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CROMATOGRAFÍA
Génesis Samara Corredor Ovalle
Abril 2020
Universidad Industrial de Santander
Facultad de Ciencias
Escuela de Química
Análisis Químico II
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CROMATOGRAFÍA
La cromatografía es una importante técnica biofísica que permite separar, identificar y
purificar los componentes de una mezcla para su análisis cualitativo y cuantitativo. Las
proteínas pueden ser purificadas en base a características como el tamaño y la forma, la
carga total, los grupos hidrofóbicos presentes en la superficie y la capacidad de unión con
la fase estacionaria. Cuatro técnicas de separación basadas en las características
moleculares y el tipo de interacción utilizan mecanismos de intercambio de iones,
adsorción de superficie, partición y exclusión de tamaño. Otras técnicas de cromatografía
se basan en la cama estacionaria, incluyendo la cromatografía en columna, en capa fina y
en papel. La cromatografía de columna es uno de los métodos más comunes de purificación
de proteínas.
La cromatografía se basa en el principio de que las moléculas en mezcla aplicadas a la
superficie o al sólido, y a la fase líquida estacionaria (fase estable) se separa unas de otras
mientras se mueve con la ayuda de una fase móvil. Los factores efectivos en este proceso
de separación incluyen características moleculares relacionadas con la adsorción (líquido-
sólido), la partición (líquido-sólido), y la afinidad o las diferencias entre sus pesos
moleculares. Debido a estas diferencias, algunos componentes de la mezcla permanecen
más tiempo en la fase estacionaria, y se mueven lentamente en el sistema de cromatografía,
mientras que otros pasan rápidamente a la fase móvil, y salen del sistema más rápidamente.
Basándose en este enfoque, tres componentes forman la base de la técnica de
cromatografía.
• Fase estacionaria: Esta fase siempre está compuesta por una fase “sólida" o “una
capa de un líquido que absorbe en la superficie un soporte sólido"
• Fase móvil: Esta fase siempre está compuesta por “líquido" o un “componente
gaseoso".
• Moléculas separadas.
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El tipo de interacción entre la fase estacionaria, la fase móvil y las sustancias
contenidas en la mezcla es el componente básico efectivo para la separación de las
moléculas entre sí. Los métodos de cromatografía basados en la partición son muy
eficaces para la separación e identificación de pequeñas moléculas como
aminoácidos, carbohidratos y ácidos grasos. Sin embargo, las cromatografías de
afinidad. . . cromatografía de intercambio iónico) son más eficaces en la separación
de macromoléculas como ácidos nucleicos, y proteínas. La cromatografía en papel
se utiliza en la separación de proteínas y en estudios relacionados con la síntesis de
proteínas; la cromatografía de gas-líquido se utiliza en la separación de grupos de
alcohol, éster, lípidos y aminoácidos, y en la observación de interacciones
enzimáticas, mientras que la cromatografía de tamiz molecular se emplea
especialmente para la determinación de los pesos moleculares de las proteínas. La
cromatografía de gel de agarosa se utiliza para la purificación del ARN, las
partículas de ADN y los virus.
1. Introducción a la Cromatografía
En 1906, el botánico Ruso M. Tswett realizó un experimento que condujo al
descubrimiento de lo que hoy conocemos como cromatografía. Colocó un extracto de
pigmentos vegetales en la parte superior de una columna de vidrio rellena de carbonato de
calcio (CaCO3). Al agregar éter, observó que la mezcla original se separaba en diversas
bandas coloridas que descendían a través de la columna a diferentes velocidades.
Un rasgo característico de la cromatografía es la presencia de dos fases; dispuestas
de tal manera que mientras una permanece estacionaria dentro del sistema (fase
estacionaria), la otra se desplaza a lo largo de él (fase móvil). La clave de la separación en
cromatografía es que la velocidad con la que se mueve cada sustancia depende de su
afinidad relativa por ambas fases (equilibrio de distribución). En el experimento de Tswett,
la separación de los pigmentos vegetales se logró gracias a que cada uno de ellos tenía una
afinidad diferente por las fases. En general, los componentes más afines a la fase
estacionaria avanzan lentamente (más retenidos) mientras que los más afines a la fase móvil
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(menos retenidos) se mueven con mayor rapidez. Por consecuencia, el medio
cromatográfico (columna, placa o papel) funciona como un controlador de la velocidad de
cada sustancia que constituye la mezcla, logrando así su separación y mediante el uso de
un detector, su caracterización química.
