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Agudelo, Mauricio: 2Hoyos, Santiago: 3Floyd, Juan Daniel
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Quimica Farmacéutica, 2Quimica Farmacéutica, 3Quimica Farmacéutica
Universidad Icesi, Facultad de Ciencias Naturales, Departamento de Ciencias Químicas,
Bioquímica
Santiago de Cali, de 5 Noviembre del 2020
[Link]
● Determinar los factores que alteren la velocidad de las reacciones catalizadas por
la enzima.
● Reconocer los mecanismos con el que trabajan ciertos factores en la reacción de
las enzimas.
● Comprender cómo a partir de esos factores se puede regular el trabajo de las
enzimas en los organismos biológicos.
● Analizar los resultados de aquellos cambios que se generen por pH y
temperatura en la muestra biológica
[Link]
Imagen 1. Escala de coloración para la experimentación con lugol.
I: Efecto de la concentración de la enzima sobre la velocidad de reacción
Para realizar este apartado, se agregaron 2 mL de almidón 0,5% a 4 tubos de ensayo. Al tubo
1, se le agregó 2.9mL de agua y 0,1mL de solución enzimática. Al tubo 2, 2.8mL de agua y
0,2 mL de sln enzimática. Al tubo 3, 2.7 mL de agua y 0,3 mL de sln enzimática. Al tubo 4,
2.6 mL y 0,4 mL de sln enzimática. A una temperatura constante de 37° C en baño maría.
Posteriormente, en placas elisa, se agregan 3 gotas de solución y 3 gotas de lugol cada 3
minutos. Los resultados se muestran en la imagen.
Imagen 2. Resultados del efecto de la concentración de la enzima
Tiempo (min) [0,1 mL] sln E [0,2 mL] sln E [0,3 mL] sln E [0,4 mL] sln E
0 5,0 4,5 4,5 4,5
3 5,0 4,5 4,5 4,5
6 5,0 4,5 4,5 4,5
9 5,0 4,5 4,5 4,5
12 5,0 4,5 4,5 4,5
15 5,0 4,5 4,5 4,5
18 5,0 4,5 4,5 4,5
20 5,0 4,5 4,5 4,5
25 5,0 4,5 4,5 4,5
30 5,0 4,5 4,5 4,5
35 5,0 4,5 4,5 4,5
40 5,0 4,5 4,5 4,5
Tabla 1. Resultados del efecto de la concentración de la enzima según la escala amarilla
Gráfica 1. Efecto de la concentración de la enzima en la reacción.
II. Efecto del pH en la reacción.
El experimento del efecto de pH en la muestra se realizó de la siguiente forma, se tomaron 2
tubos de ensayo en los cuales se agregaron 2 mL de almidón al 0.5%, cada uno rotulado
como A y B, al tubo A se le agregó 2.8 mL de una solución buffer de pH 7.0 y al tubo B se le
agrego igual cantidad, sin embargo, esta fue de un buffer de pH 4.0. estos se ponen a baño
maría a 37°c,luego, a cada tubo se le agregó 0.2 mL de extracto enzimático, luego a ello, se
tomó 3 gotas de cada tubo, y se traspasó a placas para elisa, también se le agregó de 2 a 3
gotas de lugol, este procedimiento se repitió cada 3 minutos durante 30 minutos, obteniendo
así los siguientes resultados.
tiempo pH 4.0 pH 7.0
0 1 3
1 1 3
2 2 3
3 3 4
4 4 4
5 4 5
6 4 5
7 4 5
8 4 5
9 4 5
10 4 5
tabla 2. resultados efecto de pH en velocidad de reacción
imagen 2. efecto de pH en velocidad de reacción
gráfico 2. efecto del pH en la velocidad de reacción
III. Efecto de la temperatura en la reacción.
En cuanto a este apartado, se añadió 2 mL de 0,5 % de almidón y 2.8 mL de agua a 3 tubos
de ensayo. No obstante, cada tubo de ensayo se mantuvo a diferente temperatura. El tubo 1 se
guardó a 4°C, el tubo 2 se mantuvo a temperatura ambiente y el tubo 3 se calentó a 50 °C
constante. Paso siguiente, se añadió 0,2 mL de solución enzimática y comenzó la reacción. Se
registró la coloración de la solución con lugol cada 5 minutos durante 25 minutos.
