RESONANCIA MAGNETICA
NUCLEAR
EN QUE CONSISTE LA RESONANCIA MAGNETICA NUCLEAR
La espectroscopia de RMN fue desarrollada a finales de los años cuarenta para
estudiar los núcleos atómicos. En 1951, los químicos descubrieron que la
espectroscopia de resonancia magnética nuclear podía ser utilizada para
determinar las estructuras de los compuestos orgánicos. Esta técnica
espectroscópica puede utilizarse sólo para estudiar núcleos atómicos con un
número impar de protones o neutrones (o de ambos). Esta situación se da en los
átomos de 1 H, 13C, 19F y 31P. Este tipo de núcleos son magnéticamente activos,
es decir poseen espín, igual que los electrones, ya que los núcleos poseen carga
positiva y poseen un movimiento de rotación sobre un eje que hace que se
comporten como si fueran pequeños imanes. En ausencia de campo magnético,
los espines nucleares se orientan al azar. Sin embargo cuando una muestra se
coloca en un campo magnético, tal y como se muestra en la siguiente figura, los
núcleos con espín positivo se orientan en la misma dirección del campo, en un
estado de mínima energía denominado estado de espín α, mientras que los
núcleos con espín negativo se orientan en dirección opuesta a la del campo
magnético, en un estado de mayor energía denominado estado de espín β.
Existen más núcleos en el estado de espín α que en el β pero aunque la diferencia
de población no es enorme sí que es suficiente para establecer las bases de la
espectroscopia de RMN. La diferencia de energía entre los dos estados de espín α
y β, depende de la fuerza del campo magnético aplicado H0. Cuanto mayor sea el
campo magnético, mayor diferencia energética habrá entre los dos estados de
espín. En la siguiente gráfica se representa el aumento de la diferencia energética
entre los estados de espín con el aumento de la fuerza del campo magnético.
Cuando una muestra que contiene un compuesto orgánico es irradiada
brevemente por un pulso intenso de radiación, los núcleos en el estado de espín α
son promovidos al estado de espín β. Esta radiación se encuentra en la región de
las radiofrecuencias (rf) del espectro electromagnético por eso se le denomina
radiación rf. Cuando los núcleos vuelven a su estado inicial emiten señales cuya
frecuencia depende de la diferencia de energía (∆E) entre los estados de espín α y
β. El espectrómetro de RMN detecta estas señales y las registra como una gráfica
de frecuencias frente a intensidad, que es el llamado espectro de RMN. El término
resonancia magnética nuclear procede del hecho de que los núcleos están en
resonancia con la radiofrecuencia o la radiación rf. Es decir, los núcleos pasan de
un estado de espín a otro como respuesta a la radiación rf a la que son sometidos.
La siguiente ecuación muestra la dependencia entre la frecuencia de la señal y la
fuerza del campo magnético H0 (medida en Teslas, T).
El valor del radio giromagnético depende del tipo de núcleo que se está irradiando;
en el caso del 1 H es de 2.675 x 108 T-1s-1. Si espectrómetro de RMN posee un
imán potente, éste debe trabajar a una mayor frecuencia puesto que el campo
magnético es proporcional a dicha frecuencia. Así por ejemplo, un campo
magnético de 14.092 T requiere una frecuencia de trabajo de 600 MHz. Hoy en día
los espectrómetros de RMN trabajan a 200,300, 400, 500 y 600 MHz.
DESCRIPCION DEL EQUIPO
Como se observa, el espectrómetro de RMN consta de cuatro partes:
1. Un imán estable, con un controlador que produce un campo magnético preciso.
2. Un transmisor de radiofrecuencias, capaz de emitir frecuencias precisas.
3. Un detector para medir la absorción de energía de radiofrecuencia de la
muestra.
4. Un ordenador y un registrador para realizar las gráficas que constituyen el
espectro de RMN.
Para obtener un espectro de RMN, se coloca una pequeña cantidad del
compuesto orgánico disuelto en medio mililitro de disolvente en un tubo de vidrio
largo que se sitúa dentro del campo magnético del aparato. El tubo con la muestra
se hace girar alrededor de su eje vertical. En los aparatos modernos el campo
magnético se mantiene constante mientras un breve pulso de radiación rf excita a
todos los núcleos simultáneamente. Como el corto pulso de radiofrecuencia cubre
un amplio rango de frecuencias los protones individualmente absorben la radiación
de frecuencia necesaria para entrar en resonancia (cambiar de estado de espín).
