UNIVERSIDAD DE LOS LLANOS
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
TECNOLOGÍA EN REGENCIA DE FARMACIA
GRUPO: IMPAR SABADO
INFORME COLORACIONES
ESTUDIANTES:
NATALIA JINETH LARA URREA 136104113
BREIDY JHERLAY TABARES PAEZ 136104325
DAYFENIS JOFANNA FUENTES JIMENEZ 136104405
16 DE MARZO DEL 2021
INTRODUCCIÓN
En microbiología, dos herramientas básicas e imprescindibles utilizadas para el
diagnóstico de enfermedades infecciosas son el microscopio y las tinciones. El
primero, permite magnificar el tamaño y estructuras de los microorganismos para
que sean visibles al ojo humano y la segunda, permiten hacer visibles a los objetos
microscópicos y transparentes, revelar su forma y tamaño, así como hacer evidente
la presencia de estructuras internas y externas. De manera general, se denomina
tinción al proceso y resultado de teñir y, en el área de la Microbiología consiste en
teñir células o microorganismos. Se trata de una técnica empleada en los
laboratorios con el objeto de optimizar la visión de aquello que se observa a través
de un microscopio, por lo tanto, consiste en aplicar un colorante al material en
estudio para que resulte más simple detectar determinados microorganismos. (1)
Una de las limitaciones de la microscopía de campo claro es el escaso contraste y
por ello se pueden utilizar colorantes para teñir las células y aumentar así el
contraste facilitando su observación. Este tipo de preparaciones son las más
frecuentes, tanto las obtenidas directamente a partir de muestras clínicas como las
obtenidas a partir del desarrollo de cultivos. Los microorganismos, concretamente
las bacterias, pueden observarse directamente al microscopio de campo claro. Sin
embargo, debido al bajo contraste entre las células y su entorno, estos
procedimientos se utilizan en ocasiones muy limitadas. La tinción es un método
sencillo para incrementar el contraste entre la célula y su entorno y por lo tanto
contribuye a mejorar la imagen observada. (2)
1. Fundamentos teóricos
Los colorantes son soluciones que consisten en un solvente (generalmente agua o
etanol) y una molécula coloreada (obteniendo un derivado de benceno). La porción
del colorante que le da su color es el cromóforo. Un colorante puede tener múltiples
cromóforos, y cada cromóforo asume la intensidad del color. El auxocromo es la
porción cargada de un colorante y le permite actuar como tal a través de enlaces
iónicos o covalentes entre éste y la célula a teñir, los colorantes básicos (donde el
auxocromo se carga positivamente como resultado de ganar un ion hidrógeno o
perder un ion hidróxido) atraen las cargas negativas en la superficie de la mayoría
de las células bacterianas. Así, la célula adquiere color. Estos se aplican a los frotis
bacterianos que se han fijado por calor (3).
Las partes que conforman a un colorante Son:
Cromóforo: Responsable de otorgar color.
Auxocromo: Intensifica el color y mejora la afinidad el colorante.
Teñir supone una reacción de intercambio de iones de colorante a lugares activos
de la superficie o interior de las estructuras de la célula, esto permitirá contrastar
mucho más el microorganismo con respecto al medio que le rodea. Las tinciones
pueden ser: simples, diferenciales o selectivas (4).
En el siguiente cuadro sinóptico (Figura 1) se presentan de forma breve las tinciones
que se abordaran con mayor detalle a continuación:
Figura 1. Ejemplos de los tipos de tinciones.
Los colorantes son sustancias tóxicas, por lo tanto el proceso de la tinción
generalmente resulta letal para los microorganismos, provocando su inmovilización,
lo cual puede significar una ventaja o desventaja para el investigador. (5)
Al ocasionar la muerte de los microorganismos sometidos al proceso de tinción
se reducen las posibilidades de contaminación para el manipulador.
Los colorantes pueden ser tóxicos para el manipulador, algunos incluso han
resultado cancerígenos por lo que ha habido la necesidad de retirarlos del
mercado.
Algunos colorantes solo tienen afecto letal para determinadas especies o
géneros bacterianos, siendo utilizados como constituyentes de medios de
cultivo selectivo para impedir el desarrollo de microorganismos indeseables y
favorecer el desarrollo de las especies que nos interesa estudiar. Por ejemplo:
el verde de malaquita.
Otros se emplean como desinfectantes microbianos, más que para teñir, con
fines de microscopia, por sus propiedades bacterianas o bacteriostáticas.