Imagen 3. Resultados del tubo 1 ( a temperatura de 4°C)
Imagen 4. Resultados del tubo 2 (a temperatura ambiente)
Imagen 5. Resultados del tubo 3 ( a temperatura de 50°C)
IV: Efecto de la concentración de sustrato sobre la actividad enzimática
Para este punto de la práctica se necesitaron 4 tubos de ensayo rotulados con una muestra de
1.0 mL, 1.5 mL, 2,0 mL y 3.0 mL de almidón 0,5%. Se llevaron a 37°C en baño maría a
temperatura constante. Después, se agregó 3.8 mL, 2.3 mL, 2.8 mL y 1.8 mL de agua
destilada en el orden correspondiente y se añadió a cada tubo 0.2 mL de extracto enzimático.
Finalmente, en placas ELISA, se tomó 3 gotas de la reacción de cada tubo y 1 gota de lugol.
Se repitió este procedimiento en intervalos de 5 minutos durante 30 minutos. Los resultados
se muestran en la siguiente imagen.
Imagen 6. Resultados del efecto de la concentración de sustrato sobre la actividad
enzimática.
Después, se organizaron los valores obtenidos en el laboratorio en la tabla 4 y gráfica 3 (Los
valores de esta tabla se toman usando como referencia la imagen 1.)
Tiempo (min) Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4
0-5 2 3 4 6
5-10 2 2 3 3
10-15 1 1 2 2
15-20 1 1 2 3
20-25 2 2 3 3
25-30 2 3 3 3
Tabla 4 Efecto de la concentración del sustrato sobre la actividad enzimática
Gráfica 3. Resultados del efecto de la concentración del sustrato sobre la actividad
enzimática
3. Análisis de resultados
Reacción de lugol y propiedades de la enzima amilasa.
En primer lugar, se debe analizar específicamente la prueba de yodo y las propiedades de la
enzima amilasa presente en la saliva. La prueba de yodo consiste en la introducción de un
reactivo llamado lugol, con el fin de determinar la presencia de almidón en alguna sustancia.
Cuando la sustancia contiene almidon, se produce una coloración azul/morada, cuando no lo
hay, el tinte arrojado es amarillo. El almidón cambia de color al estar en contacto con el yodo
( I2 ), porque que se genera compuesto de inclusión, es decir, que el almidón hospeda al yodo
dentro de su estructura, lo que genera un cambio en sus propiedades físicas y con ello la
coloración. Por otro lado, la enzima amilasa es una proteína que cataliza la hidrólisis de
almidón y glucógeno para producir azúcares más simples. Su funcionamiento óptimo está
dado por condiciones como una temperatura de aproximadamente de 37°C y un pH entre 5.0
y 5.5.
Análisis I, efecto de concentración sobre la velocidad de reacción
En lo referente a los resultados de este apartado, se puede evidenciar que probablemente hubo
un error en la experimentación ya que la coloración siempre resultó de tinte amarillo. Ello
quiere decir que la enzima amilasa proveniente de la saliva tenía una efectividad y eficiencia
muy alta, casi que desmesurable. Lo que se esperaba era que al instante de agregar los
mililitros de solución enzimática, la coloración en los primeros segundos fuera de un color
oscuro entre morado y azul debido a que el almidón aún se encontraba sin reaccionar con la
enzima amilasa. Con el pasar del tiempo, el tinte iría cambiando de color a uno mas claro,
hasta llegar a la total degradación del almidon por acción de la enzima, el cual resultaba en
una coloración amarillo claro. No obstante, cabe resaltar que la temperatura del baño maría
era la óptima para el funcionamiento de la enzima. Asimismo, al estudiar la eficiencia de la
catálisis enzimática, se puede afirmar que a mayor concentración de la enzima aumenta el
Kcat, es decir, la cantidad de moléculas que se convierten en producto por unidad de tiempo.
Por lo tanto, la velocidad de la reacción también aumenta. Al analizar esto en el experimento,
el resultado esperado era que el tubo con 0,3 mL y 0,4 mL de solución enzimática degradaran
el almidón rápidamente y la coloración amarilla se diera antes que las de los otros tubos de
ensayo con 0,1 mL y 0,2 mL de enzima. Además, se realizó una aproximación de la gráfica
que realmente debería haber resultado. El eje y es la coloración, donde 5.0 es oscuro y 1.0 es
amarillo claro.