Normalmente, se acostumbra clasificar los métodos cromatográficos según el estado
según el estado físico de la fase móvil:
[Link] Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC) es una técnica de
separación de mezclas de productos poco o nada volátiles. La muestra se introduce
en el puerto de inyección donde es arrastrada por una mezcla de disolventes (fase
móvil) hacía una columna cromatográfica. La diferente interacción de los analitos
con la fase móvil y el relleno de la columna permite la separación de los
componentes de la mezcla para una posterior detección, y/o caracterización, y/o
cuantificación utilizando diversos detectores.
La posibilidad de utilizar diversos procesos de interacción entre analitos y distintas
columnas cromatográficas , junto con la opción de seleccionar diferentes detectores
(algunos de ellos en serie), hace que sea posible la extracción de un gran volumen
de información permitiendo abordar una amplio abanico de necesidades analíticas.
La aparición en los últimos años de la Cromatografía Líquida de Ultra Alta
Resolución (UHPLC) ha aportado una mejor resolución cromatográfica
disminuyendo los tiempos de análisis.
1.2. La Cromatografía de Gases es una técnica de separación de mezclas de productos
volátiles o semivolátiles. La muestra se introduce en el puerto de inyección del
cromatógrafo donde se volatiliza y los vapores o gases formados son arrastrados
por un gas inerte hacia una columna cromatográfica. El diferente grado de
interacción de los componentes de la mezcla con la fase estacionaria de la columna
hace posible la separación . Finalmente, los componentes separados pueden ser
detectados, caracterizados y cuantificados utilizando diferentes detectores.
Este tipo de cromatografía siempre es en columna, ya que es la única manera de
que la fase móvil gaseosa se mantenga fluyendo, confinada dentro del sistema. La
columna puede estar rellena con la fase estacionaria, en forma semejante a la
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cromatografía líquida, o bien la fase estacionaria puede depositarse sobre las
paredes de un tubo muy delgado (0.25mm de diámetro) y largo (hasta 100m). Este
tipo de columnas se conocen como columnas capilares y proporcionan la mayor
capacidad de separación. De acuerdo con el mecanismo de retención, la
cromatografía se puede clasificar en los siguientes tipos:
- Adsorción (normal, de fase reversa)
- Permeación sobre gel
- Partición líquido-líquido
- De afinidad
- Intercambio iónico
Las diferentes posibilidades de introducción de muestra, el gran número de fases
estacionarias de las columnas cromatográficas y la diversidad de detectores, hacen
que esta técnica tenga una gran cantidad de aplicaciones en multitud de campos,
tales como: El análisis de drogas y fármacos en fluidos biológicos como la saliva,
la sangre, la orina; Seguir la transformación de las sustancias responsables de la
transmisión neurológica; Determinar la presencia de contaminantes en el medio
ambiente; entre otros.
[Link]ía en papel
La cromatografía en papel pertenece a la categoría "Cromatografía de líquidos". La
fase estacionaria se compone de una cinta de papel introducida verticalmente en un
recipiente de cristal y la fase móvil de un líquido. El movimiento de la fase móvil
se produce debido a la fuerza capilar. Un campo de uso de la cromatografía en papel
es el análisis de mezclas. Hay varios tipos de cromatografía, la ascendente (papel
hacia arriba), descendente (papel invertido), radial y de separación de zonas y
sectores.
En la cromatografía en papel se utiliza como fase estacionaria una hoja de papel de
celulosa de elevada pureza recubierta de una capa de agua asociada a las fibras de
celulosa. La fase móvil, en la que irá disuelta la muestra, se forma por disolventes
cuya naturaleza se elige en función de los componentes que se pretenden separar.
[Link]ía en Capa Fina
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La cromatografía en capa fina pertenece a la categoría "Cromatografía de líquidos"
y el principio de funcionamiento es el mismo que el de la cromatografía en papel.
La diferencia entre ambos procedimientos se encuentra en la fase estacionaria, que
en el caso de la cromatografía en capa fina se compone de materia pulverizada
como la alúmina, gel de sílice o celulosa que se sitúan sobre plaquitas de vidrio.
Las ventajas de la cromatografía en capa fina son un tiempo de ejecución rápido y
una alta muestra de comprobación.
FIG. 1. Cromatografía en Papel.
La fase móvil es líquida y la fase estacionaria consiste en un sólido. La fase
estacionaria será un componente polar y el eluyente será por lo general menos polar
que la fase estacionaria, de forma que los componentes que se desplacen con mayor
velocidad serán los menos polares.