Algunos tipos de colorantes son empleados no para teñir, sino como
indicadores de pH, formando parte de la composición de los medios de cultivo
para indicar los cambios de basicidad o acidez que se vayan produciendo en
el medio como consecuencia de su actividad metabólica. Ejemplo: rojo fenol,
azul de bromotimol, etc. (5)
2 Materiales y métodos experimentales
2.1 Materiales utilizados
MATERIAL APARATOS REACTIVOS
Y EQUIPO
Portaobjetos Microscopio Agua destilada
Cubreobjetos Cronometro Colorantes para tinción Shaeffer
Foulton - Fucsina de Gram
Goteros para cada
reactivo Colorantes para tinción - Shaeffer
Foulton Verde malaquita
Mechero Decolorante Ziehl
Papel absorbente Azul metileno de Ziehl
Asa bacteriológica Tinta China
Pinzas de madera Hipoclorito de sodio
Aceite de inmersión
Piseta
Alcohol Isopropilico
Aplicadores de
madera con algodón
Soporte para
coloración
2.2 Descripción breve de las técnicas o métodos experimentales utilizados
TINCIÓN DE GRAM
Se prepararon los materiales a usar en la práctica.
Se marcó la lámina portaobjetos.
Se froto una cápita del cultivo.
Se realizó el frotis, pasando en forma de rotación el hisopo sobre la lámina.
Luego se dejó secar.
Se fijó la muestra al calor pasándola 3 veces por la llama del mechero.
Se colocó la lámina sobre el soporte para realizar la técnica de tinción de
gram.
Luego se cubrió el frotis con cristal violeta dejando actuar durante 1 minuto.
Se lavó con agua de chorro y la escurrimos.
Se agregó el lugol de Gram y esta se dejó actuar durante 1 minuto.
Se lavó con agua de chorro y la escurrimos.
Luego se agregó alcohol etílico, la dejamos actuar durante 1 minuto hasta
que se obtuviera una decoloración total.
Se lavó con agua de chorro y la escurrimos.
Procedemos a cubrir el frotis con fucsina de Gram o safranina durante 30
segundos.
Se lavó con agua de chorro y la escurrimos para limpiar el exceso de
colorante en la parte de bajo de la lámina.
Finalmente se dejó secar a temperatura ambiente, para poder observar la
lámina en el microscopio.
TINCIÓN DE ZIEHL NEELSEN
Se cubrió el extendido con fucsina fenicada, se calentó durante 10
minutos, sin dejarla secar y se retiró cuando hubo vapor.
Se lavó con agua de chorro y la escurrimos.
Se le agrego alcohol acido, luego se dejó secar durante 3 minutos.
Se lavó nuevamente con agua de chorro y la escurrimos.
Se agregó azul de metileno y se dejó actuar durante 1 minuto, se lavó y
se escurrió.
Se limpió el exceso de colorante por debajo de la lámina, y se dejó secar
a temperatura ambiente.
Finalmente se observó la lámina en el microscopio.
TINCIÓN DE ESPORA
Se realizó el frotis de la cepa suministrada
Se cubrió el frotis con el verde de malaquita luego se pasó el hisopo hasta
la emisión de vapores durante 5 minutos.
Se lavó con agua y se escurrió
Se cubrió la preparación con fuscina de Gram, durante 1 minuto.
Se lavó con agua y se escurrió.
Se limpió el exceso de colorante por debajo de la lamina
Luego se dejó secar, para poder observar la lámina en el microscopio.
CÁPSULA – TECNICA DE TINTA CHINA
Se realizó el frotis de la cepa suministrada.
Se colocó una pequeña gota de tinta china en un extremo de la lámina, se
mezcló una asada del cultivo a examinar.
Se colocó otra lámina para lograr extender la gota de la tinta china hacia el
otro extremo de la lámina.
Se pasó el borde de la lámina extensora por el mechero.
Se dejó secar la coloración, luego se fijó pasándola suavemente por el
mechero.
Se procedió a cubrir la preparación de fucsina de Gram, durante 1 minuto.
Luego se lavó y se escurrió.
Finalmente se observó la lámina en el microscopio.
Resultados
3. Descripción de los resultados obtenidos
Tinción de Gram
Se observan coco, estafilococo,
diplococo, estreptococo de color
rosa Gram (-) negativos.
Se observan Bacilo,
estreptobacilo, Empalizada de
color rosa Gram (-) negativos.
