LABORATORIO DE MICOLOGÍA
PRÁCTICA #1
INTRODUCCIÓN AL LABORATORIO DE MICOLOGÍA
OBJETIVOS
• Conocer las medidas de bioseguridad
• Conocer los medios de cultivo y control de calidad en laboratorio.
• Conocer como se realizan la toma de muestras clínicas para el cultivo de
hongos.
INTRODUCCIÓN
La Micología es la rama de la Biología que tiene por objetivo el estudio de los
hongos. Con algunas excepciones, los integrantes del reino Fungí poseen las
siguientes características: Son eucariontes, aerobios, macro o microscópicos,
heterótrofos, la nutrición la efectúan mediante la secreción de enzimas
(exoenzimas) que digieren la materia orgánica antes de ingerirla (absorción) y es
almacenada en forma de glucógeno, poseen crestas mitocondriales en placa,
membrana celular constituida por ergosterol, quitina como principal componente de
la pared celular, la síntesis de la lisina la efectúan por el intermediario ácido alfa-
amino-adípico (AAA) y se reproducen por propágulos denominados esporas.
Todas esas características contribuyen a que los hongos se encuentren o invadan
hábitats muy diversos (son organismos ubicuos) y cumplan una de las funciones
más importantes en el ecosistema que es la degradación de material orgánico.
Se han descrito alrededor de 70 000 especies de hongos, pero se considera que
puede haber 1.5 billones de ellas. De toda esta gran biodiversidad,
aproximadamente el 10% constituye el grupo de hogos estudiados dentro de la
Micología Médica.
La taxonomía de los hongos que producen enfermedad en el humano ha cambiado,
en gran medida debido al rápido desarrollo de técnicas de secuenciación de DNA.
El número de especies de hongos potencialmente patógenos ha aumentado de
manera importante. Muchas de estas especies forman parte de complejos, y
muestran entre ellas diferencias en virulencia y respuesta al tratamiento, por lo que
es necesaria la identificación para el manejo adecuado de los pacientes.
MEDIDAS DE GENERALES DE LABORATORIO DE MICOLOGÍA
• El acceso al laboratorio está limitado a personal autorizado.
• El personal del laboratorio debe implicarse en el cumplimiento de las normas de
seguridad.
• Las puertas de acceso al laboratorio y al área de Micología deben estar
debidamente marcada con la señalización internacional de riesgo biológico y su
nivel de contención biológica, que en el caso del área de Micología se corresponde
con el nivel 2 (NST2). También se señalizarán los congeladores y refrigeradores
utilizados para guardar microorganismos de riesgo de tipo 2.
• Las puertas y ventanas deben permanecer cerradas para mantener la adecuada
contención biológica.
• El laboratorio debe ser aireado regularmente.
• Todas las superficies de trabajo se limpiarán y desinfectarán diariamente y
siempre que se produzca un derrame. Los residuos y muestras peligrosas que van
a ser incinerados fuera del laboratorio deben ser transportados en contenedores
cerrados, resistentes e impermeables, siguiendo las normas específicas para cada
tipo de residuo (ver más adelante).
• El área del laboratorio debe permanecer limpia y ordenada.
• La Unidad deberá disponer de un lavabo para el lavado de las manos que
funcionará presionando con el codo o con el pie.
• El transporte de muestras dentro o entre laboratorios se realizará de tal manera,
que, en caso de caída, no se produzcan salpicaduras. Lo recomendable es hacerlo
en cajas herméticas o neveras transportables, estas deberán ser rígidas y
resistentes a los golpes, disponer de materiales absorbentes en su interior y de fácil
desinfección. Deberán estar rotuladas de forma oportuna y no podrán utilizarse para
otros fines. Bajo ningún concepto se transportarán muestras en mano.
• Todo el personal debe poner especial cuidado en evitar el contacto de la piel con
materiales potencialmente infecciosos. Para ello deben usarse guantes cuando se
manipulen muestras o cultivos que contengan posibles patógenos fúngicos. Los
guantes siempre serán desechados antes de salir del área de trabajo, jamás se
saldrá de la misma con los guantes puestos, ni se cogerá con ellos el teléfono, las
peticiones, etc.
• Inmediatamente después de quitarse los guantes, se realizará un lavado de
manos. • Se usarán gafas protectoras y mascarillas faciales si existe riesgo de
salpicaduras o aerosoles.
• Los derrames y accidentes serán informados inmediatamente al supervisor o jefe
del laboratorio y se harán constar por escrito.
