Universidad Mayor de San Simón Facultad de Ciencias y Tecnología
Docente: Ana Lineth Garcia Orellana Auxiliar: Licyel Paulas
Materia: Biología Celular y Molecular Grupo: Nª 1
Carrera: Lic. En Biología Horario: 14:15 pm a 18:15 pm
Estudiante: Chávez Peredo Camila
Extracción Casera de ADN
1. Resumen
La extracción de ADN se ha realizado de manera casera, es decir, se han utilizado
objetos que fácilmente se podrían encontrar por casa o en el colegio. Obviamente en un
laboratorio científico profesional este experimento se podría llevar a cabo más
efectivamente. No se ha pretendido explorar todos los aspectos a fondo, sino que se ha
intentado abarcar todos de una forma eficaz. Así pues, se ha extraído el ADN de forma
exitosa con ayuda del auxiliar a cargo.
Palabras clave. - casero, ADN, casa, experimento.
2. Introducción
Todo organismo vivo está formado por la ampliamente estudiada y conocida molécula
de DNA. Sabemos que los organismos vivos provienen de una única célula ancestral
llamada LUCA. Este hecho nos indica que entre organismos vivos compartimos mucho
más de lo que a veces nos podríamos llegar a imaginar. Por ejemplo, el número de genes
de un tomate es un 25% más que el de un humano y creo que la mayoría nos
consideramos más complejos y sofisticados que una tomatera (José R. Alonso). Algunas
de las cosas para las que estos genes codifican son de bioquímica básica: la replicación
del DNA, la transcripción, la traducción, el metabolismo del DNA (recombinación,
reparación), el metabolismo de la célula (catabolismo y anabolismo) y la regulación del
ciclo celular (mitosis) (Aras S. et al 2003). Este tipo de genes son nombrados por los
biólogos como “secuencias conservadas”. Para poder estudiar esta molécula con detalle
se precisa generalmente su aislamiento de la célula, y para ello es necesario un conjunto
de material e instrumentos de laboratorio complejos. Lo que este experimento pretende
es un acercamiento simple y sencillo a la técnica de extracción de DNA que se puede
realizar en cualquier hogar con materiales de la vida cotidiana.
El genoma se encuentra organizado en forma diferente en las células procarióticas y
eucarióticas; en estas últimas presenta un mayor grado de complejidad. El genoma de
las células procariotas está integrado dentro de una sola molécula de DNA circular,
dispuesta de modo compacto en una zona nuclear denominada nucleoide. El tamaño del
genoma bacteriano se puede ejemplificar con el de Escherichia coli; tiene 1 360 nm y se
encuentra constituido por 4 700 kilopares de bases.
El genoma de las células eucarióticas se encuentra organizado en cromosomas, que son
estructuras de DNA relacionadas con proteínas básicas, a las que se les
denomina histonas, y proteínas no histonas; las histonas tienen carga positiva a pH
fisiológico y neutralizan las cargas negativas del fosfato de los nucleótidos, lo que
confiere estabilidad y permite que el DNA que mide casi 2 metros de longitud se
empaquete en un núcleo de 10 µm de diámetro. El genoma humano está constituido por
46 cromosomas y contiene 5 × 106 kpb en su totalidad. ( Avise J. C. 2004.)
De acuerdo con el tipo de célula en estudio, para aislar los ácidos nucleicos es necesario
romper la membrana y la pared celular mediante métodos físicos, químicos o
enzimáticos, para liberar las moléculas de DNA al medio extracelular. Al igual que la
extracción en el laboratorio, para obtener el material genético se requiere de una serie de
etapas básicas. En primer lugar, debemos conseguir lisar o romper la pared celular y/o la
membrana plasmática para poder acceder al núcleo de la célula dónde se encuentra
alojado el ADN (Boom R. et al 1990). A partir de esto, la purificación de los ácidos
nucleicos se realiza mediante la extracción de las proteínas y los lípidos con solventes
orgánicos, y su recuperación, en un paso posterior, al precipitarlos con alcohol al 96%.