Polaridad de los compuestos orgánicos en orden creciente:
hidrocarburos < olefinas < flúor < cloro < nitro < aldehído
aldehído < ester < alcohol < cetonas < aminas < ácidos < amidas
Generalmente se utiliza como reactivo revelador yodo, el cual forma complejos
coloreados con los componentes orgánicos (con tonos amarillo-marrón), pero las
manchas desaparecen con el tiempo con lo que es conveniente señalar las manchas
aparecidas.
Otro reactivo revelador bastante utilizado es el ácido sulfúrico, que reacciona con
los componentes orgánicos produciendo manchas negras. Sin embargo debe tenerse
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en cuenta que el tamaño de las manchas no está relacionado con la cantidad de
componente separado.
FIG. 2. Cromatografía en Capa fina.
[Link]ía de permeación en gel
La cromatografía de permeación en gel, también conocida como cromatografía de
exclusión es una variante de la CLAE que consiste en una columna cromatográfica
empacada de tal manera que las partículas de dicho empacamiento tienen diferentes
tamaños de poros o de redes de poros con el fin de que las moléculas de soluto sean
retenidas o excluidas basándose en su forma y tamaño y no en el peso molecular.
Bajo este entendido, las moléculas de mayor tamaño no caben dentro de los poros
y son arrastrados alrededor de la fase estacionaria, por lo que son excluidas y eluyen
en el volumen de “cama de vacío” de la fase móvil. Por el contrario, las partículas
de menor tamaño eluyen hasta el final porque tiene más espacio de columna que
recorrer debido a un fenómeno de difusión hacía los poros que tienen accesibles.
Las moléculas de tamaños intermedios tardan diferentes tiempos en eluir, debido a
la cantidad de poros por los que puedan pasar.
[Link]ía de exclusión de iones
Una variante de la cromatografía de permeación en gel o cromatografía de
exclusión, es cuando se realiza para la exclusión de iones. Mediante esta
modificación, se tienen separaciones que dependen de factores como tamaño de
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partícula de la resina, forma iónica e incluso distribución de isómeros. Esto permite
separar especies que de otra forma eluirían al mismo tiempo. Las separaciones se
llevan a cabo en resinas de intercambio con base en poliestireno de alta capacidad
como eluyentes, ácidos minerales diluidos.
[Link]ía en Columna
La cromatografía en columna pertenece a la categoría "Cromatografía de líquidos".
En la cromatografía en columna la fase estacionaria se compone normalmente de
un gel de sílice o alúmina pulverizado que se introduce en un tubo de vidrio y este
se rellena con un disolvente (fase móvil). Con este procedimiento se dirige la
prueba junto con la fase móvil a través del tubo de vidrio, lo que produce que se
separe la mezcla y los componentes vayan saliendo sucesivamente. Campos de
aplicaciones de la cromatografía en columna son por ejemplo la limpieza de
preparados.
[Link]
La electroforesis es una técnica para la separación de moléculas según la movilidad
de estas en un campo eléctrico a través de una matriz porosa, la cual finalmente las
separa por tamaños moleculares y carga eléctrica, dependiendo de la técnica que se
use.
La técnica clásica utiliza una tira recubierta de una sustancia porosa impregnada de
un electrolito. Sus extremos se sumergen en dos depósitos independientes que
contienen ambos al electrolito y están unidos a los electrodos del generador de
corriente. La muestra se deposita en forma de un pequeño trazo transversal en la
tira. La distancia de migración se mide en relación un marcador interno. Las placas
son reveladas con sales de plata, azul de Coomassie, o reactivos en particular.
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2. PARÁMETROS CROMATOGRÁFICOS
[Link] de Distribución
Al encontrarse un soluto disperso en una fase que entra en contacto con otra, ocurre
un fenómeno de distribución, en el cual dicho soluto puede tener mayor afinidad a
alguna de las dos fases. De esta manera, se genera un equilibrio entre la cantidad
de soluto que existe en una fase y en otra. La constante asociada es la llamada
constante de distribución, que se define para un soluto A como:
Donde [A]1 y [A]2 son la concentración de A en la fase 1 y 2 respectivamente.
Concretamente, en cromatografía la fase 1 es la fase estacionaria y la fase 2 es la
fase móvil y el soluto A es el analito de interés. Esta constante es específica para
cada compuesto con cada determinada fase estacionaria y fase móvil.
[Link]ón y Equilibrio en Cromatografía
El soluto se encuentra en un equilibrio de distribución entre la fase móvil y la
estacionaria, y dependiendo del desplazamiento de dicho equilibrio es la retención
del mismo. Una separación cromatográfica típica se muestra en la figura 3. La
separación está fuertemente afectada por la proximidad de bandas adyacentes en el
cromatograma.
