Carolina Chinestra

Pablo Marinangeli

El Ing. Agr. (Mag) Pablo Marinangeli

es Profesor adjunto en el Área
Saneamiento
Producción Vegetal.
Carolina Chinestra es Licenciada en
Ciencias Biológicas
y detección de virus
Contacto: [email protected]
en Lilium
Los virus que infectan al Lilium pueden reducir el vigor de las plantas y generar síntomas que afectan el valor
comercial del producto, la vara floral. Las técnicas de diagnóstico y de saneamiento in vitro y micropropaga-
ción se integran a la producción comercial de bulbos.

E
l género Lilium perte- LSV y 1% de LMoV en los bulbos ba y Mendoza, y en regiones con
nece a la familia de las del stock de propagación II, los condiciones agroclimáticas favora-
Liliáceas y de él se bulbos importados para cultivo de bles como el noroeste de la provin-
cultivan especies e flor de corte pueden estar infecta- cia de Corrientes y Misiones. Ade-
híbridos para produc- dos. Este hecho ha sido corrobora- más, algunos productores de flor
ción de flor de corte, do en nuestro laboratorio, encon- multiplican sus propios bulbos.
plantas en maceta y jardinería. Son trándose baja proporción de infec-
plantas herbáceas perennes que ción de los tres virus en plantas Es importante destacar que en nin-
presentan bulbos escamosos como crecidas de bulbos importados. Si guno de los sitios de producción
órgano de reserva y perpetuación. estos bulbos son utilizados para mencionados se hace un segui-
Debido a que los híbridos comer- propagación, los virus serán trans- miento de la infección viral con eli-
ciales se propagan en forma vege- mitidos a la descendencia y muy minación de plantas sintomáticas a
tativa, si se parte de material infec- probablemente su incidencia campo (rouging) ni se controla la
tado con virus se producirá des- aumentará durante el cultivo. sanidad del material inicial.
cendencia igualmente enferma que Síntomas
aumenta en cada multiplicación. En nuestro país, la producción de
bulbos de Lilium es escasa y la Las infecciones virales en Lilium
Los virus más comunes que afec- industria de flores se provee de causan anormalidades del creci-
tan al género son Lily Symptomless bulbos importados, principalmente miento y desarrollo como reduc-
Virus (LSV, género Carlavirus), Lily de Holanda. Sin embargo, su culti- ción del porte, flores más peque-
Mottle Virus (LMoV, género Potyvi- vo se está expandiendo. La región ñas y deformes y menor rendimien-
rus) y Cucumber Mosaic Virus de producción de bulbos más to de bulbos. Los síntomas difieren
(CMV, género Cucumovirus). Han importante es el noroeste de la pro- en severidad de acuerdo al virus
sido identificados en Asia, Australia, vincia del Chubut. Recientemente, presente, a la susceptibilidad y
Europa y Estados Unidos (Asjes, algunos pequeños productores han sensibilidad de la cultivar y a las
1998). En la Argentina se ha detec- iniciado la producción en el sur de condiciones de crecimiento, ya sea
tado la presencia de los tres virus la provincia de Buenos Aires y en a campo o invernáculo. Cuando se
nombrados, con diferente inciden- Malargüe, Mendoza. Los producto- producen flores de corte en inver-
cia según las localidades e híbridos res multiplican bulbos de híbridos náculo, los síntomas se hacen más
analizados. antiguos e incorporan los nuevos evidentes, particularmente bajo
desde Holanda. Los bulbos produ- condiciones ambientales desfavo-
Dado que la Organización Europea cidos en estas regiones son vendi- rables, siendo esta sintomatología
y Mediterránea para la Protección dos a productores de flor de corte la responsable de la reducción del
de las Plantas (EPPO) en el pro- en todo el país, que están localiza- valor comercial del producto.
grama de certificación de bulbos de dos cerca de grandes centros urba-
Lilium considera como aceptable nos, por ej. provincia de Buenos El LSV usualmente no causa sínto-
un porcentaje de hasta 10% de Aires, Santa Fe, Tucumán, Córdo- mas o éstos son muy leves. Oca-