Sin embargo, al realizar la practica nos hemos estado haciendo algunas cuestiones que
las responderemos enseguida:
¿Cuál es el papel de la trituración?
Romper las paredes celulares y separar las células.
¿Cuál es el papel de la adición del detergente?
El lavaplatos ayuda a disolver la membrana celular que es una bicapa lipídica.
¿Cuál es el papel del cloruro de sodio?
El cloruro de sodio ayudar a separar algunas de las proteínas que están unidas al ADN.
También mantiene las proteínas disueltas en la capa acuosa de forma a impedir que
estas precipiten también con el alcohol, junto con el ADN. (Guinn G. 1966)
Los iones sodio y cloruro neutralizan las cargas negativas del ADN. Adicionalmente,
los cationes sodio (Na+) contrarrestan las cargas negativas de los fosfatos del ADN.
¿Para qué sirve el alcohol en la extracción del ADN?
El alcohol disminuye la constante dieléctrica de la solución acuosa. El etanol frio
provoca que el ADN se separe del agua y precipite. Cuando el ADN se separa de la
solución acuosa, tiende agruparse, lo que hace que sea visible. Las largas cadenas del
ADN se enrollarán alrededor de la varilla al revolver la interface entre las dos capas.
(Sambrook J.1989)
3. Objetivos
Reflexionar sobre la sencillez del proceso de extracción de ADN, estableciendo un
protocolo que nos permita obtener ADN mediante elementos cotidianos.
Confirmar a partir de la longitud enrome de las fibras en el núcleo que el ADN
se encuentra replegado.
Observar la estructura fibrilar del ADN.
4. Métodos y Materiales
4.1. Material Biológico
4.1.1. Tomate
4.1.2 Mango
4.2. Instrumentos, Material de Vidrio y Seguridad
4.2.1. Tubos de ensayo de la misma capacidad (3).
4.2.2. Hisopos (3)
4.2.3. 3 posillos de vidrio
4.2.4. Cucharilla
4.2.5. Coladera
4.3. Reactivos
4.3.1. Alcohol etílico al 96% (5-10 ml)
4.3.2. Sal de mesa (NaCl)
4.3.3. Agua destilada (70 ml)
4.3.4. Detergente líquido para lavavajillas
4.3.5. Hielo
Métodos
4.1. Preparación previa
4.1.1. Colocar en el refrigerador el alcohol etílico para enfriarlo y
mantenerlo en un recipiente con hielo mientras se realizan las otras
actividades.
4.1.2. Remover la piel del tomate y el mango
4.1.3. Líquido de extracción: Colocar una cucharilla y media de sal, unos
70 ml aprox. de agua destilada (puede estimarse el nivel hasta el cual sea
un volumen de 70 ml, teniendo en cuenta que un vaso típico tiene un
volumen de 250 ml) y una cucharilla de detergente líquido para lavar
platos en un vaso de precipitado, y mezclar con una cucharilla.
4.2. Extracción de ADN de Mango
4.2.1. Colocar el mango en el posillo, junto con el líquido de extracción y
molerlo.
4.2.2. Una vez aplastado, filtrar el contenido con el embudo en un vaso
de precipitado utilizando el colador.
4.2.3. Verter un pequeño volumen del extracto a uno de los tubos de
ensayo.
4.2.4. Colocar entre 5-10 ml de alcohol etílico frío a la mezcla inclinando
el tubo de ensayo, y dejando que el alcohol caiga primero a las paredes
del tubo deslizándose hacia la mezcla. Realizarlo hasta que se forme una
capa blanquecina en la cima de la mezcla. No dejar que el líquido de las
frutillas y el alcohol se mezclen.
4.2.5. Analizar la mezcla dentro del tubo. El ADN aparecerá como hebras
blanquecinas/transparentes de apariencia pegajosa.
4.2.6. Trata de tocar o mover las hebras con el hisopo.
4.3. Extracción de ADN de Tomate
4.3.1. Colocar el tomate en el posillo, junto con el líquido de extracción y
molerlo.