A medida que dichos núcleos vuelven a su posición inicial emiten una radiación de
frecuencia igual a la diferencia de energía entre estados de espín. La intensidad
de esta frecuencia disminuye con el tiempo a medida que todos los núcleos
vuelven a su estado inicial. Un ordenador recoge la intensidad respecto al tiempo y
convierte dichos datos en intensidad respecto a frecuencia, esto es lo que se
conoce con el nombre de transformada de Fourier (FT-RMN). Un espectro FT-
RMN puede registrarse en 2 segundos utilizando menos de 5 mg de muestra.
APLICACIONES DE RMN EN ANÁLISIS DE ALIMENTOS
La RMN es una técnica analítica caracterizada por su potencial a la hora de
aporta información estructural. Por ese motivo, desde el principio estuvo muy
orientada a la caracterización de sustancias puras y a la elucidación de
estructuras moleculares.
Sin embargo, una interesante propiedad de la RMN radica en que la intensidad
delas señales es proporcional al número de átomos presentes; es decir, la RMN
no es sólo cualitativa, sino que también es cuantitativa. Una herramienta que
conjuga ambas capacidades es un punto de partida muy interesante para su
aplicación en el análisis de mezclas. De la comparación de las señales de cada
componente pueden deducirse sus proporciones en la mezcla. La única
restricción es que al menos una de las señales de cada compuesto pueda
identificarse de forma aislada, sin solapar.
Los alimentos son mezclas complejas de muy diversas sustancias, algunas de
las cuales están presentes en grandes o pequeñas proporciones. La aplicación
de la espectroscopia de RMN al análisis de alimentos fue muy temprana y ya en
1962 algunos pioneros de la técnica se aventuraban a analizar, exitosamente, el
grado de insaturación y el peso molecular promedio de las grasas.46 La
progresiva implementación de avances tecnológicos ha permitido mejorar la
sensibilidad y resolución de los equipos desde entonces y, en consonancia, el
número de aplicaciones de la técnica en disciplinas como medio ambiente,
nuevos materiales, bioquímica, farmacología y, por supuesto, alimentos.
Aunque nuestro interés se centrará en la espectroscopia de RMN de alta
resolución, es decir, con equipos de 7 T o más; otras técnicas basadas en la
resonancia tienen también cabida en el análisis de alimentos. Equipos de bajo
campo diseñados para experimentos de difusión y de relaxometría son muy
útiles en control de calidad industrial para medidas de contenido de grasa y
humedad o de porcentaje de grasas sólidas. Por otro lado, la resonancia
magnética de imagen (RMI) está siendo aplicada progresivamente en ensayos
para la visualización no invasiva y no destructiva de alimentos como frutas,
hortalizas, carnes o pescados. Existe también una técnica de análisis isotópico
basada en RMN que es la SNIF‐NMR (Site‐Specific Natural Isotope
Fractionation by NMR) capaz de garantizar la autenticidad o el origen midiendo
la relación isotópica 13C/12C ó 2 H/1H.
Muchos son los núcleos atómicos que pueden ser detectados por RMN. Sin
embargo, no todos ellos están presentes en los alimentos. El hidrógeno es un
átomo muy abundante en los alimentos y por ello la mayoría de estudios en
alimentos se basan en 1H‐RMN. Como desventaja, muchas de las señales
pueden solaparse entre sí, dificultando el análisis. Otro de los átomos más
abundantes es el carbono, aunque el isótopo que presenta propiedades
magnéticas es minoritario. Aproximadamente, sólo el 1,1% de los átomos de
carbono son 13C, lo que repercute enormemente en la sensibilidad del
experimento y se traduce en tiempos largos de adquisición. Sin embargo, como
ventaja, los problemas de solapamientos son muy infrecuentes debido a la gran
dispersión de las señales. Con los átomos de nitrógeno y de oxígeno la
abundancia de los isótopos apropiados es muy pequeña, dificultando su
aplicabilidad. Por último, aunque muy pocas moléculas presentes en los
alimentos presentan fósforo, los estudios de 31P‐RMN han demostrado ser muy
útiles para identificarlos selectivamente. También se utiliza 31P‐RMN para
resolver mezclas complejas gracias a uso de reactivos de derivatización que
incluyen fósforo.
