TALLER PRÁCTICO: GENÉTICA
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EXTRACCIÓN DE ADN
Docente: Alvaro Miranda Guevara
Presentado por: Milton Martinez Herrera
Miguel Mendoza Ahumada
1- Introducción.
La aplicación de técnicas moleculares inicia con la extracción de ADN y la
obtención exitosa de datos confiables y reproducibles depende, en gran medida,
de la extracción de ADN íntegro y puro. La extracción consiste en el aislamiento y
purificación de moléculas de ADN y se basa en las características fisicoquímicas
de la molécula. El ADN está constituido por dos cadenas de nucleótidos unidas
entre sí formando una doble hélice. Los nucleótidos están integrados por un
azúcar (desoxirribosa), un grupo fosfato y una base nitrogenada (adenina,
guanina, timina o citosina). La unión de los nucleótidos ocurre entre el grupo
fosfato y el azúcar, mediante enlaces fosfodiéster, dando lugar al esqueleto de la
molécula. Las bases de cadenas
opuestas se unen mediante puentes de hidrógeno y mantienen estable la
estructura helicoidal.
A lo largo del tiempo se han diseñado distintos protocolos con la finalidad de
obtener una cantidad y calidad de ADN adecuados, así como garantizar la
eliminación de inhibidores potenciales que dificulten el tratamiento posterior de la
molécula. Los métodos tradicionales, desarrollados en los años 50, utilizan
solventes orgánicos para separar a las proteínas del ADN y, una vez suspendido
en la fase acuosa, aislarlo por precipitación con etanol. Estos métodos
requieren preparar soluciones y la extracción puede tomar desde unas horas
hasta varios días por los numerosos pasos que deben realizarse. En general, los
protocolos tradicionales consisten de cinco etapas principales: homogeneización
del tejido, lisis celular, separación de proteínas y lípidos, precipitación y
redisolución del ADN.
2- Objetivos.
Reconocer los diferentes pasos para la realización de extracción de ADN.
Identificar la función que cumplen las diferentes sustancias químicas usadas
en el proceso de extracción de ADN
3. Metodología
Explicación magistral por parte del docente
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EXTRACCIÓN DE ADN
Simulación de laboratorio virtual.
Observación de videos
Lectura de artículo
Simulación de laboratorio virtual.
https://learn.genetics.utah.edu/content/labs/extraction/
Observación de videos
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Artículo
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893X2019000100058
TALLER
1- En una extracción de ADN que función cumplen las Ribonucleasas.
R/ Las ribonucleasas se encargan de eliminar el ARN, el cual se encuentra en la
muestra como tal del ADN estudiado.
2- Explique en que consiste el proceso de lisis celular por osmosis.
R/ el proceso de lisis celular consiste en la liberación de todos los orgánulos
contenidos en el citoplasma, tales como, el ADN se encontrará en el núcleo,
mitocondrias o cloroplastos, todos rodeados de membrana
3- Explique la función de acetato de potasio o de amonio en la extracción de ADN
R/ El acetato de potasio, ayuda a precipitar las proteínas y separar los ácidos
nucleicos.
4- Explique la función del isopropanolol en la extracción del ADN
R/ El isopropanolol ayuda a precipitar y purificar los ácidos nucleicos.
5- Consulte y explique la función del buffer TE en la extracción de ADN
bacteriano.
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R/ El buffer TE ayuda a romper la membrana celular, presente en células
vegetales, por consiguiente ayuda a facilitar la extracción de ADN.
6- Explique por qué para la extracción de ADN de células vegetales y de bacterias
es necesario utilizar un proceso mecánico(trituración), mientras que en células
animales un proceso químico.
R/ La razón por la cual se utiliza un proceso mecánico como la trituración de la
muestra es debido a que estos presentan una estructura de la pared celular
mucho más rígida, lo que dificultaría realizar la ruptura celular por métodos tales
como el químico, por lo que el método químico es mucho más idóneo para células
animales ya que estas poseen características de membrana plasmática lo cual
facilita hacer la ruptura celular al utilizar detergentes para disolverlas.
7- Explique por qué es necesario mantener baja la temperatura durante el proceso
de extracción de ADN
R/ Debido a que la actividad enzimática es sensible a la temperatura y el pH, entre
otras variables, realizar la extracción de ADN optimo, el proceso debe realizarse a
baja temperatura, esto debido a que la baja temperatura relentiza la actividad
enzimática, evitando de tal modo que las moléculas biológicas, como el ADN,
sean degradadas tras la ruptura de las membranas celulares que conlleva la
liberación de los componentes subcelulares
8- Químicamente como se explica que los detergentes sean utilizados para causar
la ruptura de la membrana celular en el proceso de extracción de ADN.
R/ Los detergentes al estar formados por moléculas anfipáticas, lo cual le permite
presentar la característica de solubilizar la grasa a través de la formación de
micelas, esta característica le permite solubilizar la grasa a través de la formación
de micelas, siendo estas estructuras las encargadas de interactuar con la grasa,
por lo que son capaces de disolver las bicapas lipídicas de las membranas
biológicas por lo cual las membranas grasas se lisan y se liberan las
biomoléculas, tales como el ADN
9- Realiza un protocolo ilustrado para extracción de ADN bacteriano.
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AISLAMIENTO DE ADN DE BACTERIAS GRAM POSITIVAS Y GRAM NEGATIVAS
Paso 1. Obtención de pellet bacteriano
Centrifugue 1 ml de cultivo durante 2 minutos a 13000 rpm y descartar el sobrenadante
A. Para bacterias Gram positiva
1.Suspender el pellet en 480µl 50mM EDTA.
2.adicionar enzima lítica (120µl) [lisozima /o lisostafina].
3. incubar a 37°c durante 30 o 60 minutos.
4.centrifugar durante 2 minutos a 13,000–16,000 × g* y eliminar el sobrenadante.
5. vaya al paso 1, lisado de células (abajo)
B. para bacterias Gram negativas
vaya al paso 1, lisado de células (abajo)
Paso 2. Lisado de células
1.Adicionar 600µl de solución de lisis de núcleos y pipetear suavemente para mezclar.
2. incubar durante 5 minutos a 80°c, luego enfriar a temperatura ambiente.
3. añadir 3µl de solución de RNase, mezclar e incubar a 37°c durante 15 – 60 minutos, luego
enfriar a temperatura ambiente.
Paso 3. Precipitación de proteínas
4. añadir 200µl de solución de precipitación proteína y mezclar en vortex.
5. incubar en hielo por 5 minutos.
6. centrifugar a 13,000–16,000 × g* por 3 minutos
Paso 4. Precipitación y rehidratación del ADN
7. transferir el sobrenadante a un tubo limpio que contenga 600µl de isopropanol a
temperatura ambiente y mezclar.
8. centrifugar a 13,000–16,000 × g* por 3 minutos y decantar el sobrenadante.
9. añadir 600µl de etanol al 70% a temperatura ambiente y mezclar.
10.centrifugue por 2 min a 13,000–16,000 × g*.
11.aspirar el etanol y secar al aire el pellet durante 10 – 15 minutos.
12. rehidratar el pellet de ADN en 100µI de solución de rehidratación durante 1 hora a 65°c o
toda la noche a 4°C
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Diagrama grafico