Una importante medida de la proximidad de bandas es el llamado factor de
separación, α, donde dos bandas adyacentes, teniendo los valores k1 y k2:
α = k2 / k1
El factor de separación, α, es usualmente identificado con la selectividad del
sistema cromatográfico, es decir, la habilidad del sistema a prever diferentes
tiempos de retención para dos compuestos específicos. Dicho factor debe tener un
valor mayor a uno, pues esto significaría que no hay separación, pero es
recomendable que sea menor a dos puesto que tiempos de retención muy largos se
traducen en tiempo desperdiciado durante la operación experimental. Los valores
de α depende de los dos solutos y de: La composición química de la fase
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estacionaria; La composición química de la fase móvil (excepto en cromatografía
de gases); La temperatura.
En cromatografía de fluidos supercríticos, la presión también puede afectar a α al
cambiar la densidad de la fase móvil.
FIG. 3. Separación de una muestra de un compuesto nitrado con 10 componentes por
cromatografía de líquidos.
2.3. Factores de influencia en la retención
La retención que ocurre del soluto en la fase estacionaria, se debe generalmente a
la diferencia de polaridades entre las fases estacionaria y la móvil, promoviendo
que el soluto se reparta entre ellas según su coeficiente de distribución. De esta
manera, al separarse una mezcla que contenga solutos con polaridad distinta, y por
lo mismo coeficientes de distribución distintos, la retención será diferente para cada
uno.
En la cromatografía de gases, el to, es evaluado convenientemente a partir del
tiempo de retención del “pico de aire”. En la cromatografía de líquidos, cualquier
compuesto no retenido puede usarse como muestra para medir el to.
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El tiempo muerto de la columna puede usarse para determinar el llamado tiempo
de retención ajustado o corregido, t’R.
t'R =tR –to
FIG. 4. Cromatograma que muestra diferentes picos con tiempos de retención diferentes,
así como el tiempo muerto.
En los modos de retención de cromatografía se tiene: k’ > 0, que significa que no
hay bandas eluidas antes del tiempo muerto, to. A menudo es útil expresar el tiempo
de retención o el volumen en términos del factor de capacidad, k’.
tR=to (1+k’)
VR =Vm (1+k’)
La retención del soluto en la fase estacionaria depende de la afinidad, y de los
factores que puedan afectar a la misma. El fenómeno de adsorción depende
fuertemente de la temperatura, a mayor sea esta se fomentará la desorción, y debe
por tanto controlarse dependiendo de la naturaleza del análisis.
3. ECUACIÓN DE VAN DEEMTER
La ecuación de Van Deemter en cromatografía relaciona la variación por unidad de
longitud de una columna de separación con la velocidad de fase móvil lineal
considerando las propiedades físicas, cinéticas y termodinámicas de una separación.1
Estas propiedades incluyen vías dentro de la columna, difusión (axial y longitudinal) y
cinética de transferencia de masa entre fases estacionarias y móviles.
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La ecuación de Van Deemter es una función hiperbólica que predice que hay una
velocidad óptima a la que habrá la varianza mínima por unidad de longitud de la columna
y, por lo tanto, una eficiencia máxima. La ecuación de Van Deemter fue el resultado de la
primera aplicación de la teoría de la velocidad al proceso de elución de la cromatografía.
FIG. 5. Bosquejo de la ecuación de Van Deemter junto con los términos que la
conforman.
[Link] Capilares
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[Link] Empacadas
λ: factor de empaque de la columna (0.5~1.5)
dp: tamaño de las partículas de empaque
εp: porosidad interna de la partícula
εe: porosidad entre las partículas
Dm: coeficiente de disfusión del soluto en la fase móvil.
k: factor de capacidad
Ds: coeficiente de disfusión del soluto en la fase estacionaria.
qs: factor del recubrimiento de la fase estacionaria (2/3 para capa delgada). df:
espesor de la fase estacionaria
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Lista de referencias
McCABE / SMITH /HARRIOTT. “Operaciones Unitarias en Ingeniería Química”
1991. Cuarta Edición en Español. Editorial McGraw Hill S.A. España
PERRY, ROBERT H. “Manual del Ingeniero Químico” 1992. Sexta Edición.
Tercera Edición en Español چEditorial McGraw Hill. México
Wikipedia (2008) Electrophoresis en [Link]
revisado el Jueves 9 de Abril del 2020
Pontífica Universidad Javeriana (2008) Electroforesis en
[Link]
[Link] revisado el Jueves 9 de Abril del 2020
