SDS-PAGE:

Proteínas de la membrana eritrocitaria separadas por SDS-PAGE según sus masas moleculares

SDS-PAGE ( electroforesis en gel de poliacrilamida y dodecil sulfato de sodio ) es una

variante de la electroforesis en gel de poliacrilamida , un método analítico en bioquímica para
la separación de moléculas cargadas en mezclas por sus masas moleculares en un campo
eléctrico . Utiliza moléculas de dodecil sulfato de sodio (SDS) para ayudar a identificar y
aislar moléculas de proteínas .
SDS-PAGE es un sistema electroforético discontinuo desarrollado por Ulrich K. Laemmli que
se usa comúnmente como un método para separar proteínas con masas moleculares entre 5
y 250 KDa . [1] La publicación que lo describe es el artículo más frecuentemente citado por un
solo autor, y el segundo en general más citado. [2]

Propiedades [ editar ]

Despliegue de una proteína con SDS

Despliegue de una proteína con calor

SDS-PAGE es un método de electroforesis que permite la separación de proteínas en

masa. El medio (también denominado 'matriz') es un gel discontinuo a base de
poliacrilamida. Además, se usa SDS ( dodecil sulfato de sodio ). Aproximadamente 1.4 gramos
de SDS se unen a un gramo de proteína, [3] [4] [5] correspondiente a una molécula de SDS por
dos aminoácidos . SDS actúa como un tensioactivo, cubriendo la carga intrínseca de las
proteínas y confiriéndoles una relación carga-masa muy similar. Las cargas intrínsecas de las
proteínas son insignificantes en comparación con la carga de SDS, y las cargas positivas
también se reducen considerablemente en el rango de pH básico de un gel de
separación. Tras la aplicación de un campo eléctrico constante, la proteína migra hacia el
ánodo, cada uno con una velocidad diferente, dependiendo de su masa. Este sencillo
procedimiento permite la separación precisa de proteínas en masa.
SDS tiende a formar micelas esféricas en soluciones acuosas por encima de una cierta
concentración llamada concentración micelar crítica (CMC). Por encima de la concentración
micelar crítica de 7 a 10 milimolar en soluciones, el SDS ocurre simultáneamente como
moléculas individuales ( monómero ) y como micelas, por debajo del CMC SDS ocurre solo
como monómeros en soluciones acuosas. A la concentración micelar crítica, una micela
consta de aproximadamente 62 moléculas SDS. [6] Sin embargo, solo los monómeros SDS se
unen a las proteínas mediante interacciones hidrófobas, mientras que las micelas SDS son
aniónicas en el exterior y no adsorben ninguna proteína. [3] SDS es de naturaleza anfipática, lo
que le permite desplegar secciones polares y no polares de la estructura de la proteína. [7] En
concentraciones de SDS superiores a 0,1 milimolar, comienza el despliegue de proteínas,  [3] y
por encima de 1 mM, la mayoría de las proteínas se desnaturalizan. [3] Debido al fuerte efecto
desnaturalizante de SDS y la disociación posterior de los complejos de proteínas, las
estructuras cuaternarias generalmente no se pueden determinar con SDS. Las excepciones
son, por ejemplo, proteínas que se estabilizaron previamente mediante reticulación covalentey
los complejos proteicos resistentes a SDS, que son estables incluso en presencia de SDS
(este último, sin embargo, solo a temperatura ambiente). Para desnaturalizar los complejos
resistentes a SDS se requiere una alta energía de activación, que se logra mediante
calentamiento. La resistencia a SDS se basa en una metaestabilidad del pliegue
proteico. Aunque la proteína nativa, completamente plegada, resistente a SDS no tiene
suficiente estabilidad en presencia de SDS, el equilibrio químico de la desnaturalización a
temperatura ambiente ocurre lentamente. Los complejos proteicos estables se caracterizan no
solo por la resistencia a SDS sino también por la estabilidad contra las proteasas y una vida
media biológica aumentada . [8]
Alternativamente, la electroforesis en gel de poliacrilamida también se puede realizar con los
surfactantes catiónicos CTAB en una CTAB-PAGE, [9] [10] [11] o 16-BAC en una BAC-PAGE. [12]

Procedimiento [ editar ]
El método SDS-PAGE se compone de preparación de gel, preparación de muestras,
electroforesis, tinción de proteínas o transferencia Western y análisis del patrón de bandas
generado.
Producción de gel [ editar ]
Muestra de peines con diferentes números de bolsillos, cada punta deja un bolsillo en el gel cuando se
saca

Gel de separación y apilamiento polimerizado antes de retirar el peine de muestra (blanco) entre los
espaciadores (negro), en el gel de apilamiento hay pequeñas cantidades de azul de bromofenol para
mejorar la visibilidad, el gel de separación no está manchado

Cuando se usan diferentes tampones en el gel (electroforesis en gel discontinua), los geles se
preparan hasta un día antes de la electroforesis, de modo que la difusión no conduzca a una
mezcla de los tampones. El gel se produce por polimerización [Link] un molde que consta
de dos placas de vidrio selladas con separadores entre las placas de vidrio. En una
configuración típica de mini gel, los espaciadores tienen un espesor de 0,75 mm o 1,5 mm, lo
que determina la capacidad de carga del gel. Para verter la solución de gel, las placas
generalmente se sujetan en un soporte que sella temporalmente la parte inferior abierta de las
placas de vidrio con los dos separadores. Para la solución de gel, la acrilamida se mezcla
como formador de gel (generalmente 4% V / V en el gel de apilamiento y 10-12% en el gel de
separación), metilenbisacrilamida como un reticulador, tampón de gel de apilamiento o
separación, agua y SDS . Al agregar el catalizador TEMED y el iniciador radical persulfato de
amonio(APS) se inicia la polimerización. La solución se vierte entre las placas de vidrio sin
crear burbujas. Dependiendo de la cantidad de catalizador y de iniciador de radicales y de la
temperatura, la polimerización dura entre un cuarto de hora y varias horas. El gel inferior (gel
de separación) se vierte primero y se cubre con unas gotas de un alcohol apenas soluble en
agua (generalmente butanol saturado con tampón o isopropanol), que elimina las burbujas
del menisco y protege la solución de gel del eliminador de radicales de oxígeno. Después de
la polimerización del gel de separación, el alcohol se desecha y el alcohol residual se elimina
con papel de filtro.. Después de la adición de APS y TEMED a la solución de gel de
apilamiento, se vierte sobre el gel de separación sólido. Luego, se inserta un peine de muestra
adecuado entre las placas de vidrio sin crear burbujas. El peine de la muestra se extrae
cuidadosamente después de la polimerización, dejando bolsas para la aplicación de la
muestra. Para el uso posterior de proteínas para la secuenciación de proteínas , los geles a
menudo se preparan el día antes de la electroforesis para reducir las reacciones de acrilamida
no polimerizada con cisteínas en proteínas.
Al usar un mezclador de gradiente , se pueden formar geles de gradiente con un gradiente de
acrilamida (generalmente del 4 al 12%), que tienen un rango de separación mayor de las
masas moleculares. [13] Los sistemas de gel comerciales (los llamados geles prefabricados )
generalmente usan la sustancia tampón Bis-tris metano con un valor de pH entre 6.4 y 7.2
tanto en el gel de apilamiento como en el gel de separación. [14] [15] Estos geles se entregan
fundidos y listos para usar. Ya que usan solo un tampón ( electroforesis en gel continua) y
tienen un pH casi neutro, pueden almacenarse durante varias semanas. El pH más neutro
ralentiza la hidrólisis y, por lo tanto, la descomposición de la poliacrilamida. Además, hay
menos cisteínas modificadas con acrilamida en las proteínas. [14] Debido al pH constante en la
recolección y separación del gel, no hay efecto de apilamiento. Las proteínas en geles BisTris
no se pueden teñir con complejos de rutenio. [16] Este sistema de gel tiene un rango de
separación comparativamente grande, que se puede variar usando MES o MOPS en el
tampón de funcionamiento. [14]
Preparación de muestra [ editar ]

Reducción de disulfuro por TDT

Durante la preparación de la muestra, el tampón de la muestra, y por lo tanto SDS, se agrega

en exceso a las proteínas, y la muestra luego se calienta a 95 ° C durante cinco minutos, o
alternativamente a 70 ° C durante diez minutos. El calentamiento altera
las estructuras secundarias y terciarias de la proteína al interrumpir los enlaces de hidrógeno y
estirar las moléculas. Opcionalmente, los puentes disulfuro se pueden escindir por
reducción. Para este propósito, reducir los tioles como el β-mercaptoetanol (β-ME, 5% en
volumen), ditiotreitol (DTT, 10 milimolar) o ditioeritritol(DTE, 10 milimolar) se añaden al tampón
de muestra. Después de enfriar a temperatura ambiente, cada muestra se pipetea en su
propio pozo en el gel, que previamente se sumergió en tampón de electroforesis en el aparato
de electroforesis.
Además de las muestras, generalmente se carga un marcador de tamaño de peso
molecular en el gel. Consiste en proteínas de tamaños conocidos y, por lo tanto, permite la
estimación (con un error de ± 10%) de los tamaños de las proteínas en las muestras reales,
que migran en paralelo en diferentes pistas del gel. [17] El marcador de tamaño a menudo se
pipetea en el primer o último bolsillo de un gel.
Electroforesis [ editar ]
Cámara de electroforesis después de unos minutos de electroforesis. En el primer bolsillo se aplicó un
marcador de tamaño con azul de bromofenol, en los otros bolsillos, las muestras se agregaron verde de
bromocresol

Para la separación, las muestras desnaturalizadas se cargan en un gel de poliacrilamida, que

se coloca en un tampón de electroforesis con electrolitos adecuados. Posteriormente, se
aplica un voltaje (generalmente alrededor de 100 V, 10-20 V por cm de longitud de gel), lo que
provoca una migración de moléculas cargadas negativamente a través del gel en la dirección
del ánodo cargado positivamente . El gel actúa como un tamiz. Las proteínas pequeñas
migran con relativa facilidad a través de la malla del gel, mientras que las proteínas más
grandes tienen más probabilidades de ser retenidas y, por lo tanto, migran más lentamente a
través del gel, lo que permite que las proteínas se separen por tamaño molecular. La
electroforesis dura entre media hora y varias horas, dependiendo del voltaje y la longitud del
gel utilizado.
Las proteínas de migración más rápida (con un peso molecular de menos de 5 KDa) forman el
frente del tampón junto con los componentes aniónicos del tampón de electroforesis, que
también migran a través del gel. El área del frente del tampón se hace visible al agregar
el azul de bromofenolcolorante aniónico comparativamente pequeño al tampón de
muestra. Debido al tamaño de molécula relativamente pequeño del azul de bromofenol, migra
más rápido que las proteínas. Mediante el control óptico de la banda de color que migra, la
electroforesis puede detenerse antes del tinte y también las muestras han migrado
completamente a través del gel y lo dejan.
El método más utilizado es la SDS-PAGE discontinua. En este método, las proteínas migran
primero a un gel colector con pH neutro, en el que se concentran y luego migran a un gel de
separación con pH básico, en el que tiene lugar la separación real. Los geles de apilamiento y
separación difieren según el tamaño de poro (4-6% T y 10-20% T), la fuerza iónica y los
valores de pH (pH 6.8 o pH 8.8). El electrolito más utilizado es
un sistema tampón Tris - glicina - cloruro que contiene SDS . A pH neutro, la glicina forma
predominantemente el ion híbridoDe forma, a pH alto las glicinas pierden cargas positivas y se
vuelven predominantemente aniónicas. En el gel de recolección, los iones de cloruro más
pequeños, cargados negativamente, migran frente a las proteínas (como iones principales) y
los iones de glicinato cargados negativamente y parcialmente positivos más grandes migran
detrás de las proteínas (como iones iniciales), mientras que en comparación gel separador
básico ambos iones migran frente a las proteínas. El gradiente de pH entre los tampones de
gel de apilamiento y separación conduce a un efecto de apilamiento en el borde del gel de
apilamiento al gel de separación, ya que el glicinato pierde parcialmente sus cargas positivas
de desaceleración a medida que aumenta el pH y luego, a medida que el antiguo ion de
arrastre, alcanza las proteínas y se convierte en un ion principal, lo que hace que las bandas
de las diferentes proteínas (visibles después de una tinción) se vuelvan más estrechas y
nítidas, el efecto de apilamiento. Para la separación de proteínas y péptidos más pequeños, el
TRIS-El sistema tampón de tricina de Schägger y von Jagow se usa debido a la mayor
diseminación de las proteínas en el rango de 0.5 a 50 KDa. [18]
Tinción de gel [ editar ]

Gel de Tris / Tricina al 10% teñido con Coomassie. En el carril izquierdo, se usó un marcador de tamaño
de peso molecular para estimar el tamaño (de arriba a abajo: 66, 45, 35, 24, 18 y 9 kDa). En los carriles
restantes, las proteínas de levadura purificadas se separaron.

Al final de la separación electroforética, todas las proteínas se clasifican por tamaño y luego
se pueden analizar por otros métodos, por ejemplo, tinción de proteínas como la tinción
de Coomassie (más común y fácil de usar), [19] [20] tinción de plata (sensibilidad más
alta ), [21] [22] [23] [24] [25] [26] tiñe todas las manchas, tinción con negro de amido 10B , [20] tinción de FCF
verde rápido , [20] manchas fluorescentes como la tinción de epicocconona [27] y SYPRO mancha
naranja, [28] y detección inmunológica como la Western Blot. [29] [30] Los colorantes fluorescentes
tienen una linealidad comparativamente más alta entre la cantidad de proteína y la intensidad
del color de aproximadamente tres órdenes de magnitud por encima del límite de detección ,
es decir, la cantidad de proteína puede estimarse por la intensidad del color. Cuando se usa el
colorante de proteína fluorescente tricloroetanol , se omite una tinción de proteína posterior si
se agrega a la solución de gel y el gel se irradia con luz UV después de la electroforesis. [31] [32]
Análisis [ editar ]
La tinción de proteínas en el gel crea un patrón de bandas documentable de las diversas
proteínas. Las glicoproteínas tienen niveles diferenciales de glicosilaciones y adsorben SDS
de manera más desigual en las glicosilaciones, lo que da como resultado bandas más anchas
y borrosas. [33] Las proteínas de membrana , debido a su dominio transmembrana , a menudo
se componen de los aminoácidos más hidrófobos, tienen una solubilidad más baja en
soluciones acuosas, tienden a unirse a los lípidos y tienden a precipitarse en soluciones
acuosas debido a los efectos hidró[Link] no hay suficientes cantidades de
detergente. Esta precipitación se manifiesta por las proteínas de membrana en una SDS-
PAGE en "cola" por encima de la banda de la proteína transmembrana. En este caso, se
puede usar más SDS (usando más o más tampón de muestra concentrado) y se puede
reducir la cantidad de proteína en la aplicación de muestra. Una sobrecarga del gel con una
proteína soluble crea una banda semicircular de esta proteína (por ejemplo, en el carril
marcador de la imagen a 66 KDa), permitiendo cubrir otras proteínas con pesos moleculares
similares. Un bajo contraste (como en el carril marcador de la imagen) entre bandas dentro de
un carril indica la presencia de muchas proteínas (baja pureza) o, si se usan proteínas
purificadas y se produce un bajo contraste solo debajo de una banda, indica una degradación
proteolítica de la proteína,[34] La documentación del patrón de bandas generalmente se realiza
mediante fotografía o escaneo. Para una recuperación posterior de las moléculas en bandas
individuales,se puede realizaruna extracción en gel .
Archivado [ editar ]

Dos geles SDS después de completar la separación de las muestras y la tinción en un marco de secado

Después de la tinción de proteínas y la documentación del patrón de bandas, el gel de

poliacrilamida se puede secar para el almacenamiento de archivos. Las proteínas se pueden
extraer de él en una fecha posterior. El gel se coloca en un marco de secado (con o sin el uso
de calor) o en un secador de vacío. El marco de secado consta de dos partes, una de las
cuales sirve como base para una película de celofán húmeda a la que se agrega el gel y
una solución de glicerol al uno por ciento . Luego se aplica una segunda película de celofán
húmeda sin burbujas, la segunda parte del marco se coloca encima y el marco se sella con
clips. La eliminación de las burbujas de aire evita una fragmentación del gel durante el
secado. El agua se evapora a través de la película de celofán. A diferencia del marco de
secado, un secador de vacío genera un vacío y calienta el gel a aproximadamente 50 ° C.

Determinación de masa molecular [ editar ]

Las proteínas del marcador de tamaño (X negro) muestran una línea aproximadamente recta en la
representación de log M sobre Rf. El peso molecular de la proteína desconocida (X roja) se puede
determinar en el eje y.

Para una determinación más precisa del peso molecular, las distancias de migración relativas
de las bandas de proteínas individuales se miden en el gel de separación. [35] [36]Las mediciones
generalmente se realizan por triplicado para una mayor precisión. La movilidad relativa
(llamada valor Rf o valor Rm) es el cociente de la distancia de la banda de la proteína y la
distancia del frente del tampón. Las distancias de las bandas y el frente del tampón se miden
desde el comienzo del gel de separación. La distancia del frente del tampón corresponde
aproximadamente a la distancia del azul de bromofenol contenido en el tampón de
muestra. Las distancias relativas de las proteínas del marcador de tamaño se representan
semi-logarítmicamente frente a sus pesos moleculares conocidos. En comparación con la
parte lineal del gráfico generado o mediante un análisis de regresión, el peso molecular de
una proteína desconocida puede determinarse por su movilidad relativa. Las bandas de
proteínas con glucosilaciones pueden ser borrosas. [33]Las proteínas con muchos aminoácidos
básicos (p. Ej., Histonas ) [37] pueden conducir a una sobreestimación del peso molecular o
incluso no migrar al gel, ya que se mueven más lentamente en la electroforesis debido a las
cargas positivas o incluso a la dirección opuesta. . En consecuencia, muchos aminoácidos
ácidos pueden conducir a una migración acelerada de una proteína y a una subestimación de
su masa molecular. [38]

Aplicaciones [ editar ]
La SDS-PAGE en combinación con una tinción proteica se usa ampliamente en bioquímica
para la separación rápida y exacta y el posterior análisis de proteínas. Tiene costos
relativamente bajos de instrumentos y reactivos y es un método fácil de usar. Debido a su
baja escalabilidad , se utiliza principalmente con fines analíticos y menos con fines de
preparación, especialmente cuando se deben aislar grandes cantidades de una proteína.
Además, SDS-PAGE se usa en combinación con la transferencia Western para la
determinación de la presencia de una proteína específica en una mezcla de proteínas, o para
el análisis de modificaciones postraduccionales . Las modificaciones postraduccionales de las
proteínas pueden conducir a una movilidad relativa diferente (es decir, un cambio de banda ) o
a un cambio en la unión de un anticuerpo de detección utilizado en la transferencia Western
(es decir, una banda desaparece o aparece).
En la espectrometría de masas de proteínas, SDS-PAGE es un método ampliamente utilizado
para la preparación de muestras antes de la espectrometría, principalmente
utilizando digestión en gel . Con respecto a la determinación de la masa molecular de una
proteína, la SDS-PAGE es un poco más exacta que una ultracentrifugación analítica , pero
menos exacta que una espectrometría de masas o, ignorando las modificaciones
postraduccionales, un cálculo de la masa molecular de la proteína a partir del ADN.
secuencia .
En el diagnóstico médico, SDS-PAGE se usa como parte de la prueba de VIH y para evaluar
la proteinuria . En la prueba del VIH, las proteínas del VIH se separan por SDS-PAGE y
posteriormente se detectan mediante Western Blot con anticuerpos específicos del VIH del
paciente, si están presentes en su suero sanguíneo . SDS-PAGE para proteinuria evalúa los
niveles de diversas proteínas séricas en la orina, por ejemplo , albúmina , alfa-2-
macroglobulina e IgG .