4.3.2. Una vez aplastado, filtrar el contenido con el embudo en un vaso
de precipitado utilizando el colador.
4.3.3. Verter un pequeño volumen del extracto a uno de los tubos de
ensayo.
4.3.4. Colocar entre 5-10 ml de alcohol etílico frío a la mezcla inclinando
el tubo de ensayo, y dejando que el alcohol caiga primero a las paredes
del tubo deslizándose hacia la mezcla. Realizarlo hasta que se forme una
capa blanquecina en la cima de la mezcla. No dejar que el líquido de las
frutillas y el alcohol se mezclen.
4.3.5. Analizar la mezcla dentro del tubo. El ADN aparecerá como hebras
blanquecinas/transparentes de apariencia pegajosa.
4.3.6. Trata de tocar o mover las hebras con el hisopo.
5. Resultados
5.1 Mango
5.1.1 Primeramente llegamos la fase 1 del experimento que es la incorporación de los 2
elementos esenciales que es la preparación previa y la pulpa del mango (Figura A)
Figura A.- Unión de la mezcla previa con la pulpa del mango
5.1.2
Una vez colado y colocado en el tubo de ensayo con los 10 ml de alcohol al 96%
tenemos que esperar un momento hasta que se haya formado una capa con hebras al
superior del tubo (Figura B)
Figura B.- todos los elementos del procedimiento juntos,
formación de las hebras.
5.1.3 El producto filamentoso obtenido de la extracción no es ADN puro ya que,
entremezclado con él, hay fragmentos de ARN. Una extracción "profesional" se realiza
añadiendo enzimas que fragmentan las moléculas de ARN e impiden que se unan al
ADN. Pudimos observar una capa de ADN mezclada con fragmentos de RNA y quizás
algunas proteínas (Figura C), pudimos observar una hebra bien clara y blanquecina con
éxito (Figura D), se hizo un zoom para observar la hebra más clara (Figura E).
Figura E.- Zoom de la
imagen D, la hebra se
ve más clara.
Figura C.- Observación Figura D.- Observación
de hebras en lo superior de la hebra mayor al
del tubo de ensayo. superior del tubo.
5.2.1 Llegamos a la fase 1 del experimento que es la incorporación de los 2 elementos
esenciales, que es la preparación previa y la pulpa del tomate (figura F)
Figura F.- Unión de la mezcla previa con la pulpa del Tomate.
Tomate
5.2.2 Una vez colado y colocado en el tubo de ensayo con los 10 ml de alcohol al 96%
tenemos que esperar un momento hasta que se haya formado una capa con hebras al
superior del tubo. En este caso logre grabar el momento donde sube el ADN al superior
del tubo, no obstante, no se puede añadir videos en el documento, pero lo adjunto
cuando envíe el trabajo. Sin embargo, adjunto una captura de pantalla (Figura G)
Figura G.- Observación de hebras en lo superior del tubo de
ensayo.
5.2.3 Como
mencionamos anteriormente con el resultado del mango el producto filamentoso
obtenido de la extracción no es ADN puro ya que, entremezclado con él, hay
fragmentos de ARN. Una extracción "profesional" se realiza añadiendo enzimas que
fragmentan las moléculas de ARN e impiden que se unan al ADN. Donde pudimos
observar una capa de ADN mezclada con fragmentos de RNA y quizás algunas
proteínas (Figura H), pero en este caso las hebras se formaron en un lado del tubo,
quizás por el movimiento al levantarlo (Figura I) se hizo un zoom para observar mejor
(figura J).
6. Discusión
Para empezar, hice dos gráficos para que hagamos un pantallazo de las comparaciones
que llegaremos a hacer, en el primer esquema (figura X) veremos el proceso extracción
del ADN en laboratorio con kit y en el segundo esquema (figura Y) veremos el proceso
de extracción de ADN casero.
Figura X.- Proceso extracción
del ADN en laboratorio con
kit.
Figura Y.- Proceso de
extracción de ADN casero.