• En la zona de trabajo no debe colocarse material de escritorio ni libros ya que el
papel contaminado es de muy difícil esterilización y es indispensable disponer de
autoclave.
• En el caso de trabajar con aislamientos fúngicos dimórficos conocidos, las
precauciones a seguir son sencillas si se dispone de condiciones de nivel de
contención 3. En su defecto, sellar las placas con cinta adhesiva y reservar su
apertura sólo en cabina de bioseguridad de clase II. No hacer preparaciones con
cinta adhesiva para su observación microscópica, ni cultivos en porta. Lo
aconsejable en este caso es separar una porción de la colonia, para su montaje en
porta, en la cabina de bioseguridad de clase II.
• En ningún caso debe descartarse la posibilidad que se trate de un hongo dimórfico
sistémico. Por ejemplo, Coccidioides immitis es a menudo considerado hongo de
crecimiento rápido no productor de una masa micelial pigmentada; sin embargo, en
algunos casos puede producir una pigmentación rosada o verdosa. Sus
artroconidios pueden estar ausentes en su crecimiento en ciertos medios de cultivo,
como en aquellos que contienen cicloheximida, pero sí están presentes en otro tipo
de medios de cultivo. Por otro lado, la ausencia de macroconidias características de
Histoplasma capsulatum, tampoco debe descartar la posibilidad que se trate de este
tipo de hongo, dado que pueden ser de aparición tardía (además, se cree que
probablemente son las microconidias las responsables de la infección por
transmisión aérea). Todo crecimiento de hongo filamentoso en medio con
cicloheximida con hifas estériles, especialmente si son cortas, debe ser considerado
con alta capacidad infectiva hasta que no se demuestre lo contrario.
• El mayor problema de seguridad en el laboratorio al trabajar con hongos dimórficos
no lo constituye el área de Micología, donde probablemente se trabaja siguiendo
una pauta de bioseguridad adecuadas, sino las otras áreas del laboratorio donde se
procesará la misma muestra para estudio bacteriológico. En este caso pueden
seguirse dos tipos de conductas: a) Cualquier medio de cultivo que deba incubarse
más de tres días debe ser sellado y no abierto sin antes inspeccionar la presencia
de formas micelares.
b) Ante la apertura de forma accidental de cualquier placa con la presencia de un
hongo filamentoso, esta debe ser rápidamente cerrada y manipulada en una
campana de bioseguridad para su examen microscópico. La presencia o ausencia
de estructuras conidiales en el momento de la exposición debe ser tenida en cuenta
para poder tomar medidas médicas sobre el incidente.
MEDIOS DE CULTIVO PARA EL ÁREA DE MICOLOGÍA
AGAR CEREBRO DE CORAZÓN: Medio altamente nutritivo para el cultivo de una
gran variedad de microorganismos exigentes. Al añadirle antibióticos, puede
utilizarse para el aislamiento y cultivo de hongos.
AGAR DEXTROSA-SABOURAUD: Medio para el cultivo de hongos filamentosos y
levaduras
AGAR DE CZAPEK-DOX (MODIFICADO): Medio para el cultivo de hongos y
bacterias capaces de utilizar el nitrato de sodio como única fuente de nitrógeno.
AGAR EXTRACTO DE MALTA: Medio para la detección, aislamiento y
enumeración de levaduras y mohos.
AGAR MALTA: Medio para la detección, aislamiento y enumeración de levaduras
y mohos.
AGAR MALTOSA DE SABOURAUD: Medio para el cultivo de hongos filamentosos
y levaduras
AGAR DE LITTMAN CON BILIS DE BUEY: Medio selectivo, que, suplementado
con estreptomicina, se emplea para el aislamiento primario y cultivo de hongos,
especialmente dermatofitos.
AGAR PAPA Y DEXTROSA: Medio para el cultivo y enumeración de levaduras y
mohos.
CALDO CORAZÓN: Medio de propósito general para el cultivo de una gran
variedad de microorganismos.
CALDO DE CZAPEK-DOX (MODIFICADO): Medio para el cultivo de hongos y
bacterias capaces de utilizar el nitrato de sodio como única fuente de nitrógeno.
CALDO EXTRACTO DE MALTA: Medio para el cultivo de mohos y levaduras y
utilizado en los ensayos de esterilidad.
CALDO NUTRIENTE: Medio general para el cultivo de microorganismos poco
exigentes.
CALDO LAURIL TRIPTOSA: Medio para la detención de microorganismos
coliformes en materiales de importancia sanitaria.