Variantes [ editar ]
SDS-PAGE es el método más utilizado para la separación electroforética en gel de
proteínas. La electroforesis en gel bidimensional combina secuencialmente el enfoque
isoeléctrico o BAC-PAGE con una SDS-PAGE. La PÁGINA nativa se usa si se desea
mantener el plegamiento de proteínas nativas. Para la separación de proteínas de membrana,
se puede usar BAC-PAGE o CTAB-PAGE como alternativa a SDS-PAGE. Para la separación
electroforética de complejos proteicos más grandes, se puede utilizar electroforesis en gel de
agarosa , por ejemplo, SDD-AGE . Algunas enzimas pueden detectarse mediante su actividad
enzimática mediante zimografía .

Alternativas [ editar ]
Si bien es uno de los métodos de análisis y separación de proteínas más precisos y de bajo
costo, la SDS-PAGE desnaturaliza las proteínas. Cuando son necesarias condiciones no
desnaturalizantes, las proteínas se separan mediante una PAGE nativa o
diferentes métodos cromatográficos con cuantificación fotométrica posterior , por
ejemplo, cromatografía de afinidad (o incluso purificación de afinidad en
tándem ), cromatografía de exclusión por tamaño , cromatografía de intercambio iónico . [39] Las
proteínas también se pueden separar por tamaño en una filtración de flujo tangencial [40] o
una ultrafiltración . [41]Las proteínas individuales se pueden aislar de una mezcla mediante
cromatografía de afinidad o mediante un ensayo desplegable . Algunos métodos de
separación históricamente tempranos y rentables pero crudos generalmente se basan en una
serie de extracciones y precipitaciones utilizando moléculas kosmotrópicas , por ejemplo,
la precipitación de sulfato de amonio y la precipitación de polietilenglicol .

Historia [ editar ]
En 1948, Arne Tiselius recibió el Premio Nobel de Química por el descubrimiento del principio
de electroforesis como la migración de átomos o moléculas cargados y disueltos en un campo
eléctrico. [42] El uso de una matriz sólida (inicialmente discos de papel) en una electroforesis de
zona mejoró la separación. La electroforesis discontinua de 1964 por L. Ornstein y BJ Davis
hizo posible mejorar la separación por el efecto de apilamiento. [43]El uso de hidrogeles de
poliacrilamida reticulados, en contraste con los discos de papel o geles de almidón
previamente utilizados, proporcionó una mayor estabilidad del gel y ninguna descomposición
microbiana. El efecto desnaturalizante de SDS en geles de poliacrilamida continuos y la
consiguiente mejora en la resolución fue descrita por primera vez en 1965 por David F.
Summers en el grupo de trabajo de James E. Darnell para separar las proteínas de
poliovirus. [44] La variante actual de la SDS-PAGE fue descrita en 1970 por Ulrich K. Laemmli e
inicialmente utilizada para caracterizar las proteínas en la cabeza del bacteriófago T4 . [1]
 TEMA 2

1. CONCEPTOS BÁSICOS EN BIOQUÍMICA CLÍNICA

· Bioquímica clínica: Rama de la ciencia que estudia los aspectos bioquímicos de la vida
humana en la salud y en la enfermedad.

1.1 Antecedentes históricos

· Hipócrates: Análisis orina
· Edad Media: "uromancia" aspectos característico orina en enfermedad
· Richard Bright (1827): Primer análisis bioquímico presenta de proteínas en orina
· Prueba de Fehling: Presencia de azúcares reductores
· [Link]: Sangrías terapéuticas
· George Rees (1838): Glucosa en diabetes
· Garrod (1848): Acumulación urato sódico en enfermos de gota
· Determinación Hb, eritrocitos, leucocitos (sangre)
· Determinación proteínas, glucosa y bilirrubina (orina)

-> Siglo XX
· Descripción de métodos colorimétricos: Determinación cuantitativa. Volúmenes
pequeños sangre y orina.
· Jeringa hipodérmica: Calidad de muestras obtenidas
· Análisis enzimático: Especificidad, sensibilidad, exactitud y reducción de tiempo
· Utilización de anticuerpos: Inmunoanálisis y métodos analíticos.
· Automatización de laboratorios: Aumento número muestras, mejora control proceso y
reproducibilidad.

1.2. Aplicaciones bioquímica clínica

· Ayudar al diagnóstico
· Seguimiento de la enfermedad para ver su evolución y si el tratamiento ha sido efectivo
· Prognosis: Previo a la sintomatología
· Detección-Investigación

- Historia clínica: Previa al análisis. Preguntando síntomas se averiguan signos que

permiten confirmar o excluir un diagnóstico o una sospecha mediante pruebas bioquímicas.

1.3. Tipos de diagnósticos

Usaremos la bioquímica clínica preferentemente para dos tipos:
· Etiológico: Determina las causas de la enfermedad
· Diferencial: Discrimina entre posibles enfermedades o subtipos
1) Fase preanalítica (examen)
Fase más importante.
Es el conjunto de procesos desde la solicitud de la prueba hasta que se inicia el análisis.

Factores:
· Elevado porcentaje de errores
· Factores que aportan variabilidad: Se puede modificar al recoger una buena muestra y se
tiene que tener en cuenta a la hora de analizar los resultados

Puede haber variabilidad:

· Biológica: Aparecen factores modificables (edad, sexo, raza y embarazo) y
no
modificables (variaciones cíclicas, ingesta de fármacos, dieta, entorno y actividad física)
· Espécimen: Si se trata mal una muestra de sangre, por ejemplo, podemos tener hemolisis
y
mezclar los contenidos de suero (muestra de sangre coagulada y centrifugada quedándonos
con el
suero) y plasma (tomamos la muestra de sangre con anticoagulantes)
· Extracción: Depende de la postura en la que se encuentre el individuo cuando se toma la
muestra. Se usa un torniquete, que afecta a los niveles de Na y K.

2) Fase analítica

3) Fase postanalítica
Diagnóstico clínico realizado por un médico en base al informe

3. MUESTRAS: TIPO. RECOGIDA Y MANIPULACIÓN

En función de cada muestra se consideran las características de su recogida y
manipulación
(transporte, conservación...)
 3.1. Sangre
Puede haber factores que afectarán a la composición y otros que afectarán a la
composición
(parámetros bioquímicos)
- Composición: A la hora de recoger la muestra se debe tener en cuenta:

· El sexo: Las mujeres tienen un nivel más bajo que los hombres de colesterol. La
creatinina, el hierro (más probable que una mujer tenga anemia) y los niveles de
enzimas.
· El ejercicio: Disminuye el colesterol
· La postura
· La raza: La raza negra tiene niveles de proteína más elevados que la raza
caucásica. Los inuits tienen predisposición a diabetes
· La variación cíclica: Los niveles de cortisol dependen de los ciclos circadianos.
· El estrés: Se altera el sistema endocrino. Aumenta catecolaminas y
glucocorticoides.
· La ingesta/dieta/estilo de vida

3.2. Orina
Dos posibilidades de recogida:
· La primera micción
· Recogida orina de 24h
3.3. Líquido cefalorraquídeo (LCR)
Método más invasivo, la toma de muestras tiene más riesgo. Esta toma se recoge cuando
únicamente se sospeche de una enfermedad que solo se puede tomar la muestra de este
sitio, por
ejemplo, meningitis, hemorragias cerebrales, enfermedades degenerativas y tumores
primarios
metastásicos.
Los volúmenes que se toman son muy pequeños, se suelen tomar tres alícuotas, con fines:
· Químicos/ inmunológicos
· Microbiológicos
· Recuento celular

NOTA: La punción es lumbar.

Si la glucosa es baja puede haber meningitis, ya que es posible tener un patógeno que se
esté
alimentándose de esto.

3.4. Líquido sinovial

Se toman entre 0,1-3,5 ml. El líquido sinovial regula el movimiento de articulaciones y
sirve
para la alimentación de cartílagos.
Al igual que el LCR, solo se toma en situaciones específicas

3.5. Líquidos cavidades

3.6. Líquido amniótico

Se realiza el ultrafiltrado del plasma materno. Éste contribuye a órganos del feto
(orina/
surfactante pulmonar)
La amniocentesis: Tiene el riesgo de interrupción del embarazo. Se mide:
· Cantidad de líquido
· Relación lecitina/ esfingomielina
· Nivel O
2

· Incompatibilidad sangre
- Indicaciones: Para el diagnóstico genético (14ª-16ª semana), para comprobar
madurez
fetal, sufrimiento fetal o eritoblastos fetal.

3.7. Muestras sólidas

· Pelo: Los restos de drogas pueden perdurar en el pelo meses.
· Biopsias
· Aire espirado

4. EVALUACIÓN DE MÉTODOS ANALÍTICOS

Protocolo por el cual realizamos la determinación bioquímica. Necesitamos realizar
un
método analítico que me pueda diferenciar entre un estado de salud bueno o una patología:

Características del método analítico: (examen)

· Especificidad: Debe ser elevada, es decir, que los valores de los sanos sean muy
diferentes
a los valores de los enfermos. Cuanto mayor sea esta diferencia mayor será nuestra
especificidad.
· Preciso: Deben de ser reproducibles, es decir, si nuestro método da un valor de
70,
siempre debe dar este valor. Hace referencia a la población sana
· Exactitud: Los valores que yo obtengo de la población real deben coincidir con los
valores
de la realidad. Por ejemplo: si los niveles de glucosa reales son 90 siempre tienen que dar
90 los
nuestros. Hace referencia a la población sana
· Sensibilidad: Debe ser capaz de detectar al mayor número posible de enfermos. Cuanto
más sensible sea nuestro método más enfermos detectamos.
4.2. Distinción entre sanos y
enfermos
En los métodos analíticos tenemos una población de referencia con su valor.
Cuando
teníamos situación de enfermedad podíamos encontrarnos con una situación ideal, donde
los valores
para la población enfermedad son diferentes de la población de referencia. Sin
embargo en una
situación real se solapan.
La sensibilidad va a medir a los verdaderos positivos (enfermos) y la especificidad a
los
verdaderos negativos (sanos). En la situación real además de esto tenemos otra
población donde
encontraríamos falsos negativos y falsos positivos (población sana pero de acuerdo a mi
método
están enfermos). Esto es así debido al punto de corte.
Los valores de la población no se pueden cambiar, sin embargo se puede definir el punto
de
corte.

· Para tener un 100% de sensibilidad el punto de corte lo trasladamos hacia la izquierda,

tomando a todos los enfermos. Desventaja: se disminuye la especificidad porque se
aumenta el
número de falsos positivos.
· Para tener un 100% de especificidad, trasladamos el punto de corte a la derecha para
tomar
a todas las personas sanas.
 4.3. Eficacia clínica del método
- Cálculo del valor predictivo positivo (VPP): Nos indica cuantas de las personas
que
según mi método están enfermas luego desarrollan la enfermedad. Lo podemos relacionar
con la
sensibilidad.

- Cálculo del valor predictivo negativo (VPN): Nos indica cuantas personas que por mi
método están sanas luego no desarrollan la enfermedad. Está asociado con la especificidad.

Esto tiene mucha importancia porque no todos los métodos tienen los mismos VPP y VPN.
En enfermedades raras se tendrá un buen método desde el punto de vista de VPN

- Cálculo de la eficiencia: Nos indica el porcentaje de personas clasificadas correctamente.

Mide la capacidad para acertar.

- Prevalencia: Frecuencia con la cual aparece la enfermedad en la población.

4.4. Control calidad

Hay otro aspecto del método que nos interesa y está relacionado con la exactitud
y la
precisión, que solo se fijan en la población sana, en la de referencia.
Los resultados que obtengo se asemejan a la realidad (exactitud); siempre que se
introduzca, por ejemplo, el mismo control de glucosa debe darse el mismo valor en todos
los casos
(precisión). Esto se usará para evaluar la calidad del método.

· Si el método no es preciso, tenemos un error aleatorio.

· Si el método no es exacto, tenemos un error sistemático.

Por lo que no se puede hacer una clasificación y no se puede usar el método.

NOTA: Es peor un error aleatorio que uno sistemático

Los controles de calidad son internos o externos. Mediante el diagrama de Levy-Jennings

podemos detectar los errores aleatorio y sistemático y los elimina.

Reglas de Westgard:
· Regla 1.2s: Hay un valor de control que está por encima o por debajo dos veces del valor
estándar. Hay una advertencia y las reglas se siguen aplicando.
· Regla 1.3s: Hay un valor que está por encima o por debajo tres veces del valor estándar.
Se
elimina el error aleatorio
· Regla 2.2s: Hay dos controles consecutivos por encima de +-2. Conlleva a un
error
sistemático
· Regla R4s: Hay 4 unidades de diferencia en desviación estándar entre dos
controles.
Conlleva a error aleatorio y rechazo.
· Regla 4.1s: Hay 4 valores consecutivos en el mismo lado de +1 o -1 de
desviación
estándar. Es un error sistemático y hay un aviso
· Regla 10x: 10 valores consecutivos al mismo lado de la media. Error sistemático y aviso.
Cualquier alteración genética implica daño en el DNA, alterándose las proteínas y
las
enzimas. A partir del estudio de las enzimas se pueden detectar alteraciones genéticas o
detectar
enfermedades.

Las enzimas suelen actuar dentro de las células, por lo que la concentración de la enzima
será distinta dentro de la célula que en el suero. Ejemplo: La AST (aspartato
transaminasa) se
asocia a hígado por haber mayor cantidad de ella dentro de éste que en suero. De
haber una
enfermedad hepática, el contenido de los hepatocitos se libera y aumenta el contenido de la
enzima
en suero.
Cuando vemos que la diferencia de enzima en suero es significativa entre situación normal
y
patogénesis, la podemos usar con valor diagnóstico. A parte de necrosis, un
aumento de las
concentraciones de enzimas en suero, puede ser por proceso tumoral, por aumento de la
síntesis de
la enzima, por obstrucción de la secreción...

- Enzima con valor diagnóstico: Aquella enzima que puedo medir en suero de
manera
sencilla y cuyos valores difieren mucho en situaciones de salud y situación patológica.
Características de la enzima con valor diagnóstico ideal:
· Medición sencilla en suero
· La concentración de la enzima es muy diferente entre salud y enfermedad.
· Elevada especificidad: Muy específico para una enfermedad en concreto, específica de
un
órgano o tejido y que sea específico en cuanto a localización subcelular.
· Baja variabilidad fisiológica Ejemplo: la lactato deshidrogenasa cambia su valor
dependiendo del ejercicio que
se realice, por lo que en
ocasiones no vale como
enzima con valor
diagnóstico.
Cuantificación de proteínas
Mary Johnson (han at labome dot com)
Synatom Research, Princeton, New Jersey, United States
Translator
Agustin Carbajal (quiocarbajal at gmail dot com)
Cordoba, Argentina
DOI
//[Link]/10.13070/[Link].2.115
Date
fecha : 2018-05-26; original version : 2012-02-29
Cite as
MATER METHODS es 2012;2:115
Resumen
Informe sobre ensayos para cuantificar proteínas y análisis bibliográfico de los ensayos de
proteínas basado en 194 publicaciones
English Abstract
A review of protein quantitation assays and a survey about the protein assays based on 194
formal publications.
Introducción
La cuantificación exacta de proteínas es esencial para todos los experimentos relacionados
con proteínas en una multitud de temas de investigación. Se han desarrollado diferentes
métodos para cuantificar proteínas totales, o alguna en particular. Los métodos de
cuantificación de proteínas totales incluyen métodos tradicionales tales como la medición de la
absorbancia a 280 nm, los ensayos de Bradford y el ácido bicinconínico, así como métodos
alternativos como el de Lowry o novedosos ensayos desarrollados por los proveedores
comerciales. Notmalmente, los proveedores comerciales venden kits bien diseñados y
prácticos para cada tipo de ensayo. Los métodos para cuantificar proteínas individuales
incluyen el ELISA, el Western blot y, más recientemente, la espectrometría de masas, entre
otros.
Aquí describimos algunos de los métodos comúnmente utilizados para determinar la
concentración de proteínas en solución, resaltando sus utilidades y limitaciones. Es importante
mencionarque ninguno de estos ensayos para proteínas son ni específicos para proteínas, lo
que significa que componentes no proteicos pueden interferir, ni uniformemente precisos y
compatibles con todas las proteínas. Más aún, las modificaciones de las proteínas pueden
interferir con la estimación de su concentración en algunos de estos ensayos cuando se
comparan con las proteínas no modificadas [1, 2]. Además, algunos ensayos, por ejemplo el
de 3-(4-carboxibenzil)quinolina-2-carboxialdehído (CBQCA), son también eficaces cuando se
utilizan para cuantificar péptidos o proteínas encapsulados o ligados a una superficie [3].
Las regulaciones o leyes de las agencias gubernamentales o grupos de comercio pueden
requerir métodos específicos para la determinación de proteínas totales. Por ejemplo, la
Asociación Internacional de la Industria del Suero ([Link]), un grupo
comercial de proveedores de suero, recomienda el método de Biuret para la determinación del
contenido de proteínas en productos de suero.
Ensayo para cuantificar proteínas
La tabla 1 resume los ensayos para cuantificar proteínas totales más comunes. Es importante
evaluar la compatibilidad de cada ensayo con los tipos de muestra, el rango del ensayo, el
volumen de muestra y la disponibilidad de un espectrofotómetro adecuado, así como el tiempo
y el costo.
ensayo absorción mecanismo límite de ventajas desventajas
detección
incompatible
pequeño volumen
absorción condetergentes y
0.1-100 de muestra,
absorción UV 280 nm de tirosina y agentes
ug/ml rápido,
triptófano desnaturalizantes,
económico
alta variabilidad
ácido 562 nm reducción 20-2000 compatible con compatibilidad
bicinconínico de cobre ug/ml detergentes y con agentes
(Cu2+ a agentes reductores baja o
Cu1+), desnaturalizantes, nula
Reacción baja variabilidad
 del BCA
con Cu1+
formación
de complejo
entre el
Bradford o colorante compatible con
20-2000 incompatible con
azul brillante 470 nm azul agentes
ug/ml detergentes
de Coomassie brillante de reductores, rápido
Coomassie
y las
proteínas
reducción
de cobre por
proteínas, incompatible con
reducción detergentes y
de Folin 10-1000 alta sensibilidad y agentes
Lowry 750 nm
Ciocalteu ug/ml precisión reductores,
por el procedimiento
complejo de largo
cobre con
proteína
Tabla 1. Ensayos comunes para medir proteínas totales.