Tinción de Ziehl Neelsen: Microbacterias
Se observan coco, estafilococo,
citoplasma, envoltura celular,
color azul, es decir, BAAR (-)
negativos.
Tinción de Shaefer Foulton: Espora
Las células son de color rosa y
las esporas son de color verde.
Se observa coco, diplococo.
estreptococo de color rosa y las
endoesporas de color verde.
Tinta China: Cápsula
Se observan las cápsulas como
una zona transparente sobre el
fondo oscuro. De forma: coco,
agrupación: diplococo,
estreptococo. Tinción positiva.
Cultivos del docente
Gram positiva, porque su color es
violeta, se dice que es una
bacteria bacillus ya que su
morfología es alarga y a la vez
ovalada.
En la imagen se observa una
bacteria estafilococo puesto que
están todas a una misma de
forma de coco, es gran negativa
ya que su color como se muestra
en la foto es rosado.
Esporas azules forma
metabólicamente inactiva y
altamente resistente.
Tinción positiva para
Crtyptococcus Neoformans. Se
observan un halo claro (cápsula)
alrededor del microorganismo
sobre un fondo oscuro, con
morfología estreptococo, tétrada
y Estaflococo
En la imagen se observa unas
bacterias bacillus, diplococos y
estafilococos, con esporas que se
observa son de color azul.
4. Tabla
TIPO DE TINCIÓN UTILIZACIÓN
Tinción de Gram Utiliza varios colorantes (cristal
violeta 1m, Yodo 1m, lavado con
alcohol, Safranina 30 seg)
Tinción de Ziehl Neelsen: identificación de patógenos, como
Microbacterias Mycobacterium tuberculosis causante
de la tuberculosis, que requiere de
tres (03) soluciones: Carbol Fucsina
Fenicada (Fucsina Básica), Azul de
Metileno al 1% y Solución
Decolorante
Tinción de Shaefer Foulton: Esporas Se usa verde de malaquita en
contraste con safranina.
Tinción de Cápsula Colorante tinta china, aquí se observa
microorganismos encapsulados
creando resistencias.
7. Análisis de los datos
Las tinciones utilizadas en el laboratorio de microbiología nos permiten el
diagnóstico claro y sugerente de los agentes infecciosos, por lo que juegan un papel
importante en la decisión del tratamiento inicial de las enfermedades infecciosas.
Como por ejemplo la enfermedad un conocido como “tuberculosis” entre otras. Se
debe practicar la tinción correcta de acuerdo con el agente infeccioso que se
sospecha y el tipo de muestra indicada. Las tinciones son herramientas
elementales, vigentes y de uso universal que nos ayudan a determinar una clara
enfermedad.
Cuestionarios
CUESTIONARIO POST-LABORATORIO N° 3
a) ¿A quiénes le recomienda el examen de la baciloscopia?
Las pruebas de BAAR se suelen pedir cuando una persona tiene síntomas de TB
activa. Detectan la presencia de bacterias BAAR en el esputo. El esputo es la
mucosidad espesa que expulsan los pulmones al toser. Es diferente de un
escupitajo o de la saliva, La tuberculosis es una infección bacteriana grave que
afecta principalmente a los pulmones. (6)
b) ¿Cuándo se solicita una baciloscopia?
La baciloscopia se solicita cuando se sospecha por los síntomas que presenta el
paciente, que puede existir una enfermedad, habitualmente la tuberculosis
pulmonar causada por una bacteria que se detecta en el esputo mediante su estudio
por dicha prueba. (6)
Imagen 2.Síntomas causadas por una bacteria.
c) ¿Cómo se interpreta una baciloscopia?
La baciloscopia detecta la presencia de bacterias con forma de bacilo
(cilíndricas), en una muestra de fluidos o tejidos del organismo, visualizando su
presencia mediante el microscopio óptico con la ayuda de determinadas
tinciones (colorantes). (7)
Imagen 2. Muestra de fluidos.
POST-LABORATORIO N°4
a) Cuál es el fundamento de la coloración de Shaeffer Foulton?
En la técnica de Shaeffer-Fulton el verde de malaquita entra a las células
vegetativas y al aplicar el calor, penetra en la endospora y también en las exosporas.
Al lavar con agua, el colorante se elimina de la célula vegetativa. (6)
Tinción de Espora: Shaefer Foulton. Bacterias que poseen espora confiere
resistencia:
Central como en los Bacillus
Subterminal en los Clostridium
Terminal en el Clostridium tetani
b) Porque la capsula la poseen solo algunas especies bacterianas?