Gráfica 4. Pronóstico del efecto de la concentración de la enzima
Análisis II, efecto del pH en la velocidad de reacción
Para analizar los resultados se debe tener en cuenta que en las placas para elisa se observan 4
columnas, las cuales están repartidas en 2 grupos, las primeras 2 columnas corresponden al
tubo A, este contenía 2.8 mL de la solución buffer de pH 7.0,asimismo, las otras 2 columnas
siguientes corresponden al tubo B, es cual contenía igualmente 2.8 mL de la solución buffer
de pH 4.0, por otro lado, las filas están numeradas de 0-10, siendo así 0 la toma inicial de la
muestra, recién agregado el extracto enzimático, y los números siguientes son las veces que
se tomó la muestra cada vez pasados 3 minutos.
al analizar los resultados, en el buffer de pH 7.0 se puede ver que la reacción se dio
efectivamente desde un inicio, se puede notar que en el buffer de pH 4.0 se vio afectada la
velocidad de reacción, el color demostró que no se estaba llevando a cabo la reacción de la
alfa amilasa con el almidón, esto debido a ya que la enzima no lograba hidrolizar
eficientemente al almidón. ya que el exceso de iones H+ en medio ácido como en el pH de
4.0, causa una interferencia en las cadenas laterales de los aminoácidos cargados de la
enzima. Por ello se deduce que el pH óptimo para el funcionamiento de la enzima debe ser
neutro.
Por otro lado, se logra evidenciar en la imagen 2, que la alfa amilasa está actuando
efectivamente sin embargo, entre mas pasa el tiempo, disminuye su efectividad. cómo se
logra evidenciar en los resultados de efecto de temperatura, al estar a 50°c, los colores se
tornan un poco más oscuro, además, la plancha de calentamiento en la prueba del pH no
estaba a 37°c sino a 40°c ya que esta solo se puede poner en números múltiplos de 5,por otro
lado,al inicio de empezar el experimento el termómetro, marcó 36 °c. sin embargo, a medida
que pasó el tiempo, se calentó completamente y esto pudo haber afectado la efectividad, ya
que nuestro cuerpo se encuentra en un rango de 36°C a 37 °C y al subirlo 3°C se afectó su
velocidad.
Análisis III, efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática
En cuanto al efecto de la temperatura, se debe estudiar la temperatura óptima de la enzima
amilasa. La temperatura óptima hace referencia al momento en el que la enzima está
degradando al almidón con mayor eficiencia. Consecuentemente, si la temperatura bajo la
cual reacciona la enzima está muy alejada de la temperatura óptima, su acción será mucho
menor. Además, dado que la amilasa es una proteína, si se incrementa mucho la temperatura
a tal punto que la proteína se desnaturaliza, entonces su funcionamiento será casi nulo.
Ahora bien, los resultados obtenidos no son los esperados. En primera instancia, a 4°C, se
espera que la acción de la enzima sea muy baja, de modo que la coloración cuando entre el
contacto con el lugol en los primeros segundos sea muy oscura, y con el pasar del tiempo se
vuelva un poco menos oscura si es que la enzima empieza a funcionar. Sin embargo, en la
imagen (3) se evidencia que la primera coloración resultó amarilla, lo cual no tiene sentido
porque la enzima está muy alejada de su temperatura óptima y no sería capaz de degradar el
almidón tan rápido. Igualmente, la coloración se fue tornando más oscura, lo que quiere decir
que el funcionamiento de la enzima fue en decadencia. En segunda instancia, para la
temperatura ambiente, se esperaba que la primera coloración fuera también oscura, aunque
esta vez con el pasar del tiempo y dado que la temperatura ambiente está cerca de la
temperatura óptima, la coloración se iría tornando amarillo claro por la actividad eficiente de
la enzima. No obstante, los resultados en la imagen (4) difieren. En tercera instancia, bajo
condiciones de 50°C, se esperaba un rendimiento enzimático relativamente alto por la
cercanía a la temperatura óptima. Pero, debido a que la temperatura a la que se desnaturaliza
la proteína también era cercana (entre 60~70°C) y la plancha de calentamiento no mantiene
una temperatura constante, entonces parte de la enzima se podría haber desnaturalizado. Al
observar la imagen (5) , se puede concluir que en el primer instante la enzima tuvo una acción
muy alta y con el pasar del tiempo parte de ella pudo desnaturalizarse, por consiguiente su
actividad disminuyó y con ello la coloración se tornó más oscura. Encima, se aproximó la
trayectoria de la gráfica con los resultados que estaban pronosticados.