Absorbancia ultravioleta (UV) a 280 nm (rango: 0.1-100 ug/ml)

Los aminoácidos aromáticos tirosina y triptófano confieren a las proteínas su característico
espectro de absorción ultravioleta (UV) a 280 nm. La fenilalanina y los puentes disulfuro
también pueden contribuir a la absorción en esa longitud de onda, aunque ligeramente. Este
método es simple y requiere de un volumen de muestra extremadamente pequeño ya que los
nuevos espectrofotómetros emplean un sistema de retención de muestra durante la medición.
Sin embargo, la muestra proteica debe ser pura y no contener componentes no proteicos con
el mismo espectro de absorción, tales como ácidos nucleicos contaminantes [4]. Se debe
conocer la secuencia exacta de los aminoácidos de la proteína analizada y calcular el
coeficiente de absorción específico de esa proteína previo a la determinación de la
concentración en solución [5, 6]. Este método es el más rápido, pero propenso a errores.
Ácido bicinconínico (BCA) o ensayo basado en cobre (rango: 20-2000 ug/ml)
El ensayo de ácido bicinconínico (BCA) fue inventado por Paul K. Smith en 1985 en la
compañía Pierce Chemical Company, el mayor distribuidor de este ensayo [7]. Tanto el
ensayo de BCA como el de Lowry se basan en la conversión del Cu 2+ a Cu1+ en condiciones
alcalinas. Esta conversión es definida como la reacción de Biuret. Esta reacción es
influenciada por cuatro aminoácidos (cisteína, cistina, tirosina y triptófano) y también por la
cadena peptídica.
[agrandar]
Figura 1. Representación esquemática del ensayo de BCA.

BCA es un reactivo cromogénico específico para Cu1+ y en el segundo paso de la reacción dos
moléculas de BCA reaccionan con una de ión Cu 1+. La cantidad de Cu2+reducido es función de
la concentración de proteínas y puede ser determinada espectrofotométricamente por un
cambio en el color de la solución a púrpura, que absorbe a 562 nm. La absorbancia es
directamente proporcional a la cantidad de proteína presente en la solución y puede ser
estimada por comparación con un estándar de proteína conocido, tal como la albúmina sérica
bovina (BSA, por sus siglas en inglés) [4, 8, 9].
El ensayo de BCA es más tolerante a diversos detergentes iónicos y no iónicos tales como el
NP-40, Triton X-100 y agentes desnaturalizantes como la urea y el cloruro de guanidinio, que
tienden a interferir con otros ensayos proteicos colorimétricos tales como el Lowry (Tabla 2)
[9]. Algunas moléculas químicas como: ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) [10], azúcares
reductores [11, 12] y lípidos [13] pueden interferir con el ensayo de BCA. El efecto de estas
interferencias puede ser eliminado o reducido por varias estrategias tales como la eliminación
de la substancia interferente por diálisis, cromatografía de exclusión molecular o, si la
concentración de la proteína es lo suficientemente alta, diluyendo la muestra. Recientemente,
Reichelt et al (2016) [14], propusieron ajustes simples al método que pueden llevar a mejorías
visibles en la exactitud de la medición, especialmente para soluciones complejas de proteínas
no purificadas, como medios de cultivo. Utilizan un factor de corrección dado por la medición
de BSA agregada a la muestra. Basado en sus estudios la exactitud de la cuantificación de
proteínas por BCA podría ser mejorada 5 veces, “llevando la cuantificación de proteínas por
BCA a niveles de exactitud comparables a otros métodos mas costosos” [14].
Otro factor que interfiere con la exactitud del ensayo de BCA es la presencia de residuos
modificados en las proteínas. En un estudio reciente, Brady y Macnaughtan (2015) [2]
evaluaron el impacto de la metilación de lisinas en los ensayos de Bradford y BCA y
encontraron que para el ensayo de BCA, la concentración de proteínas en la muestra con
proteínas metiladas era sobreestimada de manera consistente.
NP-40 Sacarosa
Emulgen Glicina, pH 2.8
HEPES Glucosa
DTT EDTA
Triton X-100 NaCl
Urea NaOH
Guanidinio HCl Sulfato de Amonio
Acetato de Sodio, pH 5.5 SDS
Tabla 2. Compatibilidad del ensayo de proteínas de BCA.

Thermo Fisher Pierce ha presentado recientemente una nueva versión del clásico ensayo de
BCA para proteínas compatible con agentes reductores tales como el ditiotreitol (DTT), el 2-
mercaptoetanol (BME), el TCEP y otros agentes reductores de puentes disulfuro [7].
Comparado con otros métodos, el ensayo de BCA es uno de los más sensibles (puede
detectar proteínas en concentraciones tan bajas como 5 ug/mL). Tiene menos variabilidad que
otros (por ej., el ensayo de Bradford), y puede ser utilizado para medir un amplio rango de
concentraciones de proteínas.
Más aún, su sensibilidad puede incrementarse haciendo el ensayo en presencia de
nanosensores plasmónicos como en el ensayo de SPR-BCA (del inglés, resonancia
plasmónica de superficie - BCA) propuesto por Liu et al [15]. Con este ensayo, el límite de
detección fue de 3,4 ng/ml y el rango general de trabajo fue de 0.5 a 1000 μg /ml,
disminuyendo la concentración de proteínas que puede ser determinada por el método
tradicional de BCA.
Ensayo de Bradford o azul brillante de Coomassie (rango: 20-2000 ug/ml)
El ensayo de Bradford, originalmente descripto por la Dr. Marion Bradford en 1976, es una de
los métodos más populares para la determinación de la concentración de proteínas. Se basa
en la formación de un complejo entre el colorante azul brillante de Coomassie G-250 y las
proteínas en solución. El colorante libre existe en cuatro formas iónicas. La forma azul más
aniónica se une a proteínas y absorbe a 590 nm. La concentración de proteínas puede ser
evaluada determinando la cantidad de colorante en su forma iónica azul y midiendo la
absorbancia de la solución a 592 nm utilizando un espectrofotómetro [16]. El colorante se une
principalmente a residuos de arginina, triptófano, tirosina, histidina y fenilalanina [4].
[agrandar]

Figura 2. Representación esquemática del ensayo de Bradford.

La mayoría de los investigadores utilizan BSA como estándar proteico ya que es económica y
de fácil disponibilidad, pero no siempre es adecuada. De hecho, una de las desventajas de
utilizar BSA es que produce una fuerte tinción con el colorante, pudiéndose subestimar el
contenido de proteínas. Se debería utilizar inmunoglobulina G (IgG) o lisozima, u otro estándar
proteico dependiendo del tipo de proteína de la muestra [16].
Entre las ventajas de este método se encuentran su compatibilidad con agentes reductores
utilizados para estabilizar las proteínas en solución, los cuales no son compatibles con el
ensayo de Lowry y en algún grado con el ensayo de BCA, y la posibilidad de medir proteínas
de alto peso molecular ya que el colorante no se une a péptidos de bajo peso molecular
[4, 16].
La principal limitación del ensayo de Bradford es su incompatibilidad con detergentes, los
cuales se utilizan de rutina para solubilizar proteínas de membrana. Sólo un nivel de
detergente no iónico muy bajo, tal como Triton X-100 a una concentración final de 0,008 %
(v/v), puede mejorar la sensibilidad y variabilidad del ensayo de Bradford [17]. Los detergentes
pueden ser eliminados por cromatografía de exclusión molecular o por diálisis, lo que lleva a la
dilución de la muestra; o por precipitación con fosfato de calcio [16] o acetona, ambos
métodos que permiten recuperar como mucho el 70 % de la cantidad inicial de proteína. En
una publicación reciente Cheng et al [18] describen un método basado en el ensayo de
Bradford que permite la cuantificación de proteínas de manera rápida incluso cuando la
solución de proteínas contiene substancias interferentes. El método demuestra una tasa de
recuperación de proteínas mejorada después de tan sólo 1 hora de precipitación en acetona
posterior a la adición de sacarosa, un componente que no interfiere con el ensayo de
Bradford.
Ensayo de Lowry para cuantificar proteínas (Rango: 10-1000 ug/ml)
El ensayo de Lowry, propuesto por Oliver H. Lowry en 1951, se basa en dos reacciones
químicas. La primera reacción es la reducción de los iones de cobre en condiciones alcalinas,
lo que forma un complejo con los enlaces peptídicos (reacción de Biuret). La segunda, es la
reducción del reactivo de Folin-Ciocalteu por el complejo cobre-enlace peptídico, la cual causa
un cambio de color a azulado en la solución, con una absorción en el rango de 650 a 750 nm
[4]. La cantidad de proteína en la muestra puede ser estimada utilizando una curva de
calibración con una solución de una proteína estándar seleccionada, tal como la BSA.
[agrandar]

Figura 3. Representación esquemática del ensayo de Lowry.

Las ventajas de este ensayo son su sensibilidad, y lo más importante, su exactitud. Sin
embargo, requiere de más tiempo que otros ensayos, y muchos compuestos comúnmente
utilizados en búferes de preparación de proteínas (tales como detergentes, carbohidratos,
glicerol, tricina, EDTA, Tris) interfieren con el ensayo de Lowry y forman precipitados (Tabla 3)
[4]. No obstante, el efecto de estas substancias puede ser reducido diluyendo la muestra, pero
sólo si la concentración de proteínas es lo suficientemente alta [19]. Además, se ha
demostrado que el tiempo para realizar este ensayo puede reducirse al aumentar la
temperatura o utilizando un horno microondas [19].
Detergentes Compuestos disulfuros
Carbohidratos Fenol
Glicerol Ácido úrico
Tricina Guanina
EDTA Xantina
Tris Calcio y Magnesio
Compuestos de potasio Compuestos sulfidrilos
Tabla 3. Ensayo de Lowry para cuantificar proteínas: substancias que interfieren.

El ensayo de 3-(4-carboxibenzil)quinolina-2-carboxialdehído (CBQCA) (rango 100 ng-1500 μg /ml)

La 3-(4-carboxibenzil)quinolina-2-carboxialdehído (CBQCA) es un reactivo fluorogénico
sensible utilizado para la detección de aminas en las proteínas. Dado que sólo puede detectar
aquellas aminas que se encuentran accesibles en la proteína, este método tiene las mismas
limitaciones que los métodos espectrofotométricos para los cuales el resultado depende del
número de ciertos aminoácidos en la proteína. Sin embargo, la CBQCA es muy sensible y
puede detectar entre 10 ng y 150 microgramos de proteína en un volumen de 100 μl.
También, en el lado positivo, el reactivo de CBQCA funciona bien en presencia de substancias
como lípidos que se sabe que interfieren en muchos otros métodos de determinación de
proteínas [20], o cuando se utiliza para cuantificar péptidos o proteínas ligadas a una
superficie o encapsuladas [3].
Ensayo de cuantificación de una proteína específica
Un paso crucial en muchos experimentos es la cuantificación de una proteína específica en
solución. Se han utilizado varias técnicas que logran tal cometido. Las más comunes
son ELISA, Western blot, y espectrometría de masas. El ELISA y el Western blot se describen
en Aplicaciones de anticuerpos, la espectrometría de masas se describe brevemente aquí, y
se analiza en el artículo de revisión de Labome Bioanálisis cuantitativo de proteínas por
espectrometría de masas.
Espectrometría de masas de proteínas
La espectrometría de masas de proteínas es un método emergente para la cuantificación de
proteínas. Un paso importante en el análisis proteómico, además de la caracterización
proteica, es la posibilidad de cuantificar una proteína específica. Se han introducido e
implementado muchas técnicas para la cuantificación de proteínas por espectrometría de
masas. Normalmente, se añaden isótopos estables más pesados de carbono ( 13C) o nitrógeno
(15N) a una muestra (péptidos o proteínas) mientras que sus isótopos ligeros correspondientes
(12C and 14N) se añaden a una segunda muestra (estándar interno) que luego se mezclan en el
análisis. Debido a la diferencia de masas es posible analizar la relación entre las intensidad de
los picos de las dos muestras por un analizador de masas la cual se corresponde con la
relación de sus abundancias relativas. Un segundo método para cuantificar proteínas por
espectrometría de masas se puede realizar sin marcar las muestras (esto es, con análisis por
desorción/ionización láser asistida por matriz, del inglés MALDI). Aquí quisiéramos resaltar la
posibilidad de utilizar un método universal como la espectrometría de masas para realizar
tanto ensayos cualitativos como cuantitativos en una sola medición. Por ejemplo,
recientemente, se han publicado múltiples métodos basados en la espectrometría de masas
desarrollados para la cuantificación de proteínas específicas en muestras biológicas . Como
ejemplo, sólo algunos del 2016: un método para la cuantificación del factor de crecimiento
insulínico 1 en el suero [21], un método para la cuantificación de albúmina en orina [22], y de
ubiquinona en suero/plasma [23] ]. En la literatura reciente, podemos encontrar métodos
menos específicos para la cuantificación de una proteína en concreto [24-26]. Sin embargo,
este método requiere de instrumentación que muchos laboratorios no pueden costear, lo que
limita su utilidad [8, 27].
[agrandar]
Figura 4. Representación esquemática de la cuantificación de proteínas basada en PQR en células vivas
individuales, de [28].

Cuantificación de proteínas en células vivas individuales

Ligar la expresión de una proteína de interés a la de un marcador fluorescente a través de un
constructo de “marcador para cuantificación de proteína” (del inglés, PQR) [28] puede
asegurar una expresión estequiométrica de la proteína y del marcador; por ende, la cantidad
de proteína puede deducirse a partir de la intensidad de fluorescencia (Figura 4). Este Esta
enlace puede hacerse mediante experimentos de transfección o por edición genómica.
Métodos basados en nanopartículas y nanoporos
Las ya mencionadas limitaciones de los métodos convencionales de cuantificación conducen
al desarrollo de nuevas estrategias para la determinación de proteínas en soluciones simples
y complejas. Una de las más populares se basa en el uso de nanopartículas, debido a sus
propiedades ópticas [29]. Brevemente, una propiedad importante es el cambio de la longitud
de onda a la cual absorben luz cuando su tamaño aumenta por la unión a otras moléculas o
por agregación [30]. Dado que el cambio de absorción de luz es en el rango visible, el cambio
se percibe como un cambio de color. Hasta ahora se han utilizado en conjunto con partículas
de unión a proteínas, por ejemplo anticuerpos, péptidos o aptámeros.
Más recientemente, Rogowski et al, propusieron un nuevo tipo de sensores de nanoparticulas
para la detección y cuantificación de proteínas, al que llamaron “nariz química” [31]. Su sensor
consiste de una mezcla de nanopartículas de oro con diferentes formas que se pueden
agregar de diferente manera diferencial cuando interactúan con diferentes proteínas (Figura
5). En base a su espectro de absorción lumínico, las partículas permiten la detección y
cuantificación de proteínas purificadas en soluciones acuosas o proteínas no purificadas en
soluciones complejas.
[agrandar]
Figura 6. Diagrama esquemático de moléculas de ADN portadoras translocando a través de un nanoporo (tal
como presentado en [32] ) (a); Pico de disminución de corriente causado por la translocación del ADN y caída
secundaria indicando ADN “cargado” (b); eventos de translocación del ADN en concentraciones crecientes de
proteína (c, d y e).

Un segundo método que ha sido desarrollado recientemente se basa en el uso de nanoporos

en estado sólido. Kong et al (2016) [32] utilizaron moléculas largas de ADN como portadoras y
nanoporos de vidrio para medir la concentración de proteínas en solución en el rango
nanomolar. En este método, las moléculas de ADN, capaces de unir proteínas en sitios
específicos, translocan a través de los nanoporos con la ayuda de una corriente eléctrica.
Cuando transloca, el ADN causa una caída en la señal de la corriente. Una segunda caída se
registra cuando la proteína se une al ADN. Cuanto más alta es la concentración de proteínas,
más cargado se encuentra el portador. La frecuencia de los picos de las caídas secundarias
de corriente también incrementa con la concentración de proteína (Figura 6).
Ensayos para medir proteínas en la literatura
Labome analizó 250 publicaciones revisadas por pares seleccionadas al azar que citaban
ensayos para medir proteínas totales, al 4 de septiembre de 2016. Se identificó que Thermo
Fisher Pierce y Bio-Rad Laboratories son los principales proveedores de kits de ensayos para
medir proteínas totales (Tabla 4). Los métodos utilizados más frecuentemente son los de BCA
y Bradford.
Ensayo Núm Proveedor Núm
BCA 140
Thermo Fisher Pierce 112
Sigma 8
Beyotime 2
otros 2
no especificado 10
Bradford 78
Bio-Rad 52
Thermo Fisher Pierce 9
Sigma 1
no especificado< 10
Lowry / ensayo modificado DC 21
Bio-Rad 17
Sigma 1
no especificado 2
Detección UV a 280 nm 12
Thermo Scientific (Nanodrop) 3
no especificado 8
Tabla 4. Estadísticas del análisisbibliográfico sobre los ensayos para medir proteínas totales y sus principales
proveedores. Núm es el número de publicaciones que citan el ensayo o el proveedor.