CALDO TRIPTONA SOYA: Medio altamente nutritivo para el cultivo de una gran
variedad de microorganismos exigentes. Se recomienda para los ensayos de
esterilidad y para uso general de laboratorio.
MEDIO LÍQUIDO DE SABOURAUD: Medio empleado para el aislamiento y cultivo
de levaduras y mohos.
PEPTONA MICOLÓGICA: Base nutritiva especialmente diseñada para el cultivo de
hongos patógenos y saprófitos. Garantiza un crecimiento característico de hongos
patógenos y no patógenos en medios sólidos.
PEPTONA DE SOYA Base nutritiva obtenida mediante la hidrólisis de la harina de
soya con papaína. Se caracteriza por su alto contenido de carbohidratos y
vitaminas, por lo que su empleo permite el crecimiento
abundante de las bacterias más exigentes y de los
hongos.
PEPTONA ESPECIAL Mezcla de peptonas destinada
a la promoción del crecimiento de diferentes especies
de microorganismos. Puede utilizarse para el cultivo
de la mayoría de los microorganismos exigentes.
CONTROL DE
CALIDAD EN EL
LABORATORIO DE
MICOLOGÍA
En 1996, el Departamento Micología del Instituto Nacional de Enfermedades
Infecciosas (INEI), dependiente de la ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”, inició el
Programa Nacional de Control de Calidad en Micología con el propósito de
garantizar la calidad del diagnóstico, difundirlo y capacitar personal para su correcta
realización.
Son los objetivos de este programa el control de los métodos y procedimientos de
los laboratorios para:
• Calidad en examen directo de las muestras.
• Calidad del cultivo.
• Calidad de la identificación de las especies fúngicas.
• Calidad de la sensibilidad a los antifúngicos.
• Calidad del diagnóstico serológico.
Actualmente en el programa participan alrededor de 150 laboratorios del ámbito
oficial o privado que se han ido incorporando a raíz de la consolidación de las redes
provinciales de micología o por demanda espontánea. Se envían cepas de
colecciones propias, nacionales o internacionales, sueros hiperinmunes de conejos,
muestras clínicas, homogeneizadas y controladas, y muestras clínicas simuladas.
previamente a cada encuesta se seleccionan las muestras y cepas, se chequean
sus características, se preparan los lotes a enviar, se controla nuevamente el 10%
de cada uno de ellos y se envían a los laboratorios a través del Responsable
Provincial de las Redes de Laboratorios o a la dirección particular en el caso de los
laboratorios privados.
Su envío se realiza en recipientes de bioseguridad de polipropileno, con sistema de
triple envase.
Junto con la primera encuesta se distribuye un cuadernillo de códigos con el objeto
de estandarizar las descripciones de las características de las colonias, las
estructuras microscópicas observadas en el examen directo de la muestra y los
cultivos, las pruebas bioquímicas, fisiológicas y nutricionales, para facilitar la
interpretación de los resultados. En el cuadernillo de códigos se incluyen las fichas
de informe de los resultados con el objeto de reducir la subjetividad en la
interpretación de los resultados de los laboratorios y facilitar el análisis de los datos.
Los laboratorios inscriptos en el programa deben procesar las muestras y/o
aislamientos fúngicos del panel del Control de Calidad, utilizando los procedimientos
de rutina que emplean para procesar las muestras clínicas que reciben para
diagnóstico de micosis y sus cultivos fúngicos, y registrar los resultados en las
correspondientes planillas de acuerdo con el cuadernillo de códigos. Se estableció
un plazo de 4 semanas para procesar la muestra, tipificar la cepa y enviar el
resultado. Se evalúan, para cada encuesta, todos los resultados recibidos en el
Departamento Micología dentro de las 8 semanas desde el envío de la encuesta,
para evitar excluir de la evaluación a laboratorios que cumplieron los plazos, pero
cuyo envío sufrió demoras por problemas ajenos a su voluntad.
La evaluación de las respuestas es individual y personalizada. Las encuestas se
analizan en forma automatizada. Los resultados que se evalúan son:
• La identificación de las cepas a nivel de género y especie, en la identificación
presuntiva y definitiva.
• Las observaciones macro y micromorfológicas de las cepas y los resultados de
las pruebas bioquímicas, fisiológicas y nutricionales para identificación
presuntiva y definitiva.
• Las observaciones microscópicas directas y el resultado registrado.
• El diagnóstico serológico realizado a partir de la muestra.
Cuando los laboratorios no cuentan con el nivel de complejidad o capacitación
suficiente para identificar las cepas a nivel de especie, sólo se considera que el
resultado a nivel de género o grupo taxonómico sea el correcto. En este programa
los resultados de las encuestas son confidenciales. Los participantes tienen un
código numérico que sólo conocen ellos mismos y el Departamento Micología.
