PRÁCTICA NO.
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LAB. DE BIOQUÍMICA II
REACCIÓN DE LA PEROXIDASA Y DE LA POLIFENOL OXIDASA
Revisar los siguientes conceptos antes de realizar la práctica:
- Oxidaciones biológicas
- Formación de complejos
- Oxidaciones anaerobias
El alumno conocerá lo que es un extracto libre de células y cómo se pueden
probar actividades enzimáticas.
OBJETIVO
Determinar la actividad enzimática de la Peroxidasa y la Polifenol Oxidasa,
obtenidas a partir de un extracto libre de células (extracto crudo) de la papa.
MATERIAL NECESARIO
- 15 tubos de ensaye de 13 x 100 - 1 gradilla
- 3 vasos de precipitados de 250 ml. - 1 pinza para tubo de ensaye
- 1 vaso de precipitados de 500 ml - 4 pipetas de 1 mL
- 1 mechero, tripié y tela de asbesto - 1 pipeta de 5 mL
- 1 varilla de vidrio o agitador - 1 cuba
- peseta, escobetilla
Cada equipo se responsabilizará de traer a la práctica:
Hielo
Encendedor
Una papa chica
Pelador de papa
Rallador de papa
PROCEDIMIENTO
1. Coloque el hielo en la cuba y ponga ahí bien sumergido un vaso de precipitados
de 250 mL con 100 mL de agua destilada. Debe enfriar el agua, por lo menos
10 min.
2. Lave y pele una papa chica. Rállela directamente al agua fría contenida en el
vaso de precipitados que está en la cuba con hielo. Esta operación debe
realizarse lo más rápidamente posible, de lo contrario se obtendrá un extracto
ya oscuro.
3. Deje reposar por 10 minutos, agitando suavemente en forma ocasional
(mientras puede llevar a cabo los puntos 6-12). Sumerja en el hielo el otro vaso
de precipitados de 250 mL.
4. Filtre la mezcla a través de una gasa doble (proporcionada por el instructor),
directamente al vaso de precipitados vacío que se encuentro en el hielo.
Exprima la pulpa lo mejor posible y vacíela en el cesto de basura.
5. Deje reposar el filtrado unos cinco minutos para que el almidón se asiente en el
fondo. Decante el líquido al otro vaso de precipitados y colóquelo en el baño de
hielo. Debe obtener por lo menos unos 50 mL de extracto, al que llamaremos
“extracto de papa”, que debe quedar suficientemente claro.
Esta es una manera sencilla de obtener un: Extracto crudo
6. Con el tripié, tela de asbestos y mechero, prepare un baño de agua hirviendo.
Use agua destilada.
7. Adicione 5 mL de extracto de papa a dos tubos de ensaye sin etiquetar y
caliéntelos por cinco minutos en el baño de agua hirviendo. Enfríelos con agua
de la llave.
8. Coloque en la gradilla 13 tubos de ensaye de 13 x 100 mm y numérelos para su
identificación.
9. Adicione 0.5 mL de catecol al 1% a los tubos 1, 2, 3, 4 y 11.
10. Adicione 0.5 mL de pirogalol al 1% a los tubos 5, 6, 7, 8 y 12.
11. Adicione 2.0 mL de tirosina al 1% a los tubos 9 y 10.
12. Adicione 0.5 mL de peróxido de hidrógeno (H 2O2) al 3% a los tubos 2, 4, 6, 8,
10, 11 y 12.
13. Agregue 5 gotas de cianuro de sodio al 5% a los tubos 7 y 8.
14. Adicione 5 mL de agua destilada a los tubos 11 y 12.
15. Agregue el extracto de papa hervido previamente en el paso 7 a los tubos 3 y
4.
16. Adicione 5 mL del extracto de papa crudo a los tubos 1, 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10 y
13. Anote el tiempo.
17. Mezcle el contenido en cada uno de los tubos, déjelos reposar a temperatura
ambiente, tome nota del tiempo. Observe y anote los cambios de color a los 2, 5
y 10 minutos.
En esta parte aprendió a observar a través de cambios de color, las actividades de
las enzimas:
Peroxidasa y Polifenol oxidasa .
DATOS EXPERIMENTALES OBTENIDOS
- Haga un cuadro resumen de las reacciones de la Peroxidasa y la Polifenol
oxidasa donde se vea claramente los reactantes que contenía cada tubo y la
cantidad en que estaban. En ese mismo cuadro anote cuál fue la reacción de las
enzimas en cada uno de los tubos a los distintos tiempos.
¿Observó la misma actividad en todos los tubos?