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sionalmente, las hojas muestran Obtención de plantas El tratamiento de termoterapia con-
clorosis en las nervaduras (Figura libres de virus siste en la exposición de plantas u
1-A). Sin embargo, puede provocar órganos a altas (30-40º C) o bajas
síntomas severos en infecciones En un programa de producción de (5-15º C) temperaturas. General-
mixtas. Los síntomas causados por bulbos de alta calidad es esencial mente se utiliza en combinación
disponer de material saneado de con cultivo de meristemas realizán-
LMoV pueden variar entre clorosis
virus. El cultivo de meristemas con dolo previamente, ya que si bien
en nervaduras, moteado y/o mosai-
o sin tratamiento previo de termote- permite reducir la concentración
co (Figura 1-B y C), bandas cloróti- rapia in vitro ha sido exitoso para
cas, curvado y manchas necróticas viral, al volver a la temperatura ini-
sanear diferentes genotipos de cial aumenta nuevamente dicha
en las hojas. Algunas cultivares Lilium infectados con los tres virus.
pueden presentar quebrado de concentración.
Asimismo, puede asociarse el culti-
color, malformación y asimetría en vo de meristemas y/o termoterapia
La exposición a altas temperaturas
las flores. Los síntomas del CMV a tratamientos con compuestos
antivirales, la quimioterapia. por períodos prolongados puede
en algunas ocasiones son indistin-
causar daños en los tejidos. Como
guibles con respecto a los provoca-
El cultivo de meristemas consiste posibles alternativas pueden reali-
dos por el LMoV. zarse pretratamientos de altas tem-
en el aislamiento y cultivo in vitro
del domo meristemático acompa- peraturas, así como alternancia de
En presencia de co-infecciones, los temperaturas por cortos períodos.
ñado por uno o dos primordios
síntomas suelen ser de mayor foliares, en medio Murashige- La quimioterapia implica la utiliza-
severidad. Las hojas pueden Skoog sin reguladores de creci- ción de sustancias químicas que
madurar antes y los botones flora- miento, manteniéndose a 25º C disminuyen la concentración viral.
les y flores pueden senescer en con un fotoperíodo de 16 horas luz La más utilizada es la ribavirina, un
forma prematura. y 8 horas oscuridad. análogo de guanina que actúa blo-

Pasturas Hortalizas
Híbridos
Cultivos Extensivos Césped
Sembrar Calidad es Asegurar Futuro

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queando la replicación se coloca el extracto
viral. Se debe considerar vegetal y se lleva a cabo
que puede producir toxici- la reacción inmunoenzi-
dad dependiendo de la mática, en la cual los anti-
dosis empleada. En gene- cuerpos se unirán a la
ral, se emplea en combi- cápside viral y la presen-
nación con cultivo de cia de la molécula de inte-
meristemas. rés se manifiesta a través
Una vez obtenidas las de la actividad de una
plantas libres de virus, se enzima sobre un sustrato
debe mantener una línea adecuado, que es detec-
madre que será fuente de tada por métodos colori-
propágulos para multipli- métricos. Otra técnica
cación. En esta etapa se serológica utilizada es
debe procurar que la rein- NC-ELISA o dot blot, que
fección sea mínima o no Figura 1. Sintomatología de virus y fisiopatías en Lilium se realiza colocando una
tenga lugar. Esto se logra spp. A- Estrías cloróticas en plantas del híbrido longiflo- gota del extracto vegetal
por medio de la perpetua- rum Avita infectadas con LSV. B - Mosaico en hojas de
en membranas de nitro-
ción y conservación en plantas del híbrido longiflorum Avita infectadas con
celulosa previo a la reac-
cultivo in vitro, en inverná- LMoV. C - Moteado en hojas del híbrido oriental infecta-
ción inmunoenzimática,
culos o zonas aisladas de das con LMoV. D - Clorosis internerval causada por defi-
obteniendo una reacción
focos de contaminación. ciencia de hierro en híbrido oriental.
coloreada insoluble en
muestras infectadas. Esta
En el Laboratorio de Culti- La observación de síntomas permi- técnica se utilizó para la
vo de Tejidos del Departamento de te eliminar plantas que presentan detección de Lily symptomless
Agronomía de la Universidad infección viral evidente. Sin embar-
virus en Lilium evidenciando que
Nacional del Sur y CERZOS se han go, es un método impreciso, ya que
es 16 a 32 veces más sensible que
ajustado las técnicas descriptas y en ocasiones se eliminan plantas
el test DAS-ELISA. Asimismo, pre-
se continúan realizando ensayos que presentan anormalidades fisio-
senta la ventaja de permitir la sen-
que evalúan la eficiencia de la libe- lógicas, como la deficiencia de hie-
sibilización de las membranas de
ración de virus de cultivos de meris- rro, que no se deben confundir con
nitrocelulosa a campo, realizando
temas, asociado a termoterapia y/o los síntomas característicos de
las pruebas de laboratorio luego de
quimioterapia ex vitro e in vitro, con infección viral (Figura 1-D).
cierto tiempo.
la finalidad de seguir optimizando
las metodologías.
Los métodos serológicos se basan Por medio de microscopía electró-
en la especificidad de la reacción nica se ha podido observar la mor-
Diagnóstico de virus
antígeno-anticuerpo, en la cual un fología de los viriones. También es
anticuerpo reconoce y se combina posible estudiar la citopatología por
Es necesario contar con herra-
con la porción específica del antí- medio del estudio de cortes ultrafi-
mientas para evaluar la presencia
geno que le dio origen, especial- nos, evidenciando en el citoplasma
de virus en las plantas obtenidas
mente proteínas de la cápside pro- la presencia de estructuras conoci-
luego de la etapa de saneamiento
teica del virus. Son métodos apro- das como “pinwheels”, característi-
in vitro, así como para realizar aná-
lisis periódicos de las plantas a piados para la evaluación de un cas de potyvirus en el caso de
campo (indexing). gran número de plantas. infección con LMoV.