La cápsula le sirve a las bacterias de cubierta protectora resistiendo la fagocitosis.
También se utiliza como depósito de alimentos y como lugar de eliminación de
sustancias de desecho. Protege de la desecación, ya que contiene una gran
cantidad de agua disponible en condiciones adversas. (7)
Imagen 3. Cápsula.
9. Discusión
En el desarrollo del informe, identificamos las diferentes cargas netas de las
estructuras celulares, ya que nos ayudó confirmar que un colorante acido se une a
estructuras de carga neta positiva y un colorante básico se une a estructuras de
carga neta negativa, dando así los colores característicos, y al compararlos con
imágenes de bibliografía utilizada, observamos resultados similares a los obtenidos.
Las muestras utilizadas en la tinción de gram se observó claramente en el
microscopio compuesto, en la primera muestra de gram se observó que toda la
población en la muestra fijo de cristal violeta y todas las células quedaron
completamente teñidas, adquiriendo una coloración rojo/rosado, lo cual nos permite
afirmar que de acuerdo a la base teórica de la tinción de gram, es una bacteria de
negativa de las muestras realizadas en el laboratorio por los alumnos, igualmente
con la otra tinción fue teñida un rosado claro, el color de safrinina utilizada como
colorante de contraste donde se determinó que es gram negativa.
Algunos factores pueden alterar los resultados de las observaciones en una tinción
de gram, factores como la edad del cultivo, el tiempo de coloración, el pH de los
colorantes, el tiempo de decoloración y de lavado, siendo los puntos críticos de la
edad del cultivo y el tiempo de coloración.
Las técnicas de coloración de Ziehl-Neelsen para micobacterias son conocidas
desde hace más de un siglo y han sido ampliamente difundidas (8). Varios
laboratorios de patología del país tienen dificultad para demostrar en los tejidos
estos BAAR, principalmente el M. leprae.
10. Análisis de los resultados obtenidos
Ya se han discutido métodos de clasificación por morfología y medios de cultivo. En
la práctica de laboratorio se utilizó tinciones con el fin de poder seguir
caracterizando la bacteria, done se adquirido conocimiento sobre cómo realizar un
estudio de bacterias y poder identificar formas morfológicas, si son gran positivas o
negativas coloraciones y también como se procesa una muestra de esputo en el
laboratorio y que reactivos se utilizan para determinar su estado si es negativo o
positivo.
11. Observaciones
Para la bioseguridad en el laboratorio es necesario contar con conocimientos
básicos sobre desinfección y esterilización. Haciendo referencia a esto, los
siguientes principios generales se aplican a todos los microorganismos patógenos
conocidos. Los requisitos particulares de la descontaminación dependerán del tipo
de trabajo experimental que se lleve a cabo y de la naturaleza de los agentes
infecciosos que se estén manipulando. En la desinfección y esterilización se
emplean diversos términos, algunos de los cuales se mencionarán a continuación:
(1)
• Descontaminación: Se refiere a todo proceso empleado para eliminar o matar
microorganismos. También se emplea para referirse a la eliminación o
neutralización de sustancias químicas peligrosas y materiales radioactivos.
Metodología
• Desinfección: Medio físico o químico para matar o eliminar microorganismos, pero
no necesariamente esporas.
• Desinfectante: Se refiere a toda sustancia o mezcla de sustancias químicas
empleada para matar o eliminar microorganismos, pero no necesariamente
esporas. Los desinfectantes suelen aplicarse a superficies u objetos inanimados.
• Esterilización: Se refiere a todo proceso que mata o elimina todas las clases de
microorganismos y esporas.
Es importante separar y envasar todos los residuos peligrosos biológicos
infecciosos, de acuerdo con sus características físicas y biológicas infecciosas. En
el caso de las extensiones y frotis para el examen microscópico, la fijación y tinción
de muestras de sangre, esputo y heces para el microscopio no destruye
necesariamente todos los organismos o virus de dichas extensiones, por lo que
éstas deben manipularse con pinzas, almacenarse cuidadosamente y
descontaminarse antes de ser eliminarlas, con excepción de aquellas que poseen
esporas, las cuales deberán desecharse directamente en el contenedor de residuos
peligrosos biológico infecciosos (RPBI) correspondiente sin previa
descontaminación. (1)
12. Conclusiones
Los colorantes se deben de encontrar en óptimas condiciones, ya que nos
pueden dar coloraciones defectuosas.
