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La preexposición a antibióticos reduce la capacidad de detectar la producción de calor de bacterias en biopelículas

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Ravn, C; Furustrand Taffin, U; Betriséy, B; Overgaard, S; Trampuz, A
1 2 3
Hospital Universitario de Lausana, Lausana, Suiza, Hospital Universitario de Odense, Odense, Dinamarca, Universidad del Sur de
Dinamarca, Odense, Dinamarca
christenravn@[Link]
Introducción: el tratamiento con antibióticos antes de tomar muestras de muestras de cultivo podría reducir la capacidad de cultivar bacterias en
infecciones de prótesis articulares (PJI), lo que puede reducir el resultado del tratamiento. La sonicación de los implantes ortopédicos retirados
1
puede aumentar la sensibilidad diagnóstica en comparación con el cultivo de tejido periprotésico . Estudios recientes han demostrado que incluso
un número bajo de bacterias puede detectarse rápidamente por microcalorimetría, midiendo la producción de calor relacionada con el crecimiento
2
. El propósito de este estudio es, mediante el uso combinado de estos métodos novedosos, detectar bacterias incrustadas en biopelículas en perlas
de vidrio y analizar el efecto de la exposición previa a antibióticos sobre la presencia bacteriana en biopelículas.

Métodos: biopelículas de meticilina-susceptiblesStaphylococcus aureus (MSSA, ATCC 29213), S. epidermidis resistente a meticilina (MRSE,
ATCC 34985), Escherichia coli susceptible a ciprofloxacina (ATCC 25922) y Propionibacterium acnes (ATCC 11827) se formaron en perlas de
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vidrio porosas de acuerdo con un bien establecido protocolo . Después de 24 horas de incubación (72 horas para P. acnes) de perlas en presencia
de bacterias (2 UFC en 10 ml de caldo de soja tríptico, TSB), las perlas se lavaron suavemente cinco veces (en NaCl al 0,9%) para eliminar los
medios con bacterias planctónicas. En lo sucesivo, las perlas de biopelícula se expusieron individualmente a antibióticos relevantes diluidos en 1
ml de TSB a concentraciones crecientes de 1-1024 veces la concentración inhibitoria mínima (MIC) similar al método de macrodilución de caldo.
Las bacterias grampositivas (MSSA, MRSE y P. acnes ) fueron expuestas a vancomicina, rifampicina y daptomicina. MSSA además se expuso a
la flucloxacilina, a la que MRSE y P. acnes eran resistentes. La E. coli gramnegativa se expuso a ciprofloxacina.
Después de la exposición a antibiótico durante la noche de las perlas, se extrajeron los medios de crecimiento y el antibiótico se lavó por
centrifugación. La supervivencia de las bacterias planctónicas en cada combinación de concentración de bacterias y antibióticos se detectó en
placas de agar sangre contando las unidades formadoras de colonias (UFC) del sedimento resuspendido por ml. Paralelamente a esto, las perlas se
sonicaron por separado para desalojar las bacterias sobrevivientes de biopelícula. Una parte alícuota del sonicado resultante se colocó en placas y
se cuantificó (UFC / ml), mientras que otra muestra de sonicato de 0,1 ml se suspendió en 1 ml de TSB y se investigó mediante microcalorimetría
que mide el flujo de calor relacionado con el crecimiento (µW). La concentración más baja de antibióticos que inhibe la producción de calor de
bacterias desplazadas por biopelículas en microcalorimetría de 24 horas (72 horas para P. acnes) se definió como la concentración mínima
inhibitoria del calor (MHIC). Estas mediciones específicas de antibióticos y especies se muestran en la Tabla 1 y se comparan con el MIC que
representa la concentración más baja de antibióticos que inhibe el crecimiento de bacterias planctónicas. Todos los experimentos fueron realizados
por triplicado.