Dentro de los métodos generales Dentro de las técnicas serológicas La reacción en cadena de la poli-
de detección de virus se pueden que se han empleado para diag- merasa posterior a la reacción de
mencionar la observación de sínto- nóstico de virus en Lilium se pue- transcripción reversa (RT-PCR) es
mas, el serodiagnóstico o diagnós- den mencionar DAS- ELISA (dou- ampliamente utilizada para el diag-
tico inmunológico, la visualización ble sandwich antibody-enzyme nóstico de virus de ARN, donde es
por microscopía electrónica y las linked immunosorbent assay), que necesario obtener una cadena de
técnicas moleculares. se realiza generalmente en placas ADNc previo a la amplificación por
de poliestireno de 96 pocillos donde medio de la enzima DNA polimera-

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sa. El LSV, LMoV y CMV son virus Esquema para la producción de Alcances del ajuste y
de ARN de cadena positiva, por lo plantas libres de virus aplicación de biotécnicas para
que el ARN viral actúa como ARN la obtención de bulbos de
mensajero. Se han realizado com- La EPPO presenta un esquema de sanidad controlada
paraciones entre técnicas molecu- los pasos necesarios para asegu-
lares y serológicas para el diagnós- rar un estándar de plantas de Lilium La generación de tecnología pro-
tico de virus en Lilium observándo- libres de virus. En la Tabla 1 se pia para la producción de bulbos
se que las primeras presentan una resumen las evaluaciones requeri- de Lilium libres de virus se presen-
mayor sensibilidad. También se han das para los tres virus en cada una ta ante la necesidad de sustituir la
aplicado microarrays, que consis- de las etapas de propagación. importación de bulbos como insu-
ten en un conjunto de sondas mole- mo para la producción de flor, con
culares fijas de manera ordenada a Si bien a nivel nacional no existe bulbos producidos en el país, de
una superficie sólida que se utilizan una reglamentación para la impor- alta calidad y a menor costo. De
para detectar diferentes secuencias tación u obtención de material de esta manera se beneficiaría direc-
genéticas de interés. La detección Lilium certificado como libre de tamente esta actividad, además
simultánea de LSV, LMoV y CMV virus, es recomendable la utiliza- de generar un nuevo producto
en Lilium spp. se logró por medio ción de material saneado para la exportable.
de la hibridación de secuencias propagación a campo, ya que la
específicas de los virus a sus utilización de material infectado Es importante destacar que la
secuencias complementarias, fijas incrementará el número de plan- obtención de plantas libres de
a una membrana de nylon. La tas que sirvan como fuente de virus sólo es posible a través de
mayor sensibilidad de estas técni- inóculo en el cultivo siguiente. cultivo in vitro previo a la etapa de
cas permite la detección de los propagación y que esta tecnología
virus aun en muy bajas concentra- La utilización de material libre de no se está aplicando para Lilium
ciones, posibilitando el diagnóstico virus puede implicar un mayor en nuestro país, al igual que la
tiempo y costo inicial; sin embar-
temprano, especialmente en las detección de virus. Así, una condi-
go, permite la obtención de mate-
plantas no saneadas durante el ción indispensable para la produc-
rial de mayor calidad.
cultivo de meristemas, facilitando ción comercial de bulbos es contar
así el descarte del material infecta- con un sistema de saneamiento
En el Laboratorio de Cultivo de
do y la reducción de costos. En el de virus y de monitoreo de los cul-
Tejidos del Departamento de Agro-
Laboratorio de Cultivo de Tejidos tivos. El ajuste de estas técnicas
nomía y CERZOS se han integra-
del Departamento de Agronomía y permitiría garantizar un producto
do las etapas de cultivo de meris-
CERZOS se está trabajando con temas y exámenes de presencia apto para el mercado interno de
técnicas de diagnóstico de virus en de virus a un sistema de micropro- flor de corte y para la exportación.
Lilium spp. para la detección en pagación en oscuridad, permitien-
fase de cultivo y durante la etapa de do lograr una alta eficiencia en la
saneamiento. producción de material elite libre
de virus (Figura 2).
Saneamiento

Termoterapia Cultivo de
meristemas

Bulbo madre Seccionado Indexing

de escama
Bulbificación
Indexing

Descamado Crecimiento
Micropropagación

Bulbificación
Indexing

Figura 2. Esquema de sanea-

Microbulbo
miento in vitro acoplado al pro- Indexing

tocolo de micropropagación en
oscuridad desarrollado en el
Laboratorio de Cultivo de Teji-
dos del Departamento de
Agronomía de la Universidad
Nacional del Sur y CERZOS. Crecimiento es vitro