Ensayo de BCA
Prácticamente todos los ensayos para proteínas totales citados en el grupo de publicaciones
revisadas fueron suministrados por Pierce, compañía en donde uno de los científicos inventó
el ensayo hace muchos años. Thermo Fisher compró a Pierce hace unos años. Los ensayos
de BCA de Thermo Fisher Pierce se utilizaron para estudiar la carcinogénesis tiroidea [33], el
rol de VLDLR en la división celular [34], las modificaciones postraduccionales de S100A4 [35],
las proteínas humanas RNP H y RNP F como silenciadoras del receptor 2 del factor de
crecimiento de fibroblastos [36], el mecanismo subyacente al incremento de la actividad StAR
y aromatasa en la endometriosis [37], el efecto de la heparanasa en la adhesión y extensión
celular [38], la regulación y el rol de la expresión de NAG-1 en células PC-3 de cáncer de
próstata humanos tratadas con VES [39], el rol del receptor de IGF-1 en la función
fotoreceptora [40], el rol de Dlx5 en el acoplamiento entre osteoblastos y osteoclastos [41], y
en muchos otros [35, 40-108]. Sus kits de micro ensayos de BCA fueron utilizados para
estudiar la localización inmunohistoquímica de osteopontina en la glándula de la cáscara del
huevo, y en la cáscara del huevo de aves [109], para estudiar la recuperación tras el daño por
impacto cortical controlado en ratas [110], y la localización en membrana de la nucleoproteína
del virus de la hepatitis C y la propagación del virus [111] y otros [112].
También se citaron el reactivo de BCA de Sigma [113] y el kit de BCA de Bio-Rad también
fueron citados.
Ensayo de Bradford
Thermo Fisher Pierce también es uno de los principales proveedores de kits de ensayos de
Bradford. Los kits de ensayos de Coomassie/Bradford de Pierce se utilizaron para evaluar la
expresión de la proteína chaperona ERp29 [114], el rol de YKL-40 en la modulación de la
actividad biológica del factor de crecimiento de fibroblastos básico [115], entre muchos otros
tópicos de investigación [85, 99, 116-122].
Los reactivos de ensayos de Bradford de Bio-Rad fueron citados en numerosas publicaciones
[123-155].
Otros proveedores también proporcionaron kits de ensayo de Bradford, por ejemplo, Sigma
[156, 157] y Expedeon [158].
Ensayo de Lowry
El ensayo de Lowry de Pierce (número de catálogo 23240) se utilizó para cuantificar la
concentración de proteínas [159] y el de Bio-Rad Laboratories fue utilizado en [160] y [161]. El
ensayo de proteínas totales DC de Bio-Rad es una versión modificada del ensayo de Lowry.
Es uno de los ensayos más populares para proteínas dado que es compatible con
detergentes. Este kit ha sido utilizado para determinar la concentración de proteínas para
estudiar la estructura y función de la tetraspanina humana CD81 [162], el efecto de la ablación
específica en músculo esquelético de la gamma citoactina en el fenotipo mdx [159], entre
otros [56, 163-174].
Preguntas frecuentes
¿Es BSA un buen estándar?
El mejor estándar para la cuantificación de una proteína es la misma proteína que se está
cuantificando. Sin embargo, esto es improbable en la mayoría de los casos. BSA (albúmina
sérica bovina, por sus siglas en inglés) es el estándar de proteínas utilizado más
frecuentemente. Tiene limitaciones. En el ensayo de Bradford es más sensible que otras
proteínas, y por tanto la concentración de las proteínas en la muestra probablemente sean
subestimadas [175]. Además, la ASB , como proteína sérica, no puede ser obtenida/preparada
con gran pureza, ya que se une a muchos otros factores. Otras proteínas, tales como la
inmunoglobulina G y la lisozima también han sido utilizadas como estándares de proteínas.
La medición de mi muestra se encuentra fuera del rango de la curva de calibración, ¿se puede
extrapolar la curva de calibración?
No. Es de suma importancia que las mediciones caigan dentro del rango de la curva de
calibración. Se debe ajustar la dilución de la muestra o de la ASB, o de ambos.

Extracción y purificación de ADN

Anandika Dhaliwal (anandika dot dhaliwal at gmail dot com)
Rutgers University, New Jersey, United States
Translator
Agustin Carbajal (quiocarbajal at gmail dot com)
Cordoba, Argentina
DOI
//[Link]/10.13070/[Link].3.191
Date
fecha : 2018-05-24; original version : 2013-05-26
Cite as
MATER METHODS es 2013;3:191
Resumen
Revisión exhaustiva sobre kits de extracción y purificación de ADN citados en literatura.
English Abstract
A comprehensive review about DNA extraction and purification kits cited in literature.
Introducción
Consideraciones básicas
La extracción del ADN es necesaria en multitud de aplicaciones de la biología molecular.
Existe un gran número de kits comerciales. Se ha demostrado que la sensibilidad de detección
de la PCR es diferente para diferentes kits de ADN [1].
[agrandar]

Figura 1. Pasos básicos involucrados en todos los métodos de extracción de ADN.

 Seleccionar el kit correcto puede ahorrar un valioso tiempo en la optimización del kit y la
ejecución del experimento. Los factores a considerar para seleccionar un kit incluyen:
1. Origen de la muestra: diferentes kits son utilizados para diferentes orígenes, incluyendo tejidos
humanos, sangre, pelo, tejidos de roedores, hojas, bacterias, levaduras, hongos, insectos, heces, fluidos
corporales, esporas, suelo, muestras clínicas (por ej. muestras de biopsias, aspirados), muestras forenses
(por ej. manchas de sangre seca, hisopados bucales) y huellas dactilares.
2. Método de preparación: la preparación de la muestra puede ser: precipitados frescos o previamente
congelados, secciones de tejidos embebidos en parafina o fijados con formalina, secciones de tejido
congelado, células fijadas en etanol y muestras preservadas en Orange® .
3. Uso previsto: la calidad y pureza del ADN obtenido con el kit debe ser la adecuada para las
subsiguientes aplicaciones, las cuales pueden ser secuenciación, determinación del perfilgenético, PCR,
qPCR, Southern blot, RAPD, AFLP y RFLP, digestiones con enzimas de restricción, preparación de
bibliotecas génicas mediante secuenciación por “shotgun”.
4. Contenido húmico: si la muestra presenta contenido húmico tal como compost, sedimento y estiércol,
se debe utilizar un kit/método que elimine tales substancias, ya que podrían inhibir las subsiguientes
aplicaciones como la PCR.
5. Cantidad de muestra: el kit a ser utilizado depende del número de células de mamífero cultivadas
(105-107) y células bacterianas (106-1011), tejido (mg), cantidad de sangre (100 ul to 1 ml), suelo (250 mg - 10
g), tejido de hoja de planta (mg), etc.
6. Rendimiento.
7. Automatización.
8. Simplicidad: la operación del kit depende de la experiencia del personal.
Origen de muestra
CC TM Sa Ba Fu Al Le Pl In
microbios
Bacterial Genomic DNA Mini-prep Kit
*
(BayGene)
QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen) *
QIASymphony Virus/Bacteria Kits (Qiagen) *
ZR Fecal DNA Mini Prep (Zymo Research) * *
Plasmid Maxi Kit (Qiagen) *
BACMAX DNA purification kit (Epicentre
*
Biotechnologies)
PowerMax Soil DNA Isolation Kit (MO BIO
* * *
Laboratories)
PowerSoil DNA isolation kit (MO BIO
* * *
Laboratories)
Células y tejidos de mamíferos
AccuPrep Genomic DNA Extraction Kit
* * *
(Bioneer)
Arcturus DNA Extraction Kit (Arcturus) * *
GFX Genomic Blood DNA Purification Kit (GE
* *
Healthcare)
DNA Isolation Kit for mammalian blood (Roche) *
InnuPrep DNA minikit (AJ Innuscreen) * *
QIAamp DNA mini kit (Qiagen) * * *
AllPrep DNA/RNA Mini Kit (Qiagen) * *
Agencourt DNAdvance Kit (Beckman Coulter) * *
plantas
NucleoSpin 8 Plant and NucleoSpin 96 Plant II,
*
Clontech
DNeasy 96 Plant Kit (Qiagen) * *
Nucleon PhytoPure Genomic DNA Extraction
* *
Kits (GE Healthcare)
Células de mamíferos y microbios
DNA Isolation Kit for cells and tissues (Roche) * * * *
Purelink Genomic DNA extraction kit
* * * *
(Invitrogen)
DNeasy Blood and Tissue Kit (Qiagen) * * * * * *
Genomic DNA from Tissue kit (Macherey
* * * * *
Nagel)
GeneJET Genomic DNA Purification Kit * * * * *
FastDNA SPIN Kit ( MP Biomedicals) * * * * * * *
Células de mamíferos, microbios y plantas
ArchivePure DNA purification kit (5Prime) * * * * * *
DNA Isolation Kits (BioBasic) * * * * * * *
FastDNA Kit (MP Biomedicals LLC) * * * * * * * * *
DNAzol® Reagent (Invitrogen) * * * * * * * *
Easy-DNA® Kit (Invitrogen) * * * * * *
Wizard® Genomic DNA Purification Kit
* * * * * * *
(Promega)
sangre
DNA Isolation Kit for mammalian blood (Roche) *
InnuPREP Blood DNA Mini Kit (AJ Innuscreen) *
Porductos de PCR
Wizard® PCR Preps DNA Purification System
(Promega)
QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen)
MinElute PCR Purification Kit (Qiagen)
GenElute™ PCR Clean-Up (Sigma-Aldrich)
PureLink® PCR Purification Kit (Life
Technologies)
GeneJet PCR Purification Kit (Thermo
Scientific)
Extracción de gel
MinElute Gel Extraction Kit (Qiagen)
ZymocleanTM Gel DNA Recovery Kit (Zymo
Research)
Otros Kits
NEBNext DNA Sample Prep Reagent Set 1
(New England Biolabs)
GS FLX Titanium  Rapid Library Preparation
Kit (Roche)
Tabla 1. Kits
para la extracción y purificación de ADN. CC: células en cultivo; TM: tejido de mamíferos; Sa:
sangre; Ba: bacterias; Fu: hongos (fungi); Al: algas; Le: levaduras; Pl: plantas; In: insectos

Los criterios básicos que debería cumplir un método para purificar ADN de cualquier origen
incluyen: (1) extracción eficiente, (2) cantidad de ADN purificado suficiente para las
subsiguientes aplicaciones, (3) eliminación de contaminantes, (4) calidad y pureza del ADN.
La absorción ultravioleta puede ser utilizada para evaluar la pureza del ADN extraído. Para
una muestra pura de ADN, la relación entre la absorbancia a 260 y 280 nm (A260/A280) es
1.8. Una relación < 1.8 indica que la muestra se encuentra contaminada con proteínas o
solventes orgánicos como fenol. En la figura 1 se listan los pasos básicos involucrados en el
método de purificación de ADN.
Métodos comunes de purificación de ADN
Diferentes métodos de extracción resultan en diferente pureza y rendimiento de ADN. Algunos
de los métodos han sido evaluados sistemáticamente para aplicaciones específicas tales
como muestras de suelo y sedimento [2], microbioma humano [3], y muestras fecales [4-6].
Extracción orgánica
En este método convencional, ampliamente utilizado, las células son lisadas y los restos
celulares se eliminan generalmente por centrifugación. Las proteínas son
desnaturalizadas/digeridas utilizando una proteasa y precipitadas con disolventes orgánicos
tales como fenol, o una mezcla 1:1 de fenol y cloroformo, y el precipitado de proteínas es
eliminado por centrifugación. El ADN purificado suele ser recuperado por precipitación con
etanol o isopropanol. En presencia de cationes monovalentes como el Na+, y a temperatura
de -20°C, el etanol absoluto precipita eficientemente los ácidos nucleicos poliméricos dejando
atrás ácidos nucleicos monoméricos y de cadena corta, incluyendo los ribonucleótidos del
tratamiento con RNAsa en solución. Este método utiliza disolventes orgánicos tóxicos,
 relativamente laborioso, y el fenol o cloroformo residual pueden afectar las aplicaciones
subsiguientes tales como la PCR. El kit Easy-DNA® Kit (Invitrogen) es un ejemplo.
Tecnología basada en sílica
Este es un método ampliamente utilizado en los kits actuales. El ADN se adsorbe
específicamente a membranas/esferas/partículas de sílica en presencia de ciertas sales y a un
pH particular. Los contaminantes celulares son eliminados mediante diferentes pasos de
lavado. El ADN es eluído en un búfer de baja salinidad o búfer de elución. Se utilizan sales
caotrópicas para promover la desnaturalización de proteínas y la extracción del ADN. Este
método puede ser incorporados en columnas de centrifugado y microchips, es rentable, tiene
un procedimiento más simple y rápido que la extracción orgánica, y es compatible con la
automatización. Los kits basados en este método incluyen el Purelink Genomic DNA extraction
kit (Invitrogen) y el DNeasy Blood and Tissue Kit (Qiagen).
Separación magnética
Este método está basado en la unión reversible del ADN a una superficie/esferas/partículas
sólidas magnéticas, las cuales han sido recubiertas con un anticuerpo que une ADN o un
grupo funcional que interactúa específicamente con el ADN. Tras la unión del ADN, las
esferas son separadas de otros componentes celulares contaminantes, lavadas y finalmente
el ADN purificado es eluído utilizando extracción con etanol. Este método es rápido y puede
ser automatizado. Sin embargo, puede ser más costoso que otras metodologías. Ejemplos
son el kit Agencourt DNAdvance (Beckman Coulter) y el Magnetic Beads Genomic DNA
Extraction Kit (Geneaid).
Tecnología de intercambio aniónico
Este método se basa en la interacción específica entre los fosfatos cargados negativamente
presentes en los ácidos nucleicos y moléculas de superficie cargadas positivamente en el
substrato. Esta tecnología es utilizada más comúnmente en kits para el aislamiento de
plásmidos, tales como el PureLink® HiPure Plasmid DNA Purification Kits (Invitrogen), Qiagen
plasmid mini/midi kits y Genomic-tip, y NucleoBond® PC kits (Macherey Nagel).
Otros
Otros métodos incluyen la precipitación por sales (“salting out”), gradientes de densidad de
cloruro de cesio y resina chelex 100. Los métodos de aislamiento de ADN suelen ser
modificados y optimizados para diferentes tipos celulares. El bromuro de cetiltrimetilamonio
(BCTA) y el tiocianato de guanidinio (TCGI) suelen utilizarse en los protocolos de extracción
de ADN de materias vegetales, y se analizan con más detalle en la sección “extracción de
ADN de tejidos y células vegetales".
Kits Comerciales
La tabla 1 muestra los kits utilizados en general para la extracción y purificación de ADNsegún
el material de origen.
Aislamiento de ADN de microbios
Las células bacterianas se crecen en medio líquido hasta que alcanzan una densidad máxima
de 2-3x109 células/ml, y luego son recolectadas. Las células recolectadas son lisadas,
generalmente mediante el uso de reactivos químicos como la lisozima, EDTA, lisozima y
EDTA, detergentes, etc., seguido de la eliminación de componentes celulares utilizando el
método de extracción por disolvente, o tecnología basada en sílica, etc.. El último paso
conlleva la precipitación del ADN para obtener ADN puro y en alta concentración. Para
levaduras y otros microbios se sigue un procedimiento similar.
Los kits disponibles incorporan modificaciones en el búfer de lisis, el método de separación del
ADN, la membrana utilizada, el búfer de lavado y la recuperación del ADN, tal como se
describe a continuación y en la tabla 2.
1. Bacterial Genomic DNA Mini-prep Kit (BayGene/Sigma-Aldrich): este kit es aplicable tanto a bacterias
Gram negativas como positivas y el ADN extraído es adecuado para digestiones por endonucleasas de
restricción, PCR y Southern blots. Utiliza un sistema basado en sílica con un formato de microcentrifugado y
puede aislar ADN de hasta 50 kb de largo. En este kit las células se lisan enzimáticamente en una solución
que contiene sales caotrópicas, y el ADN es adsorbido específicamente en la membrana de sílica, luego los
otros componentes del lisado son lavados y los contaminantes eliminados. Por último, el ADN es eluído en
un búfer apropiado.
2. BACMAX DNA purification kit (Epicentre Biotechnologies/Cambio): es ideal para aislar ADN de
clones de copia única de BAC (cromosoma bacteriano artificial) o clones BAC CopyControl® inducidos, para
aplicaciones tales como secuenciación, identificación genética, PCR y preparación de bibliotecas de
secuenciación por “shotgun”. Se basa en un procedimiento de lisis alcalina modificado, y utiliza una mezcla
de EPICENTRE's® RiboShredder® y ARNasa junto con varios pasos de precipitación selectiva para eliminar
contaminantes.
3. QIASymphony Virus/Bacteria Kits (Qiagen): estos kits son utilizados en combinación con el
QIASymphony SP, y pueden purificar ADN de virus de ADN y ARN, así como de bacterias Gram negativas o
positivas. Permiten la purificación automática y simultánea de ácidos nucleicos virales del suero, plasma, o
fluido cerebroespinal, o ácidos nucleicos virales y bacterianos de varias muestras incluyendo hisopados,
aspirados, esputo, lavaje broncoalveolar, orina e hisopados urogenitales. Estos kits están basados en
tecnología de partículas magnéticas y producen ácidos nucleicos para ser utilizados directamente en
aplicaciones posteriores, incluyendo amplificación y reacciones enzimá[Link] kit es especialmente
aplicable para analizar la microbiota fecal y ha demostrado proporcionar la más alta diversidad, la más alta
calidad de ADN y el más alto rendimiento con muestras fecales humanas, comparado con otros kits
ampliamente utilizados [4]. ZR Fecal DNA Mini Prep (Zymo Research): ADN tanto del huesped como de las
bacterias y protistas (hasta 25 μg/prep) puede ser eficientemente extraído utilizando este kit a partir de ≤
150 mg de muestra de heces de mamífero. Las muestras son eficientemente lisadas mediante el batido de
microesferas de ultra alta densidad BashingBeads™. Se utilizan columnas de centrifugado rápido para aislar
el ADN, que luego se filtra para eliminar ácidos/polifenoles húmicos que puedan inhibir la PCR. El ADN
eluído está listo para ser utilizado en aplicaciones posteriores de base molecular incluyendo PCR,
microarrays, genotipación y detección de metilación.
4. Este kit también ha demostrado proporcionar una mayor diversidad,un ADN de mayor calidad y un
mejor rendimiento a partir de muestras fecales humanas comparado con otros kits de amplio uso, aunque
similar a los kits QIASymphony Virus/Bacteria Kits [4].
5. PowerSoil DNA isolation kit (MO BIO Laboratories Inc): este kit puede ser utilizado para aislar ADN
genómico de microbios de todo tipo de suelos y muestras ambientales, así como de muestras fecales y
biosólidos. Incluye un procedimiento patentado para la eliminación de substancias húmicas/marrones que
elimina los inhibidores de PCR de hasta los tipos de suelo más difíciles, y produce ADN de alta calidad que
puede ser utilizado en aplicaciones posteriores tales como PCR, qPCR y secuenciación de última
generación. Este kit ha sido empleado para la extracción de ADN para evaluar la microbiota de intestinos
humanos por secuenciación de ARNr 16S [5].
6. PowerMax Soil DNA Isolation Kit (MO BIO Laboratories Inc): este kit aísla ADN de grandes
cantidades de cualquier muestra ambiental o de suelo, con alta o baja carga microbiana incluyendo
bacterias Gram positivas y negativas, hongos, algas y actinomicetes, y con contenido húmico incluyendo
compost, sedimento y estiércol. Está basado en el kit PowerSoil® ADN Isolation Kit y además utiliza una
nueva y patentada tecnología para la eliminación de inhibidores de PCR, incluyendo substancias húmicas.
El color marrón a menudo se asocia con ADN de suelo.
7. UltraClean Microbial DNA Isolation Kit (MO BIO Laboratories Inc): este kit proporciona el aislamiento
de ADN genómico de alta calidad de hasta 50 kb o más, a partir de 1,8 ml de cultivo microbiano de varios de
microorganismos incluyendo levaduras, hongos, y bacterias y esporas Gram negativas y positivas. El
método de este kit consiste en lisar los microorganismos por una combinación de calor, detergentes y fuerza
mecánica con unas microesferas especiales. El ADN liberado es luego unido a una columna de centrifugado
de sílica, lavado y recuperado en tampón Tris certificado de no contener ADN. Este kit ha sido ampliamente
utilizado para analizar microbiomas fecales [6].
8. QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen): este kit proporciona un método miniprep para plásmidos que es
rápido, simple y rentable para aplicaciones rutinarias de laboratorio de biología molecular. Está basado en la
tecnología de membrana de sílica. El procedimiento está basado en la lisis alcalina de las células
bacterianas seguido de adsorción del ADN en sílica en presencia de alta cantidad de sales. El ADN
plasmídico purificado está listo para ser usado. La extracción por fenol y la precipitación por etanol no son
necesarios, y ADN plasmídico de alta calidad es eluído en un pequeño volumen de agua o tampón Tris.
9. Plasmid Maxi Kit (Qiagen): este kit puede ser utilizado para preparar ADN plasmídico superenrollado
ultra puro con alto rendimiento. Está basado en un procedimiento modificado de lisis alcalina, seguido de la
unión del ADN plasmídico a una resina patentada de QIAGEN bajo condiciones apropiadas de baja
salinidad y de pH. El ARN, proteínas, tintes, e impurezas de bajo peso molecular son eliminadas mediante
un lavado de salinidad media. Finalmente, el ADN es eluído en un tampón de alta salinidad y luego
concentrado y desalado por precipitación con isopropanol. Productos relacionados: QIAGEN Plasmid Midi
Kit [7] y QIAGEN Plasmid Mini Kit [8].
Kit Origen Rendimiento Usos y ventaja Referencias
 Produce ADN
para digestiones
El rendimiento por endonucleasas
varía desde 15 ug de restricción,
- 20 ug de ADN a PCR y Southern
Bacterial
partir de 0.8 - 1.5 blots. El ADN
Genomic DNA
Cultivo ml de cultivo de purificado posee [9]
Mini-prep Kit
toda la noche, una relación
(BayGene)
dependiendo del A260/A280 entre 1.6
origen y la y 1.9. Incluye
OD600 por ml. diluyente de
lisozima y
solución ARNasa
El ADN
purificado es
adecuado para el
secuenciación, la
genotipificación,
PCR y
Produce de 0.6 a preparación de de
BACMAX DNA BAC Cultivo de 25 ug de ADN de bibliotecas de
purification kit cromosomas CAB a partir de secuenciación por
[10]
(Epicentre artificiales de 1.5 a 100 ml de un “shotgun”. Evita
Biotechnologies) bacterias (CAB) cultivo de copia el uso de
única de CAB. columnas o
resinas de unión
que disminuyen el
rendimiento y
rompen el ADN.
Sin solventes
orgánicos tóxicos.
Totalmente
Materiales varios: automatizable y
suero, plasma, aplicable para
líquido purificaciones
hasta 96 muestras,
QIAsymphony cefalorraquídeo simultáneas de
en lotes de 24, son
Virus/Bacteria (LCR), ADN viral y [4]
procesadas en una
kits hisopados, bacteriano. Provee
única tanda
aspirados, esputo, ADN de alta
heces, lavaje calidad para
bronqueoalveolar aplicaciones
posteriores.
ZR Fecal DNA Heces de Hasta 25 μg de Aísla ADN libre [4]
Mini Prep (Zymo mamíferos ADN total es de inhibidores de
 PCR y es
adecuado para
PCR, microarrays,
eluido en ≥25 μl
genotipificación,
(humanos, ratas, de búfer de
detección de
Research) ratones, ganado) elución por
metilación, etc.
y aves muestra (≤ 150
Omite el use de
mg)
desnaturalizantes
orgánicos
(proteinasas).
Produce ADN
altamente
purificado libre de
inhibidores de
PCR, el cual
puede ser
Muestras utilizado para
PowerMax Soil Purifica ADN a
ambientales o de PCR y qPCR.
DNA Isolation partir de 10 g de
suelo con alto o Alta sensibilidad [2, 11]
Kit (MO BIO suelo en 30
bajo contenido de detección en
Laboratories) minutos.
microbiano muestras con baja
carga microbiana.
Produce ADN
altamente
purificado libre de
inhibidores de
PCR..
Suelo, muestras
PowerSoil DNA Provee ADN para
ambientales; Purifica ADN de
isolation kit (MO PCR, qPCR y
fecales, heces y 250 mg de suelo [12-14]
BIO secuenciación de
muestras en 30 minutos
Laboratories) última generación
biosólidas.
Produce ADN de Provee ADN para
UltraClean más de 50 kb de PCR, digestión de
Hongos, bacterias
Microbial DNA alta calidad. restricción. No se
Gram positivas y
Isolation Kit Purifica ADN de requieren [11]
negativas, esporas
(MO BIO cultivos disolventes
bacterianas
Laboratories) microbianos en 20 orgánicos tóxicos
minutos. ni enzimas.
QIAprep Spin cultivo Un cultivo de toda Produce ADN [15, 16]
Miniprep Kit la noche de 1,5 ml plasmídico de alta
(Qiagen) puede dar de 5 a calidad.
15 ug de ADN Preparación de
plasmídico. plásmidos de
 bajas copias o
cósmidos a partir
de 1 a 10 ml de
Procesa de 1 a 24
cultivo de toda la
muestras
noche de cultivos
simultáneamente
de E. colicultivos
en menos de 30
crecidos en medio
minutos.
LB. Purificación
de plásmidos muy
grandes (>50 kb).
Provee ADN
plasmídico
superenrollado de
alta calidad con
Rinde hasta 500
alto rendimiento
ug de plásmidos
para aplicaciones
Plasmid Maxi de alta calidad de
Cultivo de biología [8, 17-19]
Kit (Qiagen) hasta
molecular,
aproximadamente
transcripción y
150 kb.
traducción in
vitro, y
modificaciones
enzimáticas.
Tabla 2. Análisis general de los kits de extracción y purificación de ADN microbiano.

