma que de su interpretación puede sacarse datos cuali y cuantitativos
Todas las partes del instrumento están constituidas por materiales resistentes al ataque químico y
desgate mecánico.
Bases de la separación
La columna cromatográfica es el sitio en donde ocurre la separación. Cuando la muestra y la FM son
forzadas a atravesar la FE se llevana cabo distintas interacciones entre estos componentes
(hidrofobicas, puentes de hidrogeno, interacciones dipolares y electrostáticas). El componente más a
fin a la fase estacionaria es el que tarda más en eluir.
Cromatograma
El cromatograma es un gráfico en el cual se observan distintas señales, o picos, en el eje de las
abscisas se observa el tiempo mientras que en el de las ordenadas se observauna medida de
intensidad(absorbancia, fluorescencia, índice de refracción). La intensidad de la señal es proporcional
a la concentración de la muestra, la misma se calcula como el área bajo la curva.
El cromatograma comienza en el momento que se realiza la inyección, en este grafico podemos
identificar distintos parámetros que nos permiten hacer un análisis de la calidad de la separación y en
cómo mejorarla.
El volumen muerto: que de este deriva el
tiempo muerto, es el volumen total de
solvente entre el punto de inyección y el
punto de detección.Línea de base: es la
porción de cromatograma donde solo se
aprecia la elución de la fase móvil sin
ningún soluto. Tiempo de retención: es el
tiempo medido entre la inyección y la
elución de la concentración máxima del
soluto disuelto que se esté analizando.
Factor de capacidad o de retención, constante de distribución (K´): corresponde a la relación entre el
número de moles que se encuentran disueltos en la fase estacionaria sobre el número de moles
disueltos en la FM. El valor ideal de k’ se encuentra entre 2-10.k’ >2 para cromatogramas e 5-6 picos
es típico y esperado. Para cromatogramas más complejos de k’ >0,5.
El valor de k’ puede ajustarse modificando la fuerza de elución de la fase móvil, por ejemplo en fase
reversa disminuye al aumentar la proporción del componente orgánico, en fase normal disminuye al
aumentar la proporción del solvente polar y aumenta al aumentar la proporción del no polar. La
medición de k’ es muy frecuente para evaluar la retención y ajustar la separación.
Factor de separación (): se comparan las k’ de dos analitos separados, si no existe separación alfa es
igual a la unidad.
Resolución: el objetivo de la cromatografía es separar, la resolución es una medida de la calidad de la
separación la expresión que lo refleja es:
Donde w es el ancho de pico desde la línea de base.
Para una buena separación se esperan R >1,5.
Ancho de pico (w): esta medida que sirve para realizar cálculos. Se puede tomar el ancho de pico
como a 60,7% de la intensidad del pico o a 50%.(si tienen distribución gaussiana).
Platos teóricos: es una medida de la eficiencia de la columna. Depende de diámetro, morfología
calidad de partícula y empaquetamiento de la FE. Representa un equilibrio teórico de distribución del
analito entre las fases.
La eficiencia de una columna cromatográfica se mide en función de los platos teóricos. Para la
separación no solo es necesario que los compuestos tengan tr distintos, sino que el ancho de los picos
sea lo más bajo posibles. El número de platos teóricos puede calcularse en función del ancho de pico
Ensanchamiento de banda: cuando realizamos corridas cromatográficas (en especial las largas) ocurre
un ensanchamiento del pico. Esto se debe a que existe una estrecha relación con el tiempo de
retención.
Solventes/ FM
Las fases móviles utilizadas en este tipo de cromatografía son calidad HPLC.Las fases móviles son el
parámetro fundamental que gobierna la separación, dado que con una sola columna es posible separar
compuestos de distintas características químicas (polares, no polares, iónicas) simplemente
modificando la fase móvil. Las FM deben de tener alto poder solubilizante de las muestras, baja
reactividad, compatibilidad con el detector utilizado, adecuado punto de ebullición, baja viscosidad,
seguridad, alto grado de pureza (todas estas condiciones se reflejan en sus elevados costos).
Al momento de realizar un análisisdebe usarse (en lo posible) como disolvente de la muestra a la
FM.En el caso que no sea posible debe probarse que no haya precipitaciones del solvente que se usa
para disolver con la fase móvil.
Toda FM debe desgasificarse dado que las burbujas de gases disueltos pueden liberarse en el cabezal
de la bomba, produciendo caudales irregulares que se traducen en líneas de base irregulares y
variación en los tr. Puede haber también liberación o formación de burbujas en la celda del
detector(que se observan como variaciones en la línea de base o también la aparición picos grades).
Los métodos más comunes de desgasificación son el ultrasonido y el vacío.
Columnas
De acuerdo a las características de la columna la
cromatografía puede ser de fase normal o de fase reversa. El
material de relleno pueden ser esferas o partículas irregulares
con diámetro de entre 3-10um. para la cromatografía
analítica. La porosidad es la relación entre el volumen interno
de los poros y el volumen de la partícula. La estructura
química superficial es la responsable del proceso de
retención.
El sustituyente más utilizado en fase reversa es
el alquílico octadecilsilano (ODS, C18) y octano
(C8). En la cromatografía de fase reversa es
importante recordar que a mayor proporción de
[mAU]
solvente orgánico menor k’ y a mayor
C:\ClarityChrom\Bench\astaxantina Marti\muestras\mayo 2019\muestra 4 - S 2500: Channel 1
[%]
proporción de agua mayor k’, de esta manera
C:\ClarityChrom\Bench\astaxantina Marti\muestras\mayo 2019\muestra 4 - S 2300: Channel 1
150
80
2,98 4
se puede mejorar la retención.