Matrices alimentarias analizadas por RMN.
El análisis de RMN ha sido aplicado al estudio de diferentes tipos de alimentos
El rango de aplicación es muy amplio e incluye bebidas (vino, cerveza, té, café,
zumos), frutas, hortalizas, cereales, miel, leche y lácteos, aceites, carnes y
pescados, etc. Para los diferentes alimentos, la RMN permite realizar análisis
composicional y cuantificar las diferentes sustancias que tienen relevancia a
nivel nutricional o como indicadores de calidad. También puede utilizarse para la
detección y cuantificación de las sustancias producidas a causa de fenómenos
de degradación, alteración u oxidación. El potencial de la RMN permite
diferenciar alimentos que han sido sometido a diferentes condiciones de
procesado o conservación. También sirve para evaluar si el alimento ha sufrido
adulteraciones o mezclas con producto de menor calidad. Finalmente, los
análisis de huella metabolómica son una importante herramienta para
discriminar origen geográfico o variedad
Nuestro equipo de investigación cuenta con experiencia previa en trabajos de
aplicación de la técnica de RMN al estudio del vino. Los estudios estuvieron
enmarcados en el desarrollo de la tesis doctoral titulada: “La Resonancia
Magnética Nuclear como herramienta en el estudio y control del proceso de
vinificación”; defendida en 2012 por Eva López Rituerto. Los resultados del
trabajo fueron exitosos y dieron lugar a varias publicaciones.
Teniendo en cuenta esta experiencia y dados los escasos estudios realizados
sobre embutidos, el presente estudio se centrará en el análisis de la fracción
lipídica de los embutidos. A continuación, repasaremos los antecedentes en la
utilización de la RMN para el análisis de grasas y aceites.
ANÁLISIS DE CARNES Y EMBUTIDOS CON RMN
En lo referente a análisis de carnes, las aplicaciones de la RMN de campo bajo
son las principales protagonistas. En 1974 ya fue propuesto un procedimiento de
análisis de grasas. Experimentos de relajación con RMN pulsado permiten análisis
de contenido en grasa que correlacionan muy bien con técnicas clásicas de
análisis como Soxhlet o Folch. Empresas como Bruker o CEM comercializan
equipos de RMN dedicados para análisis de grasa y humedad en alimentos. Los
pequeños equipos de RMN de sobremesa pueden ser útiles es estudios más
complejos, como por ejemplo en la discriminación de carnes bovinas y equinas o
en el estudio del efecto del tipo de grasa sobre la movilidad del agua y la
distribución de la grasa en embutidos.
En cuanto a las aplicaciones de la espectroscopia de RMN de alta resolución en
carnes, pueden encontrarse trabajos ya en 1986 donde se estudia la evolución del
metaboloma post mortem en carne bovina. Los primeros estudios metabolómicos
en carne se centraron principalmente en la fracción hidrosoluble de las muestras
cárnicas y analizaban ácido láctico, fosfocreatina, creatina, algunos aminoácidos
libres o compuestos fosforilados como el ATP y sus derivados ADP y AMP.
Estudios posteriores se han centrado en el análisis de metabolitos en los
exudados de las carnes para evaluar el grado de madurez de la carne y su estado
de conservación. Otros trabajos han comparado técnicas cromatográficas y RMN
en el estudio de la evolución de la carne bovina durante su maduración mostrando
buena correlación.
ANÁLISIS DE GRASAS CON RMN
En el análisis de aceites y grasas con RMN, la preparación de la muestra es muy
sencilla y se limita a disolver una pequeña cantidad en el disolvente deuterado,
habitualmente CDCl3. Los tiempos de análisis pueden ser muy cortos (minutos).
La espectroscopia de RMN hace muy accesible el análisis del perfil de ácidos
grasos.
En 1H‐RMN, la intensidad relativa de las señales en el espectro permite calcular
fácilmente las proporciones saturado/insaturado. Combinando las señales
apropiadas se puede llegar a detallar los porcentajes de monoinsaturados,
diinsaturados (linoleico) o triinsaturados (linolénico). En el caso de grasas
provenientes de pescado, los porcentajes de grasas omega 3 y en particular, de
ácido docosahexaenoico (DHA) también pueden ser calculados.