Extracción de ADN de células y tejidos animales

Los pasos básicos involucrados en la extracción de ADN de células y tejidos animales son los
mismos que los descritos en la introducción y para los microbios. Sin embargo, los kits
necesitan incorporar modificaciones para tener en cuenta las características especiales de las
células animales. El cultivo y la preparación de células animales son a menudo diferentes de
los utilizados para células microbianas. La mayoría de las células animales no tienen pared
celular como las células microbianas, y consecuentemente, son más fáciles de lisar y pueden
ser lisadas utilizando sólo detergentes. Sin embargo, el tejido animal necesita primero ser
homogeneizado mecánicamente o tratando con enzimas para ser lisado. La lisis celular es
seguida de la separación del ADN de otros componentes celulares, y su purificación. Muchos
kits no utilizan el método convencional de extracción orgánica requiriendo fenol/cloroformo y la
precipitación con etanol. Esto resulta útil ya que minimiza el daño al DNA producido por los
disolventes orgánicos. Por ejemplo, los kits AccuPrep Genomic DNA Extraction Kit (Bioneer) y
GFX Genomic Blood DNA Purification Kit (GE Healthcare) emplean empaques de columnas
con fibra de vidrio para extraer el ADN. El kit QIAamp DNA mini kit (Qiagen) utiliza columnas
que contienen membrana de sílicacapaces de retener el ADN bajo ciertas condiciones de
salinidad y pH. El kit Agencourt DNAdvance Kit (Beckman Coulter) utiliza separación
magnética.
Los kits disponibles para la extracción y purificación de ADN de células y tejidos de mamíferos
son descritos más abajo. Se incluye un resumen de estos kits en la tabla 3.
1. AccuPrep Genomic DNA Extraction Kit (Bioneer): este kit puede ser utilizado para extraer un
promedio de 6 ug de ADN a partir de 200 ul de sangre humana total y hasta 20 ug a partir de
5x106 linfocitos, 25-50 mg de tejido de mamífero, o 104-108 células cultivadas. Este kit es adecuado para
sangre total tratada con citrato o EDTA. No utiliza el método convencional para el aislamiento de ADN, y no
requiere extracción con fenol/cloroformo, precipitación por etanol, etc. Primero se homogeneiza el tejido
 utilizando un mortero. Este kit utiliza fibras de vidrio dentro de la columna, las cuales son capaces de unir
ADN en presencia de sales caotrópicas. Tras lavar los contaminantes, el ADN es eluido con una solución de
baja salinidad.
2. Arcturus® PicoPure® DNA Extraction Kit (Arcturus® PicoPure® DNA Extraction Kit,
LifeTechnologies-Invitrogen): estos kits pueden ser utilizados para cantidades muy pequeñas de células o
tejidos. Utiliza la técnica de microdisección por captura láser habilitada por láser IR, la cual es ideal para la
microdisección de una sola célula o un número pequeño de células.
El ADN puede ser extraído y amplificado en el mismo tubo, lo que minimiza la pérdida de ADN y maximiza la
cantidad de ADN aislado. Además, no requiere de disolventes orgánicos ni columnas de centrifugado. Si
bien la muestra puede ser preparada utilizando diversos métodos, los mejores resultados se obtienen a
partir de secciones de tejidos fijados en formalina y embebidos en parafina, secciones de tejidos
congelados, células fijadas con etanol, frotis citológicos y precipitados de células frescas o previamente
congeladas.
3. GFX Genomic Blood DNA Purification Kit (Amersham Bioscience, GE Healthcare): este kit puede ser
utilizado para la purificación de ADN a partir de sangre total, capa leucocitaria, médula ósea, células
eritroides nucleadas, células cultivadas, linfocitos y células bucales. Es adecuado para aplicaciones que
requieren de hasta 15 ug de ADN genómico, y utiliza columnas empacadas con una matriz de fibra de vidrio.
El kit permite tres métodos de purificación: 1) el método directo para procesar hasta 100 ul de sangre, 2) el
método escalable para procesar hasta 1 ml de sangre completa o médula ósea y hasta 50 ul de capa
leucocitaria, y 3) el procedimiento para linfocitos y células cultivadas el cual procesa hasta 5x106 de células
cultivadas o hasta 1x107 de linfocitos.
4. InnuPrep DNA minikit (Analytik Jena): este kit aísla ADN de muestras de tejido (hasta 50 mg), colas
de roedores (0,5-1 cm), muestras de tejidos embebidos en parafina y células eucariotas (5x106 células).
Este kit está basado en una tecnología patentada Dual Chemistry (DC) que combina un restrictivo tampón
de lisis con un novedoso tampón de unión que ayudan a minimizar el tiempo requerido para purificar ADN,
junto con columnas de filtrado por centrifugado. Después del paso inicial de lisis utilizando el tampón de lisis,
la extracción dura menos de 8 minutos. Productos relacionados: InnuPREP DNA Micro Kit, InnuPREP
DNA/RNA Mini Kit.
5. QIAamp DNA mini kit (Qiagen): este kit extrae ADN genómico, mitocondrial, bacteriano, parasítico o
viral a partir de tejidos humanos, hisopados (bucales, de ojo, nasal, faríngeo y otros), LCR, sangre, fluidos
corporales, y células lavadas de orina. El tejido es lisado enzimáticamente. Este kit es particularmente útil
para el análisis de la estructura de la comunidad bacteriana del microbioma humano. El uso del kit QIAamp
DNA mini kit junto con el empleo del batido con de microesferas y/o mutanolisina para la lisis celular han
demostrado proporcionar una mejor representación de la diversidad microbiana en la muestra comparado
con métodos sin ninguno de los dos (por ej. DNeasy Tissue kit, QIAamp stool kit) [3]. Productos
relacionados: QIAamp DNA micro kit [10], QIAamp DNA blood mini kit [20-23], QIAamp DNA stool mini kit
[16, 24-28], QIAmp DNA Blood Midi kit [29, 30], QIAamp 96 DNA Blood Kit [31, 32] y Blood Maxi Kit [33, 34].
6. Gentra Puregene Blood Kit (Qiagen): este kit permite aislar ADN a partir de sangre completa, médula
ósea, capa leucocitaria y fluidos corporales. Las células son lisadas con un detergente y aniónico en
presencia de un estabilizador de ADN. El ARN es degradado por una enzima de digestión de ARN. Otros
contaminantes, tales como proteínas, son eliminados por precipitación salina. Al final, el ADN genómico es
recuperado por precipitación con etanol y disuelto en tampón TE (1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCI pH 7.5).
Productos relacionados: Gentra Puregene Tissue Kit [35-38] y Gentra Puregene Cell Kit [23, 39-41].
7. AllPrep DNA/RNA Mini Kit (Qiagen): puede ser utilizado con hasta 107 células o 30 mg de tejido. Este
kit permite la purificación simultánea de ADN y ARN total a partir de una única célula o una muestra de
tejido, utilizando una innovadora columna de centrifugado AllPrep DNA Spin olumn, y una columna de
centrifugado RNeasy Mini Spin Ccolumn. Productos relacionados: AllPrep DNA/RNA Micro Kit.
8. Agencourt DNAdvance Kit (Beckman Coulter): es un kit de reactivos para el aislamiento de alto
rendimiento de ADN genómico a partir de muestras de tejidos de mamíferos frescas o congeladas. Utiliza la
tecnología patentada por Agencourt de esferas paramagnéticas SPRI® para aislar ADN genómico. Este
procedimiento se realiza en un formato de 96 pocillos y es adecuado para la automatización.
Kit Origen Rendimiento Uso y ventaja Referencias
AccuPrep Sangre total, 6 ug de ADN Extracción de ADN [42]
Genomic linfocitos, genómico total a genómico total. Alta
DNA tejido de partir de 200 ul de pureza de ácidos
Extraction mamíferos y sangre humana nucleicos y alto
Kit células en completa y hasta 20 rendimiento.
(Bioneer) cultivo. ug a partir de
 5x106 linfocitos, 25-
50 mg de tejido de
mamífero, o 104-
108 células en
cultivo.
Tejido de
mamíferos y
células en
cultivo
Proporciona
una fiable y
reproducible Proporciona ADN
recuperación para ensayos de PCR
de ADN de tan en tiempo real para
Arcturus® poco como 10 un cierto marcador o
PicoPure® células de forma cuantitativa.
DNA preparadas por Funciona con la
[43]
Extraction microdisección mayoría de los
Kit por captura tejidos y
(Invitrogen) láser y también procedimientos de
puede ser preparación de
utilizada para células. Extracción
muestras eficiente.
mayores de
hasta varios
microgramos
de tejido o
precipitados
celulares
Proporciona ADN para
Provee de 2 a 4 ug de
digestiones de
ADN a partir de 100
Sangre restricción, PCR e
ul de sangre completa
completa, capa hibridización en
humana y 10 a 15 ug
leucocitaria, Southern. El tiempo
a partir de 5 ul de
GFX médula ósea, del procedimiento es
células sanguíneas
Genomic células de alrededor de 15-20
nucleadas utilizando
Blood DNA eritroides minutos. Noutiliza
el método directo, 4.5 [44, 45]
Purification nucleadas, fenol o cloroformo,
a 7.5 ug de ADN a
Kit (GE células en evita tener que
partir de 300 ul de
Healthcare) cultivo, deshacerse de las
sangre humana
linfocitos y soluciones de esferas
utilizando el método
células de cristal, así como los
escalable, y 8 a 14 ug
bucales. lavados en tanda y las
a partir de 2 x
precipitaciones con
106células cultivadas.
etanol. Escalable
 El rendimiento y el
tiempo de procesado
Muestras de
dependen del uso de
tejido, colas de
instrumentos Proporciona ADN para
roedores,
InnuPrep FastPrep, PCR. Produce
muestras de
DNA adaptadores, y muestras de manera
tejidos [46]
minikit (AJ matrices de lisado. rápida y reproducible.
embebidos en
Innuscreen) Posee una capacidad Certificado para uso de
parafina y
de unión de columna diagnóstico in vitro
células
de: >100 ug ADNg y
eucariotas
puede rendir hasta 65
ug.
Proporciona ADN para
Puede purificar ADN
PCR, RT-PCR,
de hasta 50 kb. El
Southern blot,
Tejido rendimiento para
genotipificación por
humano, ácidos nucleicos o
SNP y STR, e
hisopados ADN depende del
investigación
(bucales, de material de partida.
farmacogenómica.
QIAamp ojo, nasal, Por ejemplo, rinde 4-
Tiene un rendimiento
DNA mini faríngeo y 12 ug de ADN a [47-54]
alto y consistente. El
kit (Qiagen) otros), LCR, partir de 200 ul de
ADN puede ser
sangre, fluidos sangre, 25-50 ug de
purificado a partir de
corporales y ADN a partir de 200
hasta 25 mg de tejido o
células lavadas ul de capa
de 200 ul de fluido en
de orina. leucocitaria y 15-20
20 minutos. Puede ser
ug de ADN a partir
automatizado en el
de 106 células.
QIAcube
AllPrep Muestras El ADN genómico Purificación [55, 56]
DNA/RNA celulares o de purificado tiene en simultánea de ADN y
Mini Kit tejido promedio 15-30 kb ARN total. El ADN
(Qiagen) dependiendo de las genómico purificado
condiciones de es adecuado para
homogeneización. El Southern y análisis de
ARN total es de alta dot y slot blot; y PCR
calidad y tiene un y PCR Multiplex. El
valor de RIN de 10 ARN total purificado
indicando que el es adecuado para RT-
ARN está intacto. PCR y RT-PCR en
tiempo real;
visualización
diferencial
(“diferential display”),
síntesis de ADNc,
Northern, dot-slot blot;
 y microarrays.
El rendimiento
depende del tipo de
muestra, el tamaño Proporciona ADN de
del genoma del alta calidad (relación
organismo origen, y A260/A280 superior a
Sangre total, el número de células 1.7) para almacenar y
Gentra médula ósea, en la muestra. El para su uso inmediato
Puregene capa rendimiento también en aplicaciones
[57, 58]
Blood Kit leucocitaria y depende también de posteriores.
(Qiagen) fluidos la calidad del Proporciona ADN
corporales. material de partida. purificado de tamaño
Por ejemplo, 16-50 mayor a 50 kb,
ug a partir de 1 ml de típicamente en el
sangre completa y 2- rango de 100-200 kb.
50 ug a partir de 1 ml
de fluidos corporales.
PCR, qPCR, AFLP,
RFLP, RAPD,
microsatélite, análisis
de SNP (para
genotipificación,
identificación
El rendimiento
genómica, etc.),
depende del tipo de
secuenciación y
muestra. Puede
resecuenciación
producir sobre unos
Agencourt clínica, y análisis en
18, 25 y 35 ug de
DNAdvance geles de agarosa.
Tejido de ácidos nucleicos a
Kit Proporciona el [59]
mamíferos partir de 25 mg de
(Beckman aislamiento de ADN
muestra de hígado de
Coulter) genómico con un alto
rata, cerebro de rata y
rendimiento. Sin
cola de rata (resumen
extracción orgánica o
del producto,
centrifugación/filtrado.
[Link])
Tres placas de 96
pocillos pueden ser
procesadas en unos
alrededor de 75
minutos con el equipo
adecuado.
Tabla 3. Resumen de los kits de extracción y purificación de ADN de tejidos y células animales.