1,67 2
100
C18 60
Absorbance
Components
Preparación de muestra: para realizar un
50
correcto análisis del analito, es necesario 40
1,40 1
3,95 5
realizar una correcta preparación de la
2,37 3
6,07 6
20
muestra. La elección del mejor método de
8,62 7
0
preparación depende de distintos factores, para 0
0 2 4 6 8 10 12 14
esto se debe conocer propiedades físicas y Time [min.]
[mAU]
químicas del analito como solubilidad, C:\ClarityChrom\Bench\astaxantina Marti\columna C30\muestra 4 - S 2500: Channel 1
[%]
C:\ClarityChrom\Bench\astaxantina Marti\columna C30\muestra 4 - S 2300: Channel 1
respuesta frente al detector, su estructura qca,
17,4 12
40 80
conocer la concentración del analito en la
6,5 5
C30
30 muestra, la naturaleza de la matriz de la 60
15,9 11
Absorbance
Components
muestra, conocer la forma en la que se
20
encuentra el analito en la muestra. Como 40
tratamiento previo de la muestra puede
2,2 1
13,3 10
5,3 4
10
25,4 15
19,7 13
9,1 7
23,3 14
12,1 9
10,4 8
37,3 17
33,6 16
4,8 3
7,7 6
45,1 18
utilizarse cualquier método de la química 20
3,9 2
0
analítica conocida (liofiozacion, precipitación, 0
0
filtración, centrifugación, extracción líquido-
10 20
Time
30 40 50
[min.]
Figura 13. Estructura química de dos tipos de fases estacionarias. Cromatogramas
líquido, extracción obtenidos
en fase solida etc). de la
separación de una misma muestra con columnas diferentes.
Algunos analitos para poder ser analizados por HPLC deben ser modificados químicamente en su
estructura (este proceso se denomina derivatización), de esta manera se mejora su detección y
selectividad.
En la fase normal se usan solventes orgánicos no polares, en la fase reversa solventes polares (en
general agua) con un modificador orgánico (MeOH, acetonitrilo) como componentes de la FM. Cuando
se preparan alguna FM por ejemplo los Buffers es necesario filtrar la solución, con una membrana de
un poro pequeño (0,45-0,22um). Es necesario también filtrar con este tipo de membranas toda
solución que va a ser inyectada.
Análisis cuantitativo:
En análisis de un compuesto por HPLC puede hacerse de manera cuantitativa.
Para realizar la cuantificación se pueden utilizar distintos métodos: normalización
interna (porcentajes relativos), estándar externo (es el más utilizado, se preparan
soluciones de estándares de referencia en las mismas condiciones que la
muestra y se determina la cuantificación del analito comparando el área de la
mismas con el área del patrón), estándar interno (se agrega un estándar interno,
exactamente pesado, a la muestra y a un estándar del analito, los estándares
internos deben de cumplir ciertas condiciones), estándar agregado(se analizan
dos muestras, una es la muestra tal cual y la otra es la muestra con el agregado
Figura 14. Patrón de estadar de refencia.
comercial, calidad HPLC
Existen errores asociados a la separación por ejemplo: cuando k’=0
el analito se fue con el frente de solvente. La retención relativa
debe controlarse, la columnas de fase reversa suelen perder los
grupos alquílicos por hidrolisis por lo tanto cambia la retención. El
tailing es otro error de separación puede deberse al solapamiento
de dos picos. La resolución para una buena separación debe ser
mayor a 1,5.
Existen también errores asociados a la integración.
Figura 15. Formas correcta y erróneas de integración de una señal
Optimización del sistema cromatográfico
Una vez que se probó exitosamente un sistema cromatográfico, deben optimizarse los parámetros a
fines de mejorar al máximo la separación cromatográfica. El primer paso es el ajuste de R, k’, y N. La
resolución se relaciona con estos según la siguiente ecuación
La eficiencia puede mejorarse disminuyendo el caudal, empleando columnas más largas, usando
partículas de menor diámetro, acoplando columnas, aumentando la temperatura. La selectividad se
regula realizando una modificación en la columna o en la FM.
Las interacciones del analito con la fase
móvil pueden ser de tipo dispersivo,
dipolar, por puentes de hidrogeno,
interacciones dieléctricas o una
combinación de ellas. La magnitud de las
interacciones esta tabulada y de acuerdo
a las características de los solventes se
los clasifico en 8 grupos.Por lo tanto si se
desea mejorar la selectividad no debe
reemplazarse un solvente por otro del
mismo grupo sino todo lo contrario, por
uno de un grupo más alejado posible.
Para hacer cambios en un sistema de
fase reversa primero se ajusta la
concentración del solvente orgánico de
manera de obtener una k’ que
Figura 16. Triangulo de Snyder, clasificación de solventes utilizados como fase móvil
seencuentre entre 2 y 10 luego se
calcula la composición de mezclas con
Fuerza de elución = Ʃ (fuerza de elución de un solvente X la fracción en volumen del solvente).
solventes de otro grupo de igual fuerza
de elución
Bibliografía:
Quattrocchi, Oscar, Abelaira, Sara, Felipe Laba, Raul. (1992). Introducción a la HPLC,
Aplicación y Practica.
Skoog, Douglas A., Donald M. West, F. James Holler y Stanley R. Crouch. Fundamentos de
química analítica. Novena edición. ISBN: 978-607-519-937-6