Resultados: La medida cuantitativa de la concentración bacteriana (UFC / ml) después de la exposición a antibióticos se muestra en la Figura 1.
Para S. aureus, la concentración de bacterias planctónicas en los medios de crecimiento se diezmó significativamente a una concentración de
daptomicina de 16 µg / ml (16 x MIC) , mientras que con la sonicación de la cuenta de vidrio cubierta de biopelícula pudimos desalojar y cultivar
bacterias hasta 32 µg / ml de daptomicina. Se encontraron resultados similares para daptomicina con S. epidermidisy P. acnes . La vancomicina no
inhibió el crecimiento de estafilococos ni de P. acnes a ninguna concentración de hasta 1024 x MIC. La flucloxacilina inhibió el crecimiento de S.
aureus solo a 512 x MIC, mientras que con la rifampicina se desarrolló resistencia espontánea en todas las concentraciones hasta 1024 x MIC
(datos no mostrados).
La microcalorimetría se usó para detectar la presencia bacteriana en el sonicado después de la exposición a antibióticos de la cuenta de vidrio
cubierta de biopelícula. La figura 2 muestra el flujo de calor de S. aureusdespués de la exposición a daptomicina en función del tiempo. Las curvas
representan diferentes concentraciones de daptomicina y el cambio de tiempo de las curvas representa una detección bacteriana demorada debido a
una menor supervivencia bacteriana a concentraciones de antibióticos crecientes de 0-32 µg / ml. La concentración más baja de daptomicina con
inhibición total de calor fue de 64 µg / ml, es decir, el MHIC. La Tabla 1 muestra MIC y MHIC de las cuatro bacterias de prueba.

Discusión: Después de 24 h de exposición a antibióticos, la vancomicina no redujo la capacidad de detectar estafilococos de biofilm y P.
acnesincluso a muy altas concentraciones. La flucloxacilina y la rifampicina por sí solas inhibieron la producción de calor relacionada con el
crecimiento de bacterias Gram-positivas en concentraciones más bajas, pero en altas proporciones en comparación con la MIC. Lo más efectivo en
condiciones in vitro fue la estafilococos inhibidores de daptomicina a 64 µg / ml y P. acnes a 32 µg / ml, así como la inhibición de ciprofloxacina
por E. [Link] a 0.063 µg / ml. Estos resultados indican una mayor capacidad de la daptomicina y la ciprofloxacina para penetrar las biopelículas
en comparación con la flucloxacilina y la vancomicina comúnmente utilizadas en las infecciones de heridas. Nuestros hallazgos respaldan la
recomendación de evitar la exposición previa a antibióticos para aumentar el rendimiento diagnóstico de las infecciones por biopelículas. En
conclusión, encontramos resultados altamente reproducibles y una mayor tasa de detección con la acción combinada de sonicación y
microcalorimetría en contraste con los métodos de cultivo básicos. Los resultados de este estudio ofrecen perspectivas alentadoras para la
investigación futura de biopelículas.

Significado:Un método basado en sonicación y microcalorimetría es útil en la investigación de la susceptibilidad a antibióticos alterada de las
bacterias incrustadas en biopelículas. El resultado cuantitativo y altamente reproducible de estos procedimientos permite una mayor investigación
en diagnóstico y tratamiento de infecciones relacionadas con implantes.

Agradecimientos: Swiss National Science Foundation (SNF), The Regional Foundation of Southern Denmark, The Danish Rheumatism
Association

1
Referencias: Trampuz A, 2007. N Engl J Med 16; 357 (7): 654-63.
2
Bonkat G, 2012. BJU Int. doi: 10.1111 / j.1464-410X.2011.10902.x. [Epub antes de la impresión].
3
Furustrand Tafin U, 2012. Agentes antimicrobianos Chemother 56 (4): 1885-91.

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Figura 1: Resultados del cultivo de la fase planctónica y la bacteria desplazada Biofilm en un experimento con S. aureus
expuesto a daptomicina a concentraciones crecientes.

Figura 2: Resultado de microcalorimetría del experimento con S. aureus expuesto a daptomicina a diversas
concentraciones. Tabla 1:

MIC: Concentración inhibitoria mínima (µg / ml); MHIC: concentración mínima inhibitoria del calor (µg / ml); R: resistente
Reunión anual de ORS 2013
Poster No: 1846

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