Proceso de extracción de ADN con Kit. -
En este proceso indicamos 2 protocolos uno comercial y otro tradicional.
Lisis celular
Durante el proceso de lisis las interacciones entre las moléculas que conforman la pared,
la membrana celular y nuclear se modifican o destruyen permitiendo que los ácidos
nucleicos se liberen. Se utilizan soluciones básicas, detergentes o agentes caotrópicos
que permiten disolver la membrana celular, así como inhibidores para inactivar las
enzimas que degradan el ADN. Muchas soluciones de lisis contienen también EDTA,
que forma un complejo con los iones de Mg2+ e impide el funcionamiento de las
DNasas (Sambrook et al. 1989). Los componentes celulares no solubles como el
material fibroso y proteínas que permanecen en solución se separan del ADN por
centrifugación. Tanto la homogeneización como la lisis celular son similares en los
protocolos tradicionales y comerciales. Las particularidades del resto de las etapas se
explican, a continuación, independientemente para cada uno de los protocolos.
Protocolo Tradicional:
Separación de proteínas y lípidos
En esta etapa se separa el ADN de las proteínas y lípidos mediante solventes orgánicos
y ciclos de centrifugación. Se utiliza la fuerte tendencia hidrofílica de los grupos fosfato
para separarlos en medios acuosos, mientras que las proteínas y los lípidos se separan en
solventes orgánicos (Sambrook et al. 1989). La fase acuosa y la orgánica se separan por
centrifugación lo que permite aislar al ADN. Los solventes que se usan frecuentemente
son el fenol, el cloroformo y el alcohol isoamílico (Stulnig y Amberger 1994). Estos
reactivos contaminan fácilmente el ADN, por lo que se debe evitar acarrearlos en el
proceso de purificación.
Precipitación del ADN
Después de que son eliminados los lípidos y las proteínas, se recupera el ADN. Para
ello, se adiciona etanol y soluciones con altas concentraciones de iones de sodio o
amonio que se unen a los grupos fosfato, esta mezcla reduce las fuerzas repulsivas entre
las cadenas y permite que el ADN se pliegue sobre sí mismo haciéndolo insoluble. Un
paso de centrifugación permite que el ADN permanezca en el fondo del tubo mientras
que el etanol es desechado. Los restos de etanol se eliminan con un lavado con etanol al
70% y el remanente se elimina por evaporación. (Laura Alejos et al. 2014)
Redisolución del ADN
Una vez que se ha eliminado el etanol, el paso siguiente es hidratar el ADN para
mantenerlo en solución. En el caso de emplear agua, el pH debe ser de 7 para permitir la
redisolución completa del ADN y evitar una hidrólisis ácida. Cuando se utiliza una
solución amortiguadora, es preferible utilizar una solución de Tris-HCl a 10mM y
EDTA a 0.1M a un pH de 8.0, para almacenar el material. Cuando se está disolviendo el
ADN es importante evitar el pipeteo y la agitación agresiva pues se pueden fragmentar
moléculas de alto peso molecular. Una opción que evita la fragmentación, consiste en
incubar a 55 °C el ADN, 1 a 2 horas con agitación suave. (Laura Alejos et al. 2014)
Protocolo comercial:
Unión del ADN a la matriz inorgánica y lavado
En el caso del kit con membrana de sílice, en algunos casos a la mezcla de lisis se le
añade la solución de unión que tiene un pH específico. Antes de pasar la solución de
lisis a través de la columna, se adiciona etanol a la solución, eliminando la capa
hidratante del ADN y exponiendo sus grupos fosfato, facilitando con ello la adsorción
de la molécula a la membrana cargada positivamente. Los lípidos y proteínas no son
afines a la membrana y se eliminan con ayuda de la solución de lavado y un ciclo de
centrifugación, mientras que el material genético permanece unido a la matriz. (Laura
Alejos et al. 2014)
Recuperación del ADN de la matriz
En los kits es necesario liberar al ADN de la matriz, La membrana y el ADN se
deshidratan con soluciones de lavado y ciclos de centrifugación, después se recomienda