Extracción de ADN a partir de células y tejidos vegetales

Los pasos básicos utilizados en el aislamiento de ADN, como se menciona anteriormente,
necesitan ser modificados para considerar las diferentes características de los tejidos y células
vegetales. Los productos químicos o enzimas utilizados para lisar células microbianas pueden
 no ser igualmente efectivos con células vegetales. Más aún, el contenido bioquímico dentro de
la célula vegetal es muy diferente al de microorganismos y células animales. Muchas especies
de plantas poseen un alto contenido de polisacáridos y polifenoles los cuales no son
eliminados mediante extracción con fenol (a diferencia de los microbios). Es necesario incluir
en los kits métodos diferentes a los utilizados para microbios para poder abordar las
características especiales de las células vegetales.
Un método es utilizar un detergente llamado bromuro de cetiltrimetilamonio (BCTMA) el cual
forma un complejo insoluble con ácidos nucleicos y precipita selectivamente el ADN, dejando
atrás carbohidratos, proteínas y otros componentes contaminantes. El precipitado que
contiene el ADN puede ser desacomplejado disolviéndolo en 1N NaCl. El BCTMA puede ser
usado en cualquier paso del proceso de extracción. Para eliminar polifenoles se pueden
utilizar concentraciones mayores de BCTMA con polivinilpirrolidona o polivinilpolipirrolidona.
Otro método es utilizar tiocianato de guanidinio (TICG), que ayuda en la purificación de ADN
vegetal de dos maneras. En primer lugar, desnaturalizada y disuelve proteínas, desintegra
estructuras celulares, y disocia nucleoproteínas presentes en los ácidos nucleicos. Debido a
esta propiedad, el TICG puede ser utilizado para extraer el ADN de prácticamente cualquier
tipo de tejido. En segundo lugar, el ADN se une fuertemente a partículas de sílica en
presencia de TICG. Esta propiedad puede ser utilizada para separar el ADN de las proteínas
desnaturalizadas y otros componentes bioquímicos o celulares. Comúnmente, las partículas
de sílica se empaquetan en columnas de cromatografía y se les aplica el extracto de ADN
tratado con TICG. El ADN se une selectivamente a la columna y puede ser eluído en el último
paso una vez lavados los contaminantes celulares. En algunos procedimientos de extracción
de ADN se puede añadir ácido ascórbico, ácido dietilditiocarbámico y 2-betamercaptoetanol
para proteger el ADN contra la oxidación y degradación. El ARN puede ser eliminado
utilizando ARNasa. La calidad del ADN aislado depende en gran medida de la condición
fisiológica del material vegetal más que del protocolo del kit.
Los kits disponibles para la extracción de ADN de materiales vegetales se analizan más abajo.
Un resumen de estos kits se incluye en la tabla 4. Véase también los kits que pueden ser
utilizados para células de mamíferos, microbios y plantas en general.
1. NucleoSpin 8 Plant and NucleoSpin 96 Plant II (Clontech): estos kits pueden ser utilizados para el
aislamiento de ADN genómico a partir de células y tejidos vegetales. Es adecuado para PCR, Southern blot
o cualquier tipo de reacción enzimática. También permite el aislamiento de ADN genómico en paralelo en un
formato flexible de tiras de ocho pocillos y en bandejas de 96 pocillos de alta capacidad de procesado. Tras
la homogeneización del material vegetal, el protocolo del kit utiliza un búfer de lisis conteniendo BCTA,
garantizando la lisis el material vegetal. Como alternativa también incluye un tampón de lisis con SDS. Tras
la eliminación de polisacáridos, contaminantes, y restos celulares residuales en el paso subsiguiente, el
lisado conteniendo principalmente ADN es aplicado a una membrana de sílica para purificarlo aún más.
Finalmente, el ADN es eluído en tampón de elución o en agua destilada. También se incluye en el kit
ARNasa para la eliminación eficiente del ARN.
2. DNeasy 96 Plant Kit (Qiagen): éste puede ser utilizado para aislar hasta 15 ug de ADN celular total
por pocillo a partir de tejido vegetal, incluyendo células vegetales, tejidos vegetales y hongos. El kit DNeasy
Plant Mini Kit puede ser utilizado para procesar hasta 100 mg de tejido, el kit DNeasy Plant Maxi Kit puede
procesar hasta 1 g de tejido. Brevemente, el material vegetal es homogeneizado, y luego incubado en búfer
de lisis conteniendo ARNasa. Tras la lisis, las proteínas y polisacáridos son precipitados con sal. Los restos
celulares y el precipitado son eliminados utilizando la columna QIAshredder. La muestra luego es aplicada a
una membrana de sílica empacada en columnas de centrifugado, y tras algunos pasos de lavado, el ADN es
eluído en un tampón de baja salinidad o en agua. Está disponible en un formato conveniente de bandeja de
96 pocillos y propociona un rendimiento altamente reproducible de ADN celular total. Productos
relacionados: DNeasy Plant Mini Kit [60-62].
3. Nucleon PhytoPure Genomic DNA Extraction Kits (GE Healthcare): este kit puede ser utilizado para
aislar ADN de muestras vegetales frescas, congeladas o liofilizadas, y también puede ser utilizado para
muestras fúngicas. Este kit utiliza un protocolo único con la resina Nucleon PhytoPure que une
específicamente polisacáridos. El sistema de extracción Nucleon PhytoPure posee un protocolo
relativamente más simple que no requiere fenol ni BCTMA. Brevemente, se rompe la pared celular y las
células se lisan en un reactivo conteniendo dodecil sulfato de potasio. El dodecil sulfato se utiliza por su
capacidad para formar complejos con proteínas y polisacáridos. Luego se agrega cloroformo junto con una
resina especialmente modificada patentada por Nucleon PhytoPure, la cual une polisacáridos
 covalentemente. Como resultado se obtiene un ADN de alta calidad con este el último paso. Junto con
cloroformo, este procedimiento utiliza isopropanol frío y etanol 70 %.
Kit Origen Rendimiento Uso y ventaja Referencias
El ADN extraído puede ser
utilizado para PCR,
NucleoSpin 8 Puede aislar Southern blot, o cualquier
Plant and Células y fragmentos de 50 tipo de reacción enzimática.
NucleoSpin tejidos pb-30 kb en un El procesado se puede [63, 64]
96 Plant II vegetales volumen de elución hacer por vacío o por
(Clontech) de 100-200 ul. centrifugado. Adecuado
para procesado manual y
automático.
El rendimiento El ADN es apto para PCR,
típico es de 1-15 ug análisis RAPD, análisis
cada 50 mg de AFLP, análisis RFLP,
tejido de hoja Southern blot, análisis de
vegetal, con un microsatélites,
Células y volumen de elución genotipificación por SNP y
DNeasy 96
tejidos de 100-200 ul. La PCR en tiempo real
Plant Kit [65]
vegetales, cantidad de ADN cuantitativa. No requiere de
(Qiagen)
y hongos varía entre especies extracción orgánica ni
dependiendo del precipitación por etanol.
tamaño del genoma, Proporciona un rendimiento
ploidía, número de reproducible y está
células y edad del disponible en un formato de
tejido. bandeja con 96 pocillos.
Proporciona ADN apto para
digestión con enzimas de
Nucleon restricción, RAPD y AFLP.
PhytoPure Protocolo rápido y simple.
Genomic Muestras Evita el uso de fenol o
Puede generar altos
DNA vegetales bromuro de [66]
rendimientos.
Extraction y fúngicas cetiltrimetilamonio
Kits (GE (BCTMA). El
Healthcare) procedimiento puede ser
completado en alrededor de
1 hora.
Tabla 4. Resumen de kits de extracción y purificación de ADN para tejidos y células vegetales.

Kits para tejidos y células animales y microbios

A continuación se detallan los kits que pueden ser utilizados para la extracción de ADN de
mamíferos, así como de microorganismos. Un resumen de estos kits se muestra en la tabla 5.
1. DNA Isolation Kit for cells and tissues (Roche): este equipo puede ser utilizado para la extracción de
ADN genómico a partir de tejidos (hasta 1 g), células cultivadas (hasta 107), bacterias (hasta 1011) y
levaduras. Evita el uso de extracciones orgánicas, columnas de intercambio aniónico y reactivos
caotrópicos. Provee ADN genómico de entre 50 y 150 kb, y el procedimiento puede ser completado en
alrededor de 2,5 horas.
2. Purelink Genomic DNA extraction kit (Invitrogen): este kit aísla ADN a partir de un amplio rango de
tamaños de muestras de sangre (100 ul a 1 ml), tejidos, células, bacterias, hisopados bucales, manchas de
sangre, tejidos FFPE, y muestras preservadas en Oragene®. Se basa en la tecnología de membrana de
sílica. Este kit proporciona una flexibilidad mayor al incluir una versión de 96 pocillos que no requiere de
ningún equipo especial y puede ser procesada manualmente o en plataformas automatizadas.
3. DNeasy Blood and Tissue Kit (Qiagen): este kit puede utilizarse para aislar ADN total (genómico,
mitocondrial, y patógeno) a partir de muestras de diversos orígenes incluyendo tejidos y células animales
fijados en formalina o embebidos en parafina, colas de roedores, sangre, bacterias, levaduras, pelo,
insectos, etc. El ADN purificado puede tener un tamaño de hasta 50 kb, predominando fragmentos de 30 kb.
Recupera eficientemente fragmentos de ADN de tan solo 100 pb. Este kit utiliza una tecnología basada en
sílica donde membranas de sílica con capacidad de unir específicamente el ADN son empacadas en
columnas de centrifugado. Tras la lisis celular utilizando un tampón de lisis, el procedimiento de extracción
de ADN puede completarse en alrededor de 20 minutos.
4. NucleoSpin® Tissue XS kit (Macherey Nagel): este kit puede utilizarse para el aislamiento de ADN
genómico a partir de tejidos (por ej., riñón de ratón, disecciones con micro láser), células (por ej., bacterias,
levaduras y células en cultivo), muestras clínicas (por ej., muestras de biopsias, aspirados de aguja fina) y
muestras forenses (por ej., manchas de sangre seca, hisopados bucales, huellas dactilares). Su principal
ventaja es que proporciona una recuperación de ADN reproducible y fiable a partir de tan solo 10 células
obtenidas por microdisección por captura láser y también puede utilizarse para muestras mayores de hasta
varios miligramos de tejido o precipitado de células. Este kit también utiliza una tecnología basada en
membrana de sílica. Productos relacionados: Tissue, NucleoBond® AXG, NucleoSpin® 8 Tissue Core kit,
NucleoSpin® 96 Tissue Core kit.
5. GeneJET Genomic DNA Purification Kit: este kit permite las purificación rápida y eficiente de ADN
genómico de alta calidad a partir de diversas muestras de tejidos y células en cultivo de mamíferos, sangre
completa, bacterias y levaduras. Utiliza tecnología de membrana basada en sílica en forma de prácticas
columnas de centrifugado y el procedimiento requiere menos de 20 minutos tras la lisis celular. Produce
ADN purificado de tamaño mayor a 30 kb que puede utilizarse directamente en experimentos de PCR,
Southern blot y reacciones enzimáticas.
6. FastDNA SPIN Kit (MP Biomedicals): este kit está diseñado para el aislamiento de ADN genómico a
partir de plantas, animales, bacterias, levaduras, algas y hongos utilizando un método de centrifugado con
filtro de sílica. Puede utilizarse junto con cualquier instrumento FastPrep® para lisar y luego aislar ADN de
hasta 200 mg de prácticamente cualquier muestra en menos de 30 minutos. El instrumento FastPrep® es un
dispositivo de sobremesa que utiliza un movimiento vertical angular patentado para homogeneizar las
muestras por impacto simultáneo y multidireccional con partículas de la matriz de lisis. El instrumento
FastPrep® proporciona una homogeneización extremadamente rápida, eficiente y altamente reproducible
que supera los métodos tradicionales utilizando digestión enzimática, sonicado, mezclado, homogenizado
(Dounce) y vortexado. Tras la lisis, las muestras son centrífugadas para precipitar la matriz de lisis junto con
los restos celulares. El ADN se purifica entonces a partir del sobrenadante con un procedimiento
GENECLEAN basado en sílica utilizando filtros SPIN. El ADN purificado es apto para digestión,
electroforesis, PCR y cualquier otra aplicación deseada.
Kit Origen Rendimiento Uso y ventaja Referencias
DNA Tejido, células El rendimiento y proporciona [67]
Isolation cultivadas, bacterias calidad del ADN ADN para
Kit for cells y levaduras. depende en gran PCR,
and tissues medida de la secuenciación
(Roche) calidad del y Southern
material de blots. No se
partida, el requieren
número de extracciones
células por con
muestra y el disolventes
tamaño del orgánicos,
genoma del columnas de
origen de la intercambio
muestra. aniónico ni
reactivos
 caotrópicos.
Se puede
obtener ADNg
de alta pureza
(A260/A280=
1.86-1.88,
A260/A230=
2.18-2.31), el
cual es
adecuado para
Sangre, tejidos,
PCR, PCRq,
Purelink células, bacterias,
electroforesis,
Genomic hisopados bucales, 5-25 ug de ADN
Shouthern
DNA manchas de sangre, a partir de 5x105 -
blot, [68, 69]
extraction tejidos FFPE, y 5x106 células
genotipificació
kit muestras HEK 293.
n y otros.
(Invitrogen) preservadas en
Proporciona
Oragene®.
ADNg de alta
pureza, gran
flexibilidad y
puede
utilizarse para
un amplio
rango de
tamaños de
muestras.
El ADN
obtenido
puede ser
utilizarse para
PCR,
Células o tejidos El ADN
Shouthern
animales frescos o purificado tiene
blot, RAPD,
congelados, colas una relación
AFLP y
DNeasy de roedores, sangre, A260/A280 entre
RFLP.
Blood and bacterias, levaduras, 1.7-1.9, y su [8, 21, 35, 42, 44, 7
Recupera
Tissue Kit pelo e insectos. tamaño es de 0-97]
eficientemente
(Qiagen) Funciona con hasta 50 kb,
fragmentos de
muestras embebidas predominando
ADN de tan
en parafina o fijadas fragmentos de 30
solo 100 pb.
con formalina. kb.
Permite el
procesado
simultáneo de
múltiples
muestras.
 Proporciona
La longitud de los
ADN para
fragmentos de
PCR en
ADN genómico
tiempo real y
purificados
PCR múltiple.
dependen de la
Células frescas o Alta
calidad del
congeladas, tejidos, recuperación
Genomic material de
manchas de sangre de pequeñas
DNA from muestra y puede
sobre filtros cantidades de
Tissue kit variar entre 500 [53]
Guthrie/NucleoCard ADN.
(Macherey pb en muestras
® /FTA, hisopados Volúmenes de
Nagel) microdiseccionad
bucales, muestras elución muy
as por láser o
forenses pequeños (5 a
muestras
30 ul),
forenses, y hasta
otorgando
30 kb en tejidos
ADN
frescos o células
altamente
cultivadas.
concentrado.
Puede usarse
con muestras
de células y
tejidos de
diferente
procedencia y
proporciona
ADN
El rendimiento
genómico de
depende de la
alto peso
cantidad y el
molecular
origen de la
(>30 kb)
GeneJET Muestras de células muestra, por
adecuado para
Genomic y tejidos de ejemplo, rinde 4-
PCR,
DNA mamíferos, sangre 6 µg de ADN a [98]
experimentos
Purification total, bacterias, partir de 200 µl
de biología
Kit levaduras de sangre, 10-15
molecular,
µg a partir de
experimentos
corazón de ratón
de Southern
y 5-20 µg a partir
blot, etc. Es
de 2x106 células HeLa
fácil de usar y
viene con
columnas de
centrifugado
con tapa y
ensambladas
con tubos de
recolección
 El ADN
Aísla ADN a purificado es
FastDNA partir de hasta apto para
Células cultivadas,
SPIN Kit 200 mg de digestión,
plantas, animales,
( MP prácticamente electroforesis, [5]
bacterias, levaduras,
Biomedicals cualquier muestra PCR y
algas y hongos
) en menos de 30 cualquier otra
minutos. aplicación
deseada
Tabla 5. Resumen de kits de extracción y purificación de ADN de células y tejidos animales y microbios.