Los colorantes simples nos ayuda a identificar la morfología de cada célula,
mientras que los colorantes compuestos o neutros nos ayuda a poder
diferenciarlas.
Los colorantes tendrán afinidad a cada estructura celular, dependiendo de su
carga que presente, para una buena observación de células tanto una buena
toma de muestra como un buen extendido, evitando así algún tipo de células
sobrepuestas.
Es muy importante la utilización de mordientes, ya que permite fijar mejor los
colorantes, y así obtener una mejor coloración.
Gracias a la coloración de Gram podemos distinguir entre bacterias Gram (+) y
Gram (–). Es de gran importancia y mucha utilidad la tinción de Gram y de
Neelsen, ya que estas ocasionan un contraste al microorganismo y su medio
exterior, ya que nos facilitó la identificación de microorganismos con su
morfología.
13. Recomendaciones
Depositar los portaobjetos que contengan esporas de hongos o bacterias en un
contenedor adecuado para residuos peligrosos biológico infecciosos (RPBI). En
este caso corresponde depositarlos en un contenedor pequeño rojo de plástico
rígido (figura 4). Es importante mencionar que los contenedores pequeños son de
un único uso y únicamente deben ser cerrados hasta que estén llenos en su
totalidad. (1)
Imagen 4. Depositando portaobjetos en Imagen 5. Inactivación de residuos.
contenedor rojo pequeño de plástico rígido.
Una vez realizada la esterilización de los materiales, éstos deben dejarse enfriar
para lavar aquellos que lo requieran, por ejemplo, los tubos de ensayo de vidrio que
contenían las cepas. Para el caso de los medios que contenían las cepas serán
desechados en bolsas de plástico para colocar en la basura común (figura 6).
Imagen 6. Colocación de bolsa
negra en basura común.
Para comprender mejor el manejo de los Residuos Peligrosos Biológico-Infecciosos,
se presenta un esquema en el que se muestran los pasos para el proceso del
manejo de estos, desde la identificación de los residuos hasta su disposición final
(figura 7). (1)
Imagen 7. Proceso de manejo de los residuos
peligrosos biológico infecciosos (RPBI).
REFERENCIAS
1. González, R. Cuevas, B. Cortés, M. Orduña, M. (2020). Las tinciones
básicas en el laboratorio de microbiología: Un enfoque gráfico. Material
no publicado. Recuperado en noviembre de 2020, de
https://www.zaragoza.unam.mx/wp-
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2. Microbiología facultad de ingeniería ambiental y recursos naturales.
(2016, enero). Observación e identificación microscópica de bacterias
examen directo y coloración simple. Mensaje publicado en
https://es.scribd.com/document/316132318/Microbiologia-Informe-3-
COLORACIONE
3. Lebofe MJ, Pierce BE. Microbiology: Laboratory Theory and applicaton,
essentals. 3th ed. United States of America: Morton publishing; 2008.
4. Repizzo, S. (2010). Uso del microondas para esterilización de alimentos
y medios de cultivos nutritivos no selectivos. (Trabajo de grado).
Universidad Javeriana, Bogotá. Recuperada de
https://repository.javeriana.edu.co/bitstream/handle/10554/8649/tesis604
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5. Savia - Análisis Clínicos. (02/julio/2019). Prueba diagnóstica mediante la
cual se identifican y observan mediante un microscopio. Mensaje
publicado en https://www.saludsavia.com/contenidos-salud/otros-
contenidos/baciloscopia
6. Métodos Tinciones. (2021). Tinción de esporas (técnica de Shaeffer-
Ffulton). Mensaje publicado en https://www.ugr.es/~pomif/pom-bac/pb-
iii/pb-iii-3-esporas.htm
7. Cápsula microbiología. (2021). Capa rígida organizada en matriz
impermeable que excluye colorantes como la tinta china. Mensaje
publicado en
https://es.wikipedia.org/wiki/C%C3%A1psula_(microbiolog%C3%ADa)
8. Naranjo, P. Rodríguez, G. Rodríguez, J. Caldas, M. (1988). La coloración
de Ziehl-Neelsen en histopatología. Mensaje publicado en
file:///C:/Users/drogu/Downloads/1964-
Texto%20del%20manuscrito%20completo%20(cuadros%20y%20figuras
%20insertos)-7352-1-10-20130819.pdf