centrifugar nuevamente la columna para evaporar el etanol y eliminar el exceso de las
soluciones. Posteriormente, se adiciona agua o solución amortiguadora al centro de la
membrana, se espera a que el ADN se hidrate, se centrifuga para recuperarlo de la
matriz y re suspenderlo. (Laura Alejos et al. 2014)
Métodos de análisis
Cuantificación del ADN
Una vez obtenido el material genético, es importante determinar el rendimiento
mediante espectrofotometría. La ley de Beer-Lambert indica que la concentración de
una molécula en solución depende de la cantidad de luz absorbida de las moléculas
disueltas. Una característica del ADN es que absorbe la luz ultravioleta (UV) a 260 nm
y permite estimar su concentración mediante espectrofotometría. Cuando la longitud de
la celda en que se disuelve el ADN, es de 1 cm, la absorbancia es igual a la densidad
óptica (DO). En el caso de ADN genómico o de doble cadena, una densidad óptica
equivale a 50 ug/ml (Leninger 1975). Se debe considerar el factor de dilución para
obtener la concentración en nanogramos/microlitro (ng/ul). En el caso de algunos
equipos como el espectrofotómetro Nanodrop, no es necesario diluir la muestra y el
equipo nos proporciona directamente la concentración en ng/ul. Considerando que para
una reacción de PCR se requieren de 10 a 200 ng debemos obtener al menos, 5 ng/ul de
ADN en cada muestra, si se recuperaron 50 ul, el rendimiento neto de la extracción sería
de 0.25 ug. Concentraciones menores dificultan la estandarización de la PCR u otras
técnicas. Para estimar la pureza del ADN se considera la proporción de la absorbancia a
260 nm y 280 nm. Una proporción de 1.8 es aceptada como ADN puro, proporciones
menores a este valor indican la presencia de proteínas. Una segunda valoración de la
pureza de ácidos nucleicos es la proporción 260/230, los valores aceptados se
encuentran en el rango de 2.0 a 2.2, si la relación es menor indican la presencia de
contaminantes como carbohidratos o fenol. (Laura Alejos et al. 2014)
Comprobación de la integridad del ADN por electroforesis
Además de conocer la cantidad y calidad del ADN por espectrofotometría, es
importante conocer si el ADN obtenido está integro. La integridad del ADN se puede
observar mediante electroforesis en gel de agarosa. Si el ADN está integro, se debe
observar una banda estrecha cercana al pozo en que se colocó la mezcla de ADN. Si
está fragmentado, se observará una banda de más de un cm de ancho o un sendero
luminoso en el carril de la muestra. El ADN fragmentado dificulta la amplificación de
productos de PCR de alto peso molecular y afecta la reproducibilidad de las técnicas.
(Laura Alejos et al. 2014)
Almacenamiento del ADN
Una vez que el ADN ha sido purificado, cuantificado y analizado mediante
electroforesis, una parte de la muestra se puede almacenar a 4 °C para los análisis
inmediatos y el material restante a -20 °C o -80 °C, para una preservación por varios
meses. En este último caso es conveniente que el ADN se conserve en 16 Herramientas
moleculares aplicadas en ecología soluciones con baja concentración de sales para
inhibir la acción de DNasas contaminantes. (Laura Alejos et al. 2014)
Comparación de extracción de ADN con Kit y Extracción de ADN casero:
Hicimos un cuadro comparativo para facilitar la verificación de ello. (figura W)
PROCESOS Extracción de ADN con Extracción de ADN
Kit casero
Recolección de muestras Selección cuidadosa Selección poco exigente
Preparaciones previas Ninguna Liquido de
extracción
Remover la pulpa
de la piel de las
frutas
Materiales Kit de ADN especializado Elementos básicos de la
cocina, exceptuando el
agua destilada que no es
tan necesaria o el alcohol
al 96%
Extracción de ADN Protocolo en un nivel más Protocolo de un nivel fácil,
complicado, se hacen más pocos pasos y un tiempo
pasos y toma mucho más máximo de 45 minutos.
tiempo de casi 5 horas En
el comercial y en el
tradicional hasta días.