Kits para células de mamíferos, microbios y plantas

Los kits versátiles que pueden usarse para la extracción de ADN a partir de la mayoría de
orígenes, incluyendo mamíferos, microbios y plantas se detallan a continuación. Un resumen
de estos kits se incluye en la tabla 6.
1. ArchivePure DNA purification kit (5Prime): Este kit se utiliza para purificar ADN genómico,
mitocondrial o viral a partir de sangre total y médula ósea, células cultivadas, tejidos animales y vegetales,
bacterias Gram positivas y negativas y levaduras. Posee un sistema de purificación de ADN genómico en
fase liquida y utiliza detergentes no tóxicos y sales. El 95 % el ADN purificado posee una longitud mayor a
50 kb y se encuentra en general alrededor de las 100-200 kb.
2. FastDNA Kit (MP Biomedicals): Extrae ADN genómico a partir de tejidos vegetales y animales,
células cultivadas, bacterias, levaduras, hongos, algas, virus e insectos. Utiliza tubos optimizados Lysing
Matrix y un procedimiento GeneClean® basado en sílica para la purificación del ADN.
3. DNAzol® Reagent (Invitrogen): Este reactivo puede utilizarse para aislar ADN genómico a partir de
muestras sólidas y líquidas de origen animal, vegetal, fúngico y bacteriano. Está diseñado para utilizarse con
tejidos, células o sangre. Es un reactivo completo y listo para usar.
4. Easy-DNA® Kit (Invitrogen): Este kit puede usarse para aislar ADN genómico de alto peso molecular
a partir de muchos tipos de células y tejidos incluyendo tejido de mamíferos, sangre, folículos pilosos, colas
de ratones, hojas de plantas, levaduras y células de E. coli. Está basado en una modificación del método de
extracción orgánica. Utiliza cloroformo para eliminar contaminantes y etanol para precipitar y recuperar el
ADN aislado.
5. Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega): Puede utilizarse para aislar ADN a partir de
sangre total, de glóbulos blancos, células de cultivo de tejidos, tejidos animales, tejidos vegetales, levaduras
y bacterias Gram positivas y negativas. Brevemente, primero se lisan las células, luego se eliminan las
proteínas celulares por tratamiento con sales, el ARN ser elimina utilizando ARNasa, y finalmente el ADN es
precipitado utilizando isopropanol.
6. DNA Isolation Kits (BioBasic): Incluye los siguientes kits: Animal tissue & fungi genomic DNA
extraction prep kit, Bacteria genomic DNA prep kit, Blood genomic DNA prep kit, Plant genomic DNA prep
kit, Yeast genomic DNA extraction prep Kit. Los kits de BioBasic pueden utilizarse para aislar ADN a partir
de sangre, tejidos vegetales, tejidos y células de mamífero, bacterias y hongos [99].
Kit Origen Rendimiento Uso y ventaja Referencias
ArchivePure Sangre La cantidad y la Proporciona un [100]
DNA completa, calidad del ADN método para aislar
purification médula ósea, depende en gran ADN de alto peso
kit (5Prime) células medida de la calidad molecular con alta
cultivadas, del material de pureza. Procedimiento
tejidos partida, el número de rápido. La relación
animales y células por muestra y A260/A280  para ADN
vegetales, el tamaño del aislado varía entre 1.7
bacterias genoma del origen de y 2.0
Gram la muestra.
positivas y
 negativas y
levadura.
Tejidos
vegetales y
animales, Utiliza tubos con
FastDNA Kit células matriz de lisado y un Aísla ADN listo para
(MP cultivadas, procedimiento PCR. Proporciona
[101]
Biomedicals bacterias, GeneClean® basado muestras de manera
LLC) levaduras, en sílica para rápida y reproducible.
hongos, algas, purificar el ADN.
virus de
insectos.
Aísla ADN para
utilizar en digestiones
Material de con endonucleasas de
origen animal, restricción, Southern
Puede aislar ADN
vegetal, blots, , clonación
genómico a partir de
DNAzol® fúngico y molecular y PCR. Es
50 mg de tejido o 1 x
Reagent bacteriano, un reactivo completo [102-104]
107 a 3 x 107 células
(Invitrogen) incluyendo y listo para usar. Un
con un mililitro de
células, procedimiento
reactivo DNAzol®
tejidos y confiable, eficiente y
sangre. simple que puede
completarse en 30-60
minutos.
Proporciona ADN
adecuado para PCR,
hibridización de
Células y
ADN, construcción de
tejidos
bibliotecas génicas de
incluyendo
ADN genómico y
tejido de
otras aplicaciones.
mamífero,
Produce ADN de alta Puede obtener ADN
sangre,
Easy-DNA® calidad con un de alta calidad a partir
folículos
Kit tamaño promedio de muestras grandes o [105, 106]
pilosos, colas
(Invitrogen) entre 100 kb y 200 pequeñas de células,
de ratón,
kb. tejidos, plantas,
hojas de
levaduras, E. coli,
plantas,
sangre y folículos
levaduras y
pilosos. Un
células de E
procedimiento simple
coli.
que puede
completarse en <90
minutos.
 El rendimiento
depende de la especie
y la cantidad del
material de partida.
El rendimiento típico
incluye 5-15 ug de
ADN a partir de 300
ul de sangre humana,
Sangre total,
9.5 - 12.5 ug a partir
glóbulos
de 2.25 x 106 células
blancos, Proporciona de ADN
NIH/3T3 (ratón), 15-
células de adecuado para
30 ug a partir de 3x
Wizard® cultivos de amplificación,
106 células K562
Genomic tejido, tejidos digestión con
(humanas), 10-30 ug
DNA animales, endonucleasas de [21, 32, 107-
a partir de 0.5-1.0 cm
Purification tejidos restricción, e 111]
cola de ratón, 16 ug a
Kit vegetales, hibridizaciones en
partir de 5 x
(Promega) levaduras y membrana tales como
106 células Sf9
bacterias Southern blot y
(insecto), 7-12 ug a
Gram dot/slot blots.
partir de 40 mg hoja
positivas y
de tomate (tejido
negativas.
vegetal), 20 ug a
partir de 1 ml de
[Link] (bacteria) y
4.5-6.5 ug de ADN a
partir de 1 ml de
cultivo de toda la
noche de [Link]
(levadura).
Tabla 6. Resumen de kits de extracción y purificación de muestras de origen animal, microbiano y vegetal.

Kits específicos para sangre total

También hay kits disponibles para aislar ADN genómico a partir de sangre completa
específicamente. Estos kits incluyen los siguientes:
1. DNA Isolation Kit for mammalian blood (Roche): Este kit puede utilizarse para la extracción de ADN
genómico a partir de 1-10 ml de sangre completa (humana, de ratón, de rata). También puede usarse para
aislar ADN a partir de la capa leucocitaria y muestras de linfocitos. La cantidad promedio obtenida utilizando
este kit es de aproximadamente 350 ug/10 ml, variando entre 200-700 ug para sangre de humano sano
(promedio, 5x106 leucocitos/ml). Proporciona ADN adecuado para PCR, PCR larga, secuenciación y
Southern blot. Los beneficios de este kit incluyen el corto tiempo para todo el procedimiento (menos de 1,5
horas). También, la relación A260/A280 para las muestras de ADN aislado es generalmente 1.7-1.9
[67, 112].
2. InnuPREP Blood DNA Mini Kit (AJ Innuscreen): Este kit permite aislar directamente ADN genómico a
partir de muestras de sangre completa de hasta 300 ul. Proporciona altos rendimientos de hasta 12 ug
dependiendo de la muestra y de la cantidad utilizada. Las ventajas de este kit son que produce ADN
genómico de extremadamente alta calidad, y es de fácil uso, y también se encuentra certificado para uso de
diagnóstico in vitro. Productos relacionados: InnuPREP Blood DNA Master Kit, InnuPREP Blood DNA MIDI
Kit, InnuPREP Blood DNA MIDI Direct Kit.
Purificación de ADN de productos de PCR
1. Este kit se utiliza para purificar ADN de doble cadena amplificado por PCR. Los productos de la PCR
son purificados de los contaminantes de manera efectiva, incluyendo dímeros de cebadores y cebadores de
 amplificación. Proporciona una recuperación superior al 95 %cuando se aplican entre 50 ng y 16 ug de un
producto de PCR de 500 pb a 1 ml de resina. Genera rendimientos de un 70-90 % para fragmentos de 500
pb cuando la purificación es a partir de agarosa de bajo punto de fusión. Los beneficios de este kit son que
es un método de purificación directo de 15 minutos, es un proceso rápido y sencillo, y es relativamente
barato [59, 113].
2. QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen): Este kit puede purificar directamente productos de PCR de
doble o simple cadena (100 pb-10 kb) y el lavado de ADN proveniente de otras reacciones enzimáticas con
un rendimiento de hasta 10 ug y una recuperación de 90-95%. El sistema QIAquick combina la ventaja de la
tecnología de columnas de centrifugado con las propiedades de unión selectiva de una membrana de sílica
con un diseño único. En presencia de altas concentraciones de sales el ADN se adsorbe a la membrana de
sílica mientras que los contaminantes no son retenidos. Las impurezas son lavadas eficientemente, y el
ADN puro se eluye con búfer Tris o agua. El ADN purificado puede utilizarse para realizar restricción,
marcado, hibridización, PCR, ligado y transformación, secuenciación radioactiva y fluorescente,
transcripción in vitro o microinyección. La principal ventaja de este kit es el rápido lavado del ADN
[16, 49, 90, 101, 108, 114-129]. Productos relacionados: QIAquick Nucleotide Removal Kit y QIAquick Gel
Extraction Kit [11, 48, 57, 78, 123, 130-134].
3. MinElute PCR Purification Kit (Qiagen): Este kit está diseñado especialmente para el aislamiento
rápido y fácil de fragmentos de ADN de reacciones de PCR (70 bp - 4 kb), geles de agarosa, o reacciones
enzimáticas con un volumen de elución extremadamente pequeño de sólo10 µl. El MinElute PCR
Purification Kit contiene una membrana de sílica para la unión de ADN en tampón de alta salinidad y elución
con tampón de baja salinidad o agua. Incluye columnas de centrifugado para el lavado de productos de
PCR. Elimina cebadores, nucleótidos, enzimas, aceites minerales, sales y otras impurezas de la muestra de
ADN. Un indicador de pH permite una fácil determinación del pH óptimo para la unión del ADN a la columna
de centrifugado. El procedimiento puede ser automatizado por completo en el QIAcube. El ADN purificado y
altamente concentrado que se obtiene al utilizar este kit es adecuado para su uso directo en aplicaciones
tales como ligado y transformación, transcripción in vitro, secuenciación radioactiva y fluorescente,
amplificación, digestión con enzimas de restricción, microinyección, marcado e hibridización.
4. GenElute™ PCR Clean-Up (Sigma-Aldrich): El kit está diseñado para una rápida purificación de
productos de amplificación de PCR (100 pb a 10 kb) del resto de componentes de reacción incluyendo
exceso de cebadores, nucleótidos, polimerasa de ADN, aceite y sales. El ADN se une a una membrana de
sílica dentro de la columna de centrifugado. El ADN unido es luego lavado y el ADN limpio y concentrado se
eluye en el tampón deseado. Cada columna puede purificar hasta 100 µl o 10 µg de ADN amplificado por
PCR y recuperar hasta un 95 % de los productos de PCR entre 100 pb y 10 kb. El kit elimina >99 % de los
cebadores y la mayoría de los dímeros de cebadores (<40 pb). El ADN purificado es adecuado para
reacciones enzimáticas, secuenciación, clonado y análisis de microarray.
5. PureLink® PCR Purification Kit (Life Technologies): Permite una eliminación rápida y eficiente de
dímeros cortos, dNTPs, enzimas, productos de PCR de cola corta y sales. Este kit está basado en la unión
selectiva del ADN de doble hebra a membranas basadas en sílica en presencia de sales caotrópicas,
eliminando impurezas por el exhaustivo lavado con tampón de lavado y elución del ADN purificado en
tampón de elución de baja salinidad. Los kits son suministrados con dos búferes patentados: 1) el búfer de
unión para purificar fragmentos de PCR de ADN de doble cadena de 100 pb a 12 kb, y 2) el búfer de unión
de alto punto de corte para eliminar dímeros de cebadores o productos de PCR cortos contaminantes (<300
pb). El producto de PCR purificado es adecuado para secuenciación automática fluorescente de ADN,
digestión por enzimas de restricción y clonado.
6. GeneJet PCR Purification Kit (Thermo Scientific): Este equipo utiliza una tecnología de membrana
patentada basada en sílica, en forma de convenientes columnas de centrifugado para la purificación de
fragmentos de ADN de entre 25 pb y 20 kb con altas tasas de recuperación de hasta un 100%. Elimina de
manera efectiva cebadores, dNTPs, nucleótidos marcados no incorporados, enzimas, y sales de mezclas de
reacción de PCR y otras reacciones. El procedimiento requiere 5 minutos. El ADN purificado puede ser
utilizado en las aplicaciones posteriores más comunes, tales como secuenciación, digestión de restricción,
marcado, ligado, clonado, transcripción in vitro, experimentos de membrana o hibridización in situ.
Kit Origen Rendimiento Uso y ventaja Referencias
Wizard® Productos de Recuperacione Es un método [59, 113]
PCR Preps PCR s ≥ 95% de purificación
DNA pueden directa de 15
Purification obtenerse a minutos. Es un
System partir de entre proceso simple
(Promega) 50 ng y 16 ug y rápido, y es
 de productos
relativamente
de PCR de 500
barato.
pb
Permite un
lavado rápido.
Produce ADN
purificado para
realizar
restricción,
Proporciona un
marcado,
QIAquick Productos de rendimiento de
hibridización,
PCR PCR, hasta10 ug y [16, 49, 90, 101, 108, 114
PCR, ligado y
Purification reacciones una -129]
transformación,
Kit (Qiagen) enzimáticas recuperación
secuenciación
de 90-95 %
fluorescente y
radioactiva,
transcripción in
vitro, o
microinyección
.
Permite una
elución en
volúmenes
muy pequeños
(10 µl), dando
altos
Recuperación rendimientos
MinElute Productos de
de fragmentos de ADN
PCR PCR,
de ADN (70 altamente [135-137]
Purification reacciones
bp - 4 kb) de concentrado.
Kit (Qiagen) enzimáticas
80% Procedimiento
rápido y de
fácil manejo.
Da
recuperaciones
altas y
reproducibles.
GenElute™ Productos de Recupera hasta Puede purificar [137-139]
PCR Clean- amplificació un 95 % de hasta 100 µl o
Up (Sigma- n de PCR. fragmentos de 10 µg de ADN
Aldrich) PCR de entre amplificado
100 pb a 10 kb por PCR en 5
minutos.
Proporciona
 ADN aplicable
para reacciones
enzimática psp,
secuenciación,
clonado y
análisis de
microarrays.
Flexible y
económico.
Provee dos
opciones de
tampones de
unión, para
fragmentos
>100 pb o
>300 pb. Puede
Provee una utilizarse ya
PureLink®
recuperación sea en una
PCR
>80 % a partir única columna
Purification Productos de
de 50 - 100 μl o bien en placa [140-142]
Kit (Life PCR
de producto de de 96 pocillos
Technologies
PCR (50 ng - y toma <10
)
40 μg ADNdc) minutos.
Elimina
eficientemente
cebadores,
dNTPs, sales y
enzimas sin
precipitación
con etanol.
GeneJet PCR Productos de Proporciona Purificación [143-145]
Purification PCR, hasta 90 - rápida (5
Kit (Thermo reacciones 100% de minutos) y
Scientific) enzimáticas recuperación eficiente de
en el rango de fragmentos de
100 pb a 10 kb ADN, ideal
para todo tipo
de
procedimientos
convencionales
de biología
molecular tales
como
secuenciación,
digestión de
 restricción,
marcado,
ligado,
clonado,
transcripción in
vitro,
experimentos
de membrana o
hibridización in
situ. Es
práctico y
viene con
columnas de
centrifugado
que se tapan y
ensamblan con
los tubos de
recolección.
7. Tabla 7. Resumen de kits de purificación de productos de PCR y reacciones enzimáticas.

8. Kits para la extracción de ADN de geles

1. MinElute Gel Extraction Kit (Qiagen): Puede utilizarse para la extracción de fragmentos de
ADN (70 pb a 4 kb) de geles de agarosa estándar o de bajo punto de fusión con una recuperación del 80
%. Todas las enzimas son eliminadas, independientemente del tamaño o estructura secundaria. Este kit
combina la ventaja de la tecnología de las columnas de centrifugado con las propiedades de unión
selectiva de una membrana de sílica con un diseño único. El ADN se adsorbe a la membrana de sílica en
presencia de altas concentraciones de sales mientras que los contaminantes fluyen a través. Las
impurezas son lavadas eficientemente, y el ADN puro es eluído en tampón Tris o agua. El ADN purificado
puede utlizarse para realizar ligado y transformación, secuenciación radioactiva y fluorescente, digestión
con enzimas de restricción, marcado, hibridización, PCR, transcripción in vitro o microinyección. La
principal ventaja de este kit es su capacidad para obtener fragmentos de ADN purificado en altas
concentraciones (volumen de elución de 10 ul) [11, 134, 146]. Productos relacionados: MinElute Reaction
Cleanup Kit y MinElute PCR Purification Kit [11, 100, 147-150].
2. ZymocleanTM Gel DNA Recovery Kit (Zymo Research): Este kit proporciona una purificación
rápida de ADN de alta calidad de geles de agarosa con búfer TAE/TBE. Se basa en la tecnología Fast-
Spin. Para ADN de 50 pb a 10 kb, la tasa de recuperación es del 70-90%. Para ADN de 11 kb a 23 kb, la
recuperación es de 50-70%. El ADN purificado es adecuado para reacciones de ligado, secuenciación,
reacciones de marcado de ADN, PCR, etc. La principal ventaja de este kit es su capacidad de producir >6
ul de ADN purificado de alta calidad en 15 minutos [8, 151].
Otros kits
También hay kits disponibles para 1) preparar muestras de ADN para aplicaciones tales
como secuenciación de última generación y preparación de bibliotecas de expresión, 2)
purificar ADN de doble hebra amplificado por PCR y 3) generar bibliotecas de fragmentos a
partir de una muestra de ADN. Estos son los siguientes:
3. NEBNext DNA Sample Prep Reagent Set 1 (New England Biolabs): Consiste en enzimas y
búferes que son utilizados para la preparación de la muestra para la secuenciación de última generación,
y para la preparación de bibliotecas de expresión. Los componentes del kit son controlados por lote, tanto
individualmente como en conjunto. Los reactivos pasan por controles de calidad adicionales, y son
validados funcionalmente para proporcionar un rendimiento máximo. Las principales ventajas de este kit
incluyen: se encuentra disponible en sets, mezclas maestras y módulos; todos los reactivos pasan por
controles de calidad exhaustivos para asegurar una máxima calidad y pureza; y cada set o módulo de
reactivos es validado funcionalmente. Además, prepara las muestras para secuenciación de última
generación, construcción de bibliotecas de expresión, arrays de hibridización de alta densidad (SPRS2 y
SPMMS2) y métodos de hibridización de sustracción genómica (SPRS2 y SPMMS2) [101, 152, 153].
4. Wizard® PCR Preps DNA Purification System (Promega): Este kit se utiliza para purificar
ADN del doble cadena amplificado por PCR. Los productos de PCR son eficazmente purificados de
contaminantes , incluyendo dímeros de cebadores y cebadores de amplificación. Proporciona una
recuperación superior al 95 % cuando se aplican entre 50 ng y 16 ug de un producto de PCR de 500 pb a
1 ml de resina. Pueden esperarse rendimientos típicos de un 70-90 % para fragmentos de 500 pb en
purificaciones a partir de agarosa de bajo punto de fusión. Los beneficios de este kit incluyen que es un
método directo de purificación de 15 minutos, un proceso rápido y simple, y que es relativamente barato
[58, 151].
5. QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen): este kit puede purificar productos de PCR de doble
o simple cadena (100 pb a 10 kb) de manera directa, a partir de reacciones de amplificación y limpiar el
ADN de otras reacciones enzimáticas con un rendimiento de hasta 10 ug y una recuperación de un 90-95
%. El sistema QIAquick combina las ventajas de la tecnología de columnas de centrifugado con las
propiedades de unión de una membrana de sílica con un diseño único. El ADN se adsorbe a la membrana
de sílica en presencia de altas concentraciones de sal mientras que los contaminantes fluyen a través. Las
impurezas son eliminadas eficazmente, y el ADN puro es eluído con tampón Tris o agua. El ADN
purificado puede utilizarse para realizar restricción, marcado, hibridización, PCR, ligado y transformación,
secuenciación radioactiva o fluorescente, transcripción in vitro o microinyección. La principal ventaja de
este kit es la rápida limpieza del DNA [15, 48, 89, 100, 107, 113-128]. Productos relacionados: QIAquick
Nucleotide Removal Kit y QIAquick Gel Extraction Kit [11, 47, 56, 77, 122, 129-133].
6. GS FLX Titanium Rapid Library Preparation Kit (Roche): Este kit incluye los reactivos para la
creación de una biblioteca de fragmentos a partir de una muestra de ADN a secuenciar, tal como ADN
genómico de un organismo de interés. El procedimiento requiere de 500 ng de ADN, el cual debe ser de
doble hebra, posee una relación A260/A280 de alrededor de 1,8 y una concentración de al menos 5 ng/ul.
La biblioteca producida consistirá de un set de fragmentos de ADN de cadena simple representando la
secuencia completa de la muestra. Cada fragmentado se encuentra flanqueado por adaptadores de ADN
aptos para amplificación y secuenciación, y luego purificado y cuantificado. Las principales ventajas son
que esta tecnología es adecuada para secuenciar genomas de cualquier tamaño, y que el proceso puede
realizarse por una sola persona en un laboratorio adecuadamente equipado [154].
Kits para la extracción y purificación de ADN en publicaciones
Los kits de muchos proveedores se han utilizado para extraer o purificar ADN de distintos
orígenes en las 271 publicaciones analizadas por Labome.
Kit Núm Proveedor Núm
Microbios 25
Life Technologies 3
MO BIO Laboratories 6
Qiagen 16
Tejidos y células de mamíferos 18
Qiagen 18
plantas 8
Clontech 3
Qiagen 5
Células de mamíferos y microbios 32
Life Technologies 2
Qiagen 30
Células de mamíferos, microbios y plantas 14
 Epicentre Biotechnologies 2
Life Technologies 6
Promega 6
sangre completa 22
Illumina 3
GE Healthcare 5
Life Technologies 3
Qiagen 11
Otros Kits 60
Beckman Coulter 7
Life Technologies 5
New England Biolabs 3
Promega 2
Qiagen 39
Zymo Research 4
Tabla 8. El número de publicaciones (Núm) que cita cada tipo principal de kit de purificación y extracción
de ADN de los principales proveedores, al día 1 de Abril del 2015.