Para validar las encuestas se selecciona un grupo de 6 laboratorios que participan
en el programa, que son los que demostraron mejor desempeño en el período
previo. Estos Laboratorios, con demostrados conocimientos en diagnóstico de
micosis humanas, desconocen que tienen asignada esta función. Cada encuesta
queda validada cuando al menos dos de estos laboratorios envían resultados
coincidentes con los del Centro de Referencia. Si esto no ocurre la muestra o cepa
se excluye.
En devolución, cada participante recibe por vía electrónica un listado con sus
resultados, los resultados validados del Laboratorio de referencia (Dto. Micología),
los resultados globales y los esperados de acuerdo con el nivel de complejidad para
que cada laboratorio pueda determinar su nivel respecto al total de los participantes.
A fin de cumplir con el objetivo del programa se agrega información en los siguientes
casos:
• Cuando se observan posibles fallas metodológicas, se les advierte, se anexa la
metodología usada por el Laboratorio de Referencia y se ofrecen las cepas para
Control de Calidad.
• Cuando se observan fallas en la interpretación de las observaciones se anexa la
información necesaria para corregir el error.
• Cuando la técnica a evaluar no está siendo llevada a cabo por el laboratorio,
pero es necesaria o conveniente su implementación, se ofrece la provisión inicial
de reactivos y el apoyo técnico, ya sea la metodología o la capacitación del
profesional que la va a realizar.
• Cuando el laboratorio realiza pruebas u observaciones adicionales, diferentes a
las consideradas necesarias por el laboratorio de referencia, se evalúan
individualmente para que el laboratorio pueda confirmar su resultado.
TOMA DE MUESTRAS CLÍNICAS
La obtención de una muestra biológica para estudio micológico depende
fundamentalmente de la sintomatología o lesiones presentadas por el paciente.
Toma de muestras para piel, pelo y uñas:
Las muestras biológicas de las que se recuperan con más facilidad los hongos son
piel, pelo y uñas. Para la recogida de muestras de estas procedencias se procederá
como sigue: Se preparará una bandeja con alcohol etílico de 70º, guantes de un
solo uso y un recipiente estéril o asépticamente limpio de boca ancha con tapón de
rosca.· Dependiendo del tipo de toma a realizar se dispondrá de hojas de bisturí,
corta uñas, tijeras, pinzas de depilar, cuadrados de moqueta de lana sin nylon de 4
x 5 cm envuelto en papel de poliamida y estéril, torundas con medios de transporte
y jeringuillas.· Es necesario asegurarse de que antes de tomar la muestra no se ha
aplicado medicación tópica alguna, por lo menos durante siete días antes.· Para
obtener la muestra se desinfectará con alcohol la piel, uñas o pelos. Una vez seco
el alcohol, se procederá a obtener el material de la siguiente forma:
Lesión cutánea escamosa y seca:
Raspar las escamas en la periferia de la lesión con un bisturí, recogiéndolas en un
contenedor estéril o asépticamente limpio.
Lesión cutánea no escamosa:
Frotar con un trozo de moqueta la totalidad de la superficie afectada, colocándola
posteriormente en su envoltorio de origen.
Espacios interdigitales:
En las micosis intertriginosas de manos y pies, deben rasparse cuidadosamente con
un bisturí o cucharilla de Vidal ambos lados y base de cada espacio interdigital.
Cuando existen fisuras, deben rasparse solo los lados. Además, debe tomarse
siempre una muestra del cuarto espacio interdigital, ya que puede encontrase el
dermatofito a pesar de no encontrar lesión alguna.
Pelos:
Arrancar varios pelos de la lesión con ayuda de una pinza e introducirlos en un
contenedor estéril, tomando aquellos pelos de apariencia frágil o que estén
fragmentados. Los pelos se arrancarán para incluir en el estudio los folículos
pilosos. Si existiesen costras adyacentes también se tomarán.
Uñas:
Raspar la uña con un bisturí, cortando fragmentos lesionados si es posible y
depositarlos en un contenedor estéril. Cuando la afectación reside en la parte dorsal
de la uña, debe rasparse la superficie externa y desechar la porción inicial,
recogiendo el material de la parte subyacente.
Exudado purulento:
En caso de lesiones fisuradas con salida de exudado purulento al exterior, es
preferible tomar la muestra de la parte profunda, para disminuir en lo posible la
contaminación bacteriana.