Almacenamiento de ADN Se puede almacenar el No se puede almacenar ya
ADN, para próximas que es un ADN impuro
comparaciones porque es que quizás tiene alguna
un ADN puro y limpio que otra proteína
Figura W: comparación resumida de una extracción con Kit y una extracción casera de ADN.
7. Conclusión. -
Al realizar el procedimiento adecuadamente, resulta que las fibrillas de ADN
comenzaron a salir, de un color blanco precipitado por sobre el alcohol (mezcla
Heterogénea). El ADN se precipita en el alcohol fuera de la solución, donde puede ser
visto. Además de permitirnos ver el ADN, el alcohol separa el ADN de otros
componentes celulares. Resta por obtener y sacar del tubo de ensayo el ADN ya que
cuando traté de sacarlo con un hisopo se rompió y ya no pude sacar más. Sin embargo,
encontré otros factores que afectan el rendimiento, calidad y pureza del ADN:
Cantidad de material de partida
Número de copias de las moléculas de ADN
Cantidad de tejido.
Condiciones en las que se encuentra el material de inicio (fresco, congelado,
fijado)
Contaminantes e interferentes en el material biológico
La extracción de ADN íntegro y sin contaminantes es esencial para tener éxito en la
obtención de datos genéticos, es el primer paso en la lista de técnicas moleculares que
nos llevarán a comprender mejor y conservar la diversidad biológica a partir del
conocimiento de genes y genomas que anteriormente era inaccesible para le ecología y
la evolución. Uno de los objetivos principales de los métodos modernos de extracción es
automatizar el proceso, mediante el uso de kits y extractores automáticos robotizados
con la mínima intervención de operadores, que permitan mejorar la precisión, obtener
resultados reproducibles y reducir el tiempo de extracción, en particular cuando se
requiere procesar una gran cantidad de muestras. También encontramos factores que
afectan el rendimiento:
Poco factible por los múltiples pasos y el uso de solventes corrosivos
(tradicional)
Poco frecuente si se siguen los pasos y cantidades recomendadas por el
fabricante (Comercial)
Se requiere experiencia para evitar que el ADN se fragmente (tradicional)
Entonces podemos concluir que en esos aspectos el protocolo tradicional nos trae más
complicaciones por el tiempo y los solventes corrosivo, sin embargo, en costo el
protocolo comercial es mucho mas caro.
8. Referencias (bibliografía, web grafía):
Aras S., A. Duran y G. Yenilmez. 2003. Isolation of DNA for RAPD analysis from dry
Leaf material of some Hesperis L. Specimens. Plant Molecular Biology 21: 461a–461f.
Avise J. C. 2004. Molecular markers, natural histori and evolution. Sinauer Associates,
Inc. Publishers. Massachusetts, EE.UU.
Boom R., C. J. Sol, M.M. Salimans, C.L. Jansen, P.M. Wertheim-van Dillen y N. J. Van
Der. 1990. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. Journal of
Clinical Microbiology 28: 495-503.
Guinn G. 1966. Extraction of nucleic acids from lyophilized plant material. Plant
Physiology 41: 689-695
José R. Alonso Neurobiólogo. Catedrático de la Universidad de Salamanca. Escritor.
Articulo “El genoma del tomate” recuperado de : https://jralonso.es/2013/01/24/el-
genoma-del-tomate/
Laura Patricia Alejos Velázquez, María del Consuelo Aragón Martínez, Amelia Cornejo
Romero (2014) “Extracción y purificación de ADN” recuperado de:
http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones2/libros/710/extraccion.pdf
Sambrook J., E. F. Fritsch y T. Maniatis. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory
Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, EE.UU
Stulnig T. M. y A. Amberger. 1994. Exposing contaminating phenol in nucleic acid
preparations. BioTechniques 16: 402-404
