Tinción de Gram
Nuestra profesora Susana Estrada nos explica la técnica Tinción de Gram,
cuyo conocimiento es imprescindible tanto para los alumnos de Técnico de
Dietética como para los alumnos de Técnico Superior de Laboratorio Clínico
y Biomédico.
¿En qué consiste la Tinción de Gram?
o Material necesario:
o Procedimiento Tinción de Gram
o Vídeo explicativo
¿En qué consiste la Tinción de Gram?
La Tinción de Gram consiste en una técnica de laboratorio diseñada por
Christian Gramen el año 1884. El objetivo de Gram era conseguir una
prueba con la que fuera posible diferenciar diferentes grupos de bacterias
para así poder estudiarlas y clasificarlas.
Según la distribución del peptidoglicano de la pared celular que las
envuelve, se tiñen de una forma u otra.
Así, las bacterias que no se tiñen mediante esta técnica se denominan
Gram negativas. Están formadas por una pared más fina formada por
menos capas de peptidoglicano y una segunda membrana rica en lípidos
(que repele la tinción Gram), al microscopio aparecen incoloras.
El cristal violeta se une a la pared bacteriana y se estabiliza con el lugol. La
mezcla alcohol-acetona disuelve la membrana externa de las bacterias
Gram negativas (más fina que la de las Gram positivas) extrayéndose el
cristal violeta. Después se tiñen solo las Gram negativas con safranina.
Material necesario:
Placa Petri con agar chocolate
Asa de siembra o material estéril para sembrar
Mechero de alcohol
Agua destilada
Colorantes de tinción Gram (cristal violeta, lugol, alcohol-acetona 1:1,
safranina)
Cristalizador y varillas de tinción
Portaobjetos
Alcohol 96º
Papel secante
Microscopio óptico
Procedimiento Tinción de Gram
En primer lugar, para realizar una tinción, lo que tenemos que tener son
microorganismos sembrados. Dichos microorganismos los hemos el día
anterior mediante la técnica de siembra de estría múltiple, los hemos dejado
incubar durante 24 horas a 37ºC en la incubadora para así obtener las
colonias de los diferentes microorganismos. En este caso son
microorganismos de la orofaringe.
Siempre que “destapemos” una placa con colonias, deberá hacerse en
condiciones de esterilidad. Para conseguir estas condiciones podemos
utilizar un mechero Bunsen o un mechero de alcohol. Con el mechero,
conseguiremos que se forme un ambiente de esterilidad alrededor de la
llama, por lo tanto, si trabajamos cerca del mechero, tendremos un
ambiente estéril.
A la hora de comenzar con la tinción, lo primero que hay que realizar es un
frotis del microorganismo, para ello hay que añadir una gota pequeña de
agua destilada (cuanto mayor sea la gota, tardará más tiempo en secarse).
Debemos coger la muestra con el asa bacteriológica previamente
esterilizada. Para ello encendemos el mechero de alcohol y ponemos el asa
en posición vertical encima del mechero hasta que el hilo del extremo del
asa se quede totalmente incandescente.
Después debemos esperar a que se enfríe porque si tocamos con el hilo
incandescente las colonias podemos matar al microorganismo.
Abrimos la placa con las bacterias y con el asa tocamos en el agar para
comprobar que éste está frío.
A continuación, cogemos unas colonias de las bacterias y las extendemos
sobre la gota de agua destilada.
Una vez extendido, volvemos a esterilizar el asa, ya que todo material debe
ser esterilizado antes de volver a ser guardado. A continuación, lo que
tenemos que hacer es fijar la muestra, la cual se puede fijar con metanol o
se puede fijar con calor. En este caso utilizaremos la fijación por calor.
Tenemos que hacer movimientos circulares o en zig zag por encima de la
llama del mechero, levantando constantemente la muestra para que no se
nos queme el tiempo suficiente para que la muestra quede totalmente seca
y por lo tanto fijada.
Una vez fijada la muestra apagamos el mechero por seguridad.
Ahora, vamos a teñir nuestra siembra de microorganismos en el portaobjeto
con diferentes tipos de tinciones para poder visualizar cada microorganismo
(bacteria) al microscopio.
Las tinciones se realizan en un cristalizador, también utilizamos varillas de
tinciones y el porta con la muestra.
Vamos a utilizar diferentes reactivos para la tinción. En primer lugar el cristal
violeta, en segundo lugar el lugol,
usaremos también alcohol de 96º (el decolorante puede estar formado por
una mezcla de alcohol, alcohol-acetona y por diferentes mezclas),
y por último la safranina.
¿Qué va a ocurrir? Las bacterias gram positivas y las bacterias gram
negativas tienen diferente grosor en el peptidoglicano de su pared celular,
de tal forma que cuando echemos el cristal violeta se nos van a teñir tanto
las gram positivas como las gram negativas. El lugol lo que hará, será fijar el
colorante del cristal violeta a las bacterias, con el alcohol (o mezcla
decolorante), lo que haremos será eliminar el cristal violeta de las gram
negativas y por último, la safranina, va a teñir solamente a las gram
negativas que son las que están decoloradas. Por lo tanto, las gram
positivas estarán teñidas de cristal violeta y las gram negativas de safranina
(color fucsia).
El protocolo será aplicar a las bacterias fijadas cristal violeta durante un
minuto, luego lavar con el frasco lavador. A continuación, añadir lugol
durante un minuto, volver a lavar con el frasco lavador. Después, añadir
durante 10 o 15 segundos la mezcla de alcohol o alcohol-acetona…, lavar la
muestra con el frasco lavador. Y finalmente, añadir safranina durante un
minuto y lavar con agua destilada.
Por lo tanto, tal y como hemos dicho, aplicamos el cristal violeta.
Una vez que ha transcurrido el minuto lo lavamos con agua destilada.
Ahora vamos a añadir el lugol justo por encima de la zona de la muestra y
esperamos otro minuto.
Ya ha transcurrido el minuto y lavamos con agua destilada. A continuación
decoloraremos la muestra con el alcohol. Para conseguirlo hay que
incorporar el porta de un lado para ir añadiendo el alcohol y que vaya
resbalando para abajo. Cada protocolo estipula un tiempo pero con 15
segundos aproximadamente la muestra quedará decolorada.
Tras los 15 segundos de decoloración, aclararemos con agua destilada para
que el alcohol no siga actuación, porque si no paramos el proceso de
decoloración a tiempo, todas las bacteria quedarían decoloradas, no
solamente las gram negativas y por lo tanto no podríamos diferenciar unas
de otras.
Por último, aplicamos a la muestra la safranina y lo dejamos actuar durante
otro minuto.
Transcurrido el minuto, volvemos a aclarar la muestra con agua destilada y
dejaríamos que la muestra se secara.
Posteriormente observaremos la muestra con el microscopio.
Vídeo explicativo