Gráfica 5. Pronóstico del efecto de la temperatura en la enzima
Análisis IV, Efecto de la concentración de sustrato sobre la actividad enzimática
Para el análisis de este apartado del laboratorio se debe comprender cómo se tomaron las
muestras del sustrato en las placas ELISA. Para esto, se tomaron muestras cada 5 minutos por
30 minutos de la disolución de sustrato con agua destilada, los tubos permanecieron en baño
maría a una temperatura constante de 37°C para lograr que la reacción cumpla, o se intente,
mantener con las mismas condiciones con las que se logra la reacción biológicamente. Puesto
que es a esa temperatura es con la que normalmente funciona en el cuerpo humano entre 36 y
37°C. Por otra parte, a medida que se van tomando las muestras y vaya pasando el tiempo, la
coloración de las muestras empieza a disminuir una vez se extraiga de los tubos y se les
agregue la gota de lugol.
Finalmente, se puede observar en la Gráfica 3 los valores que arrojó el experimento. Los
tubos con menor concentración del sustrato y con mucha agua destilada (tubos 1 y 2)
obtuvieron una coloración muy clara y sin algún cambio muy significativo. Por otro lado, los
tubos con una concentración mayor del sustrato y poca agua destilada, nos mostraron una
coloración más oscura a lo largo del experimento y con un cambio de todo a una velocidad
mucho mayor. Lo anterior se debe a que la enzima actúa mejor cuando se encuentra una
mayor concentración de sustrato a cierta temperatura, no obstante, es un error asegurar que la
enzima actúe el doble de rápido si se le agrega el doble de sustrato, pues la velocidad de la
reacción de la enzima ya estará en su máximo a cierta concentración del sustrato.
[Link]
La velocidad de reacción de la actividad enzimática puede verse afectada por factores como
la concentración de la enzima, el pH, la temperatura y la concentración del sustrato. Por un
lado, se puede afirmar que a mayor concentración de la enzima aumenta el Kcat, es decir, la
cantidad de moléculas que se convierten en producto por unidad de tiempo. Por otra parte, se
deduce que el pH óptimo para el funcionamiento de la enzima debe ser neutro. esto pues, la
enzima la alfa amilasa está actuando efectivamente sin embargo, entre mas pasa el tiempo,
más disminuye su efectividad. Por parte del efecto de la temperatura, a 50°C, se esperaba un
rendimiento enzimático relativamente alto por la cercanía a la temperatura óptima (37°C).
Pero, debido a que la temperatura a la que se desnaturaliza la proteína también era cercana
(entre 60~70°C) y la plancha de calentamiento no mantiene una temperatura constante,
entonces parte de la enzima se podría haber desnaturalizado. Por lo anterior no se obtuvieron
los resultados esperados en la realización de este apartado del laboratorio. Por último, en la
determinación de la concentración del sustrato, al observar que en las muestras donde se
encontraba mayor proporción de concentración del sustrato y coloración más oscura era el
más adecuado para que la enzima pueda trabajar. Por eso, la enzima actúa mejor cuando se
encuentra una mayor concentración de sustrato.
5. Referencias
Gonzales Juan Manuel, (s.f) Curso orientado a estudiantes de Bioquímica y Biología
Molecular. REGULACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA. Extraido de:
[Link]
-Esperanza Espinel, Elizabeth Lopez. (2009). Purificación y caracterización de la alfa
amilasa. unal.
-MARTIN-SANCHEZ, Manuela; MARTIN-SANCHEZ, María Teresa y PINTO, Gabriel.
Reactivo de Lugol: Historia de su descubrimiento y aplicaciones didácticas. Educ. quím .
2013, pp.31-36.