Aislamiento de ADN de microbios

El kit PowerMax Soil DNA Isolation Kit de MO BIO Laboratories se utilizó para investigar los
virus de Emiliania huxleyi en sedimentos del Mar Negro [2] y el intercambio de genes de
resistencia a antibióticos entre bacterias del suelo y patógenos humanos [11]. El kit
PowerSoil DNA isolation kit de la misma compañía se utilizó para estudiar la protección de
las plantas contra hongos patógenos de las raíces debida a bacterias de la tierra [12] y el
efecto de la dieta a largo plazo en la composición del microbioma intestinal [14].
El kit QIAamp DNA stool mini kit de Qiagen se utilizó para investigar el efecto de la
microbiota intestinal en la infección por virus entérico [16], el efecto regulatorio de PD-1 en la
selección de IgA y la composición de la microflora intestinal [24], la inmunidad protectora
conferida por la microflora dermal [25], la influencia de la interacción entre hongos
comensales y Dectin-1 en la colitis [26], la respuesta inmune a comensales inducida por
infección gastrointestinal aguda [27] y la protección contra el sistema inmune del mutualismo
huésped-bacteria en el intestino otorgada por la lectina antibacteriana RegIIIgamma [28]. El
kit QIAprep Spin Miniprep Kit de la misma compañía fue utilizado para investigar la
interacción entre p37 del virus Vaccinia y proteínas asociadas a LE [15] y el efecto de la
microbiota intestinal en la infección por virus entérico [16]. El kit Plasmid Maxi Kit, de la
misma compañía, se utilizó para investigar la regulación de los estados patogénicos y
mutualistas de Photorhabdus luminescens [8] y la estructura de la subunidad ribosomal 60S
eucariota en asociación con eIF6 [17].
Extracción de ADN de células y tejidos de mamíferos
El kit AllPrep DNA/RNA Mini Kit de Qiagen se utilizó para investigar las diferencias entre las
secuencias del ARN y el correspondiente ADN en el transcriptoma humano [55] y el origen y
evolución de los virus de reticuloendoteliosis [56]. El kit QIAamp DNA Mini Kit, de la misma
compañía, fue utilizado para investigar el origen de los transposones de ADN [52], la
protección de endosimbiontes de insectos por el péptido antimicrobial Co1A [53], la
interacción entre APOBEC3G y el virus de la leucemia murina [47], loci metilados asociados
con cáncer de próstata [48], la mutación de EGFR y KRAS en pacientes con
adenocarcinoma de pulmón [49], la relación entre el reloj circadiano y el riesgo de contraer
cáncer [50], la influencia de factores bacterianos y genéticos en el cáncer gástrico en Costa
Rica [51] y la relación entre la hipermetilación global y la inestabilidad cromosomal [54]. El kit
Gentra Puregene Tissue Kit, de la misma compañía, fue utilizado para investigar el rol de la
metilación del ADN en la regulación génica [23], la deleción del grupo de genes HoxC en
peces elasmobranquios [36], el daño al ADN y la tumorigénesis inducida por el metabolismo
de PAH mediado por las células de Langerhans [35], la fusión de cromosomas a través de
los extremos con deficiencia de telomerasa [37], la historia de la invasión de Solenopsis
invicta [38], y la inhibición de la biogénesis del ribosoma bacteriano [155]. El kit Gentra
Puregene Cell Kit, de la misma compañía, fue utilizado para investigar la relación entre los
polimorfismos de nucleótido único (SNPs) de GCH1 y el grado de dolor infligido por
capsaicina [39], la inducción de enfermedades linfoproliferativas por activación constitutiva
de JAK3 en ratones [40] y el rol de DGJ en la forma atípica de la enfermedad de Fabry [41].
Extracción de ADN de plantas
Las columnas NucleoSpin de Clontech se utilizaron para investigar las mutaciones de
NOTCH1 asociadas con los carcinomas de cuello y cabeza [100] y oligodendriomas
inducidos por mutaciones de CIC y FUBP1 [149].
El kit DNeasy Plant Mini Kit de Qiagen se usó para investigar la cepa de Phytophthora
infestans responsable de la patala en Irlanda [156], las relaciones mutualistas entre
orquídeas y abejas polinizadoras [60], epigenomas de arroz [61] y el mutualismo entre
plantas y hongos micorrízicos [62].
Extracción de ADN de células de mamíferos y microbios
El kit Purelink Genomic DNA extraction kit de Life Technologies Invitrogen se utilizó para
investigar la transformación de linfocitos en pollos inducida por el virus de Marek en pollos
[68] y la resistencia bacteriana a antibióticos [69].
El kit DNeasy Blood and Tissue Kit de Qiagen se utilizó para investigar la evolución de la
virulencia del Mycoplasma gallisepticum [157], la duración óptima del tratamiento con la
combinación más potente de antibióticos para inhibir el crecimiento bacteriano [158], la
asociación de aneuploidía en células tumorales con la inactivación de STAG2 [71], la
relación entre la inestabilidad del genoma mitocondrial con el cáncer de mama humano [72],
mutaciones de KRAS en carcinomas de ovario [73], el retrovirus recombinante XMRV en
muestras humanas [74], el daño al ADN y la tumorigénesis inducida por el metabolismo de
PAH mediado por células de Langerhans [35], falta de sueño en corremolinos/playeritos
pectorales macho [44], la relación entre de la sensibilidad al everolimus con la mutación de
TSC1 en pacientes con cáncer [75], la relación entre el estancamientode la Pol II, la
regulación de la expresión génica y la estructura de la cromatina [76], el efecto del
Anaplasma phagocytophilum en la actividad de catepsina L [77], la función de la
improntación de CDKN1C y de su activación [78], la regulación de la estabilidad de DNMT1
[79], los mecanismos moleculares de la génesis del meduloblastoma [80], el rango de
mutaciones del carcinoma escamoso de cuello y cabeza [81], la diversificación de mamíferos
[42], genomas y metagenomas [82], la adquisición de resistencia a avermectina en C.
elegans [83], la evolución de los cromosomas sexuales en las serpientes [84], el rol de la
decorina en cáncer [85], los genes de la señalización de EGFR en líneas celulares de cáncer
de pulmón [86], la regulación de secreción de la proteína quimioatractiva 1 de monocitos
[87], la expresión de PIK3CA en la superficie del epitelio del ovario [88], los cambios en la
metilación del promotor de ER beta en cáncer de ovario [89], la hepatotoxicidad inducida por
acetaminofeno [90], la participación de las actividades de Parp/Parg en el mantenimiento de
la metilación del ADN [91], el mecanismo detrás de la resistencia a la desecación en
Sinorhizobium meliloti Rm1021 [92], la relación entre PRDM9 y la activación de los lugares
diana de recombinación en mamíferos [93], el rol de Eos durante el silenciamiento de genes
dependiente de Foxp3 [94], la variación genética en Myodes glareolus [95], el rol de FGF21
en el alargamiento de la vida en ratones [159], la posible relación entre el síndrome de fatiga
crónica y el virus de leucemia murina [21], la influencia del ambiente en la expresión de
Agouti [70], el rol de LTA4H en la limitación de la inflamación neutrofílica pulmonar crónica
[97] y la regulación de los estados patogénicos y mutualistas de Photorhabdus luminescens
[8].
Extracción de ADN de células de mamíferos, microbios y plantas
El kit DNAzol de Life Technologies Invitrogen se utilizó para estudiar la formación del
heterodímero gE/gI en la extensión eficiente te de célula a célula [103], la represión de una
red pleiotrópica epigenética inducida por la mutación de CRABP2 [104], los microADN en
células de mamíferos [102], y el ciclo celular asimétrico [160]. El kit Easy-DNATM Kit de
Invitrogen se utilizó para estudiar la proteína ClpB de Mycoplasma pneumonia [105] y la
regeneración del gusano “planaria” [106].
El kit Genomic DNA Purification Kit de Promega Wizard® fue utilizado para investigar la
regulación de la expresión de phosphacan por Egr-1 en astrocitos producido por infarto
cerebral experimental [108], las mutaciones en el exón 3 de CTNNB1 y la acumulación de
beta catenina en pacientes con adenomas paratiroideos [109], la relación entre
polimorfismos en RMI1, TOP3A así como BLM y el riesgo de cáncer [32], las características
clínicas y mutaciones en los genes ENG, ACVRL1, y SMAD4 en pacientes coreanos con
telangiectasia hemorrágica hereditaria [110], el rol del polimorfismo A1818T en el intrón 2 del
receptor de angiotensina II tipo 2 en el desarrollo de la nefropatía por inmunoglobulina A
[111] y la relación entre la sensibilidad a TB y la severidad con polimorfismos en genes de
citoquinas en pacientes pakistaníes [107].
Extracción de ADN a partir de sangre completa
El kit GFX Genomic Blood DNA Purification Kit de GE Healthcare se utilizó para investigar la
pérdida de sueño en corremolinos/playeritos pectorales macho [44] y el tratamiento de
perros Golden Retriever con distrofia muscular [45].
El kit QIAamp 96 DNA Blood Kit de Qiagen se utilizó para investigar la relación entre los
polimorfismos en RMI1, TOP3A así como BLM y el riesgo de cáncer [32] y la asociación de
los loci de susceptibilidad al cáncer de mama con la densidad mamográfica [31]. El kit
QIAmp DNA Blood Midi Kit, de la misma compañía, se utilizó para investigar el rol del ARN
pequeño nuclear U4atac en el desarrollo humano temprano y en la supervivencia posnatal
[29] y la formación de tumores en la próstata humana [30]. El kit DNA Blood Maxi Kit, de la
misma compañía, se utilizó para investigar las mutaciones de RAS en pacientes con
leucemia mieloide [33] y el rol de viperina en la infección humana por cytomegalovirus [34].
El kit QIAamp DNA Blood Mini Kit, de la misma compañía, se usó para investigar la posible
relación entre el síndrome de fatiga crónica y el virus de leucemia murina [21], la función de
ADAR1 en células madre hematopoyéticas [20] y la asociación entre el cáncer de próstata y
los polimorfismos de MnSOD y NAT así como el hábito de fumar cigarrillos [22]. El kit Gentra
Puregene Blood Kit, de la misma compañía, se usó para investigar el diseño racional de
fármacos para el cáncer de próstata resistente a la castración pero sin resistencia a
antiandrógenos basada en mutaciones [18], la influencia de la variación de CYP2C19 en la
respuesta de pacientes con enfermedad arterial coronaria al prasugrel y el clopidogrel [57] y
la expresión del gen de arilsulfatasa I en células ARPE-19 [58].
Otros kits
Las microesferas AMPure XP de Beckman Coulter fueron utilizadas para estudiar el
almacenamiento información digital basado en ADN [161], la pérdida somática de
mutaciones que causan enfermedad en pacientes con ictiosis [162], la influencia de
perturbaciones en la dieta en la microbiota intestinal humana [134], la modulación de la
función del microbioma intestinal por las dietas [130], el mecanismo de control del
crecimiento mediado por etileno en Arabidopsis [146] y la precisión en el control del tiempo
por un activador cíclico en Arabidopsis [163].
Las microesferas Streptavidin Dynabeads M-280 de Life Technologies Invitrogen se usaron
para investigar la transcripción por Pol I [164] y el splicing de intrones en el trastorno del
desarrollo MOPD I [165].
El kit NEBNext DNA Sample Prep Reagent Set 1 de New England Biolabs se utilizó para
investigar las variantes de metilación en diferentes generaciones de Arabidopsis
thaliana [152], las mutaciones de MED12 en pacientes con fibroides [101] y la distribución de
5-hidroximetilcitosina en células madre de ratón [153].
El kit PCR Preps DNA Purification System de Promega Wizard® se utilizó para investigar la
expresión del gen de arilsulfatasa I en células ARPE-19 [58] y la convergencia adaptativa
en E. coli [151].
El kit MinElute Gel Extraction Kit de Qiagen se utilizó para investigar el intercambio de genes
de resistencia a antibióticos entre bacterias del suelo y patógenos humanos [11], la influencia
de los cambios en la dieta en la microbiota intestinal humana [134] y el mecanismo de
control del crecimiento mediado por etileno en Arabidopsis [146].
El kit MinElute PCR Purification Kit, de la misma compañía, fue utilizado para investigar los
roles de la carotenogénesis en maíz [147], el método de mutación génetica en peces [148],
mutaciones de NOTCH1 asociadas con carcinomas escamosos de cuello y cabeza [100],
oligodendriomas inducidos por mutaciones en CIC y FUBP1 [149], linajes de bacterias en la
oscuridad del océano [150] y el intercambio de genes de resistencia a antibióticos entre
bacterias del suelo y patógenos humanos [11].
El kit QIAquick Gel Extraction Kit, de la misma compañía, fue utilizado para investigar la
deficienciaen la diferenciación de células B inducida por TCDD [129], la relación entre
APOBEC3G y los virus de leucemia murina [47], el rol del grupo de genes ORF9-a-ORF12
en la replicación del virus varicella-zoster y la infección de piel [131], el efecto de Anaplasma
phagocytophilum en la actividad de catepsina L [77], la función de HlyU en Vibrio vulnificus
CMCP6 [122], el valor de diagnóstico de los patrones de metilación de islotesde CpG
CXCL12 y ESR1 en el cáncer de mama esporádico [132], el intercambio de genes de
resistencia a antibióticos entre bacterias del suelo y patógenos humanos [11], la modulación
de la función del microbioma intestinal por las dietas [130], la evolución de una ribozima
capaz de sintetizar ARN [133] y el origen y la evolución de los virus de reticuloendoteliosis
[56].
El kit QIAquick PCR Purification Kit, de la misma compañía, se utilizó para investigar el
efecto modulador de USF1 en los ritmos circadianos moleculares y del comportamiento en
mamíferos [128], el mecanismo del cambio de virulencia sensible a temperatura
de Histoplasma capsulatum [114], la interacción entre ENT4 y EWS/WT1 [113], la relación
entre expresión génica y marcas epigenéticas [115], el valor predictivo de la deficiencia de
C4A o C4B en la supervivencia al carcinoma metastásico de células renales [116], loci
metilados asociados al cáncer de próstata [48], la fusión de genes en cáncer [117], la
asociación entre la sensibilidad a TB y la severidad con polimorfismos en genes de
citoquinas en pacientes pakistaníes [107], la interacción entre el p37 del virus Vaccinia y
proteínas asociadas a LE [15], polimorfismos del adaptador de TLR bajo presión selectiva
por malaria [118], mutaciones del gen de sulfotransferasa 6 de carbohidratos en pacientes
con distrofia corneal macular [119], las modificaciones metiladas del promotor ER beta en
células de cáncer de ovario [89], la regulación de la señalización de Bmp por Bmper [120], la
función de SIRT1 en adipocitos [121], la función de HlyU en Vibrio vulnificus CMCP6 [122],
mutaciones de NOTCH1 asociadas con los carcinomas de cuello y cabeza [100], la
capacidad de polímeros genéticos sintéticos para almacenar información [123], la síntesis
del alcaloide noscapina en Papaver somniferum [124], el efecto regulatorio de Myrf sobre la
mielinización del sistema nervioso central [125], el rol de Lsd1 durante la maduración de
células sanguíneas [126] y el origen del Aboriginal Australians [127].
El kit DNA Clean and Concentrator Kit de Zymo Research se utilizó para investigar la
relación entre la estructura de la cromatina y la expresión génica [166] y la convergencia
adaptativa en E. coli [151]. El kit ZymocleanTM Gel DNA Recovery Kit, de la misma compañía,
se utilizó para investigar la convergencia adaptativa en E. coli [151] y la regulación de los
estados mutualistas y patogénicos de Photorhabdus luminescens [8].