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¿Cuáles fueron los tubos que tuvieron reacción negativa y por qué?
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¿Qué inhibidores de actividad enzimática se usaron en esta prueba?
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¿En cuánto tiempo se considera que la reacción terminó?
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FUNDAMENTO DE LAS REACCIONES
Fundamento de la reacción de la Peroxidasa:
Fundamento de la reacción de la Polifenol Oxidasa:
CUESTIONARIO
1. Suponiendo que las dos enzimas vienen en la misma fuente, el “Extracto de
papa”, ¿Cómo distinguimos las reacciones individuales?
2. ¿Cuál es la razón de la diferencia de color con los diferentes sustratos?
3. ¿Por qué las manipulaciones para la preparación del “extracto de papa” deben
llevarse a cabo a baja temperatura?
LECTURA COMPLEMENTARIA
Peroxidasa
La Peroxidasa es una homoproteína altamente específica para el aceptor de
hidrógeno, que es el peróxido de hidrógeno, pero es muy inespecífica en cuanto al
sustrato donador que utiliza, que puede ser una de muchas sustancias, por
ejemplo: fenoles, aminofenoles, diaminas, indofenoles, leucocolorantes, ascorbato
e incluso ciertos aminoácidos como la tirosina.
La reacción se puede describir de la siguiente manera:
Donador reducido + H2O2 Donador oxidado + 2 H2O
Esta enzima se encuentra en la mayoría de las plantas y en ciertos
microorganismos, pero es escasa en tejidos animales. Se observa la actividad de
Peroxidasa en la leche, en los leucocitos, en la placenta, etcétera. Una de las
formas más activas es la Peroxidasa del rábano.
El mecanismo de acción es sumamente parecido al que se propone para la
catalasa, a través de la formación de un complejo. Más aún, en este caso son
diversos los complejos que se forman entre la enzima y el peróxido de hidrógeno,
antes de que sea capaz de reaccionar con el donador reducido.
La Peroxidasa (E.C. [Link]) que se obtiene del rábano tiene una masa molecular
de 40,000 Daltones, mientras que la que se obtiene de la leche tiene una masa
molecular de 80,000.
Polifenol Oxidasa
La Polifenol Oxidasa (E.C. [Link]) recibe muchos nombres debido a la gran
diversidad de sustratos que emplea. Técnicamente es una o-difenol: Oxígeno
Reductasa. Su reacción se puede describir de la siguiente manera.
2 o-difenol + O2 2 o-quinona + 2 H2O
Esta enzima puede llevar a cabo la oxidación directa aerobia de compuestos mono
y difenoles (tirosina, fenol, p-cresol, 3,4-dimetilfenol, 4-t-butifenol). De ahí que
reciba también los nombres de Tirosinasa, Fenolasa, Cresolasa, etc. Es una
enzima de masa molecular de 120,000 Daltons, con un centro de cobre.
La Polifenol Oxidasa de la papa ataca a los siguientes compuestos en orden de
mayor a menor actividad: ácido clorogénico, catecol, quercitina, pirogalol, ácido
caféico, p-cresol, tirosina, esculetina. Las quinonas resultantes de la reacción de la
Polifenol Oxidasa pueden continuar oxidándose y polimerizándose para dar
compuestos finales que son muy complejos y coloridos.
La Polifenol Oxidasa es una de las enzimas responsables del oscurecimiento de
ciertos alimentos como la papa, la manzana, el aguacate, etc., al contacto con el
oxígeno atmosférico. En el caso de la tirosina como sustrato, el complejo
resultante es la melanina o pigmento oscuro de la piel y el cabello. En este caso,
la tirosina se oxida primero a dihidroxifenilalanina (DOPA), que luego se cicliza y
se oxida a indol-5,6-quinona. Esta última se polimeriza a melanina.
Es difícil distinguir las actividades de las dos enzimas a partir de la misma fuente,
ya que ambas pueden atacar al os mismos sustratos. Sin embargo, utilizando
papa como fuente de las dos enzimas, la acción de la Peroxidasa es mucho más
rápida, lo que puede permitir la observación de las dos acciones.
Es necesario hacer las operaciones lo más rápidamente posible y hacerlo sobre
hielo para evitar que, una vez pelada la papa, el contacto con el oxígeno
atmosférico haga que las enzimas comiencen a actuar sobre los sustratos
normales de la papa y obtengamos un extracto oscuro. El extracto sólo se
oscurece debido a que en la papa están las enzimas y los sustratos fenólicos que,
al contacto con el oxígeno atmosférico, comienzan a oxidarse.
