El método de Sanger
El método de secuenciación de didesoxinucleótidos o método de Sanger es una forma
de secuenciar una secuencia de ADN relativamente sencilla, basada en la acción
normal de las polimerasas de ADN. Para desarrollar este método, Sanger utilizó:
ADN a secuenciar
ADN polimerasa
Primer o cebador
Nucleótidos (A, T, C y G) con Fosfatos radiactivos (Fósforo 32)
Didesoxinucleótidos (ddA, ddT, ddG y ddC), desoxirribonucleótidos con una
pequeña modificación en el grupo unido al carbono 3 de la ribosa. Para que
os hagáis una idea, os lo muestro en el siguiente esquema.
Como os decía, el método de secuenciación de Sanger se basa en la acción de
las ADN polimerasas. Estos enzimas tan importantes para nuestras células son
capaces de unirse a una cadena de ADN a la que se le haya unido un fragmento corto
de ADN complementario (cebador) previamente e ir añadiendo nucleótidos. De este
modo, a partir de una cadena simple, podemos obtener una doble cadena. Esto, de
hecho, es lo que pasa en la secuenciación de Sanger, salvo por un ingenioso detalle, la
presencia de didesoxinucleótidos. Cuando una polimerasa inserta un
didesoxinucleótido, la síntesis de la nueva cadena se detiene.
Para utilizar el método de Sanger, lo primero que hay que hacer es amplificar el
ADN que queremos estudiar. En el caso de Sanger, fue el ADN del virus Phi-X174.
Actualmente lo que se utiliza es la técnica de la PCR, pero en ese entonces no existía.
Recordad que hasta 1983 no existía la PCR, así que Sanger seguramente clonase las
cadenas de ADN de otro modo, por ejemplo dejando que el virus Phi-X174 se
reprodujese en un cultivo celular.
El segundo paso es añadir este ADN a las 4 reacciones que se han de preparar, cada
una de ellas con la ADN polimerasa (Sanger usó la de E. coli), un primer
específico para la secuencia del virus Phi-X174 y los cuatro tipos de nucleótidos
con fosfatos radiactivos. En cada una de las disoluciones añadiremos una pequeña
cantidad de un solo tipo de didesoxinucleótido.
Acto seguido, se aumenta la temperatura de las reacciones, para provocar la
separación de las dos cadenas de ADN. Luego dejaremos enfriar para favorecer la
unión de los primers o cebadores.
Una vez unido el cebador, comenzará la reacción de la ADN polimerasa, que irá
añadiendo nucleótidos marcados, hasta que inserte un didesoxinucleótido, se detenga
la síntesis y la nueva cadena se suelte. Entonces, la ADN polimerasa empieza de
nuevo. De este modo, en cada una de las reacciones obtendremos fragmentos de
diferentes tamaños, acabados en el didesoxinucleótido que hayamos empleado en
ellas.
Posteriormente, el resultado de las cuatro reacciones se somete a una electroforesis.
Para los que no conozcáis esta técnica, una electroforesis consiste en colocar una
mezcla de moléculas con diferente tamaño y/o carga eléctrica en un “filtro” o soporte
poroso, que puede ser un papel, en un gel o en acetato de celulosa. Este filtro se
introduce en una solución y se somete a un campo eléctrico. De este modo, las
moléculas se moverán por bandas más o menos rápido por el filtro según su
carga y tamaño. Por ejemplo, el ADN, que tiene carga negativa, migrará hacia el polo
positivo.
Volviendo al método de secuenciación de Sanger, veríamos algo similar a esto:
Combinando la información de las cuatro electroforesis, podemos establecer el orden
de la cadena complementaria a la que estamos estudiando. Luego, solo hay que
cambiar las bases por sus complementarias y ya tendríamos las dos. ¡Fantástico!
Secuenciación Sanger por electroforesis capilar
Sanger elaboró un método bastante bueno para secuenciar el ADN de un organismo.
Sin embargo, todavía tenía muchas cosas por pulir. Eso de utilizar nucleótidos con
isótopos radiactivos… Pues no era lo mejor, vaya. Afortunadamente, a finales del siglo
XX se desarrollaron algunas tecnologías que hicieron este método mucho más sencillo.
¡Y pensar que Sanger lo hizo todo a mano!
Por un lado, el desarrollo de la PCR en los años 80 facilitó muchísimo el conseguir
suficiente muestra de ADN a secuenciar. Por otro lado, las técnicas de electroforesis
capilar y su automatización favorecieron modificaciones en el método de Sanger que
perduran hasta el día de hoy: se dejó de utilizar nucleótidos radiactivos y se añadieron
marcadores fluorescentes a los didesoxinucleótidos (cada uno de ellos de un color
diferente). ¡Más visual!. De este modo, lo que antes veíamos como en la figura anterior,
se puede ver como en esta figura. ¡Mucho más ordenado y vistoso!
Aplicaciones de la Sencuenciación de Sanger
La secuenciación de didesoxinucleótidos fue un bombazo científico en la década de los
70, que impulsó la creación de proyectos tan importantes como el Proyecto Genoma
Humano, que empezaba a “cocinarse” como una posibilidad entre los científicos de
todo el mundo. Después de unos años, en los años 90, comenzó formalmente este
proyecto, gracias al avance en este tipo de técnicas de secuenciación y a la aparición
de la PCR.
Actualmente la secuenciación de Sanger sigue utilizándose en los laboratorios, pero
tiene sus limitaciones. Por ello, se han desarrollado diferentes técnicas de
secuenciación de nueva generación, mucho más rápidas y económicas.
Y hasta aquí el blog de hoy. Ya conocéis la historia de Sanger, una de las pocas
personas que ha ganado dos premios Nobel y el padre de la genómica. ¡Espero que os
haya gustado! Nos leemos en el próximo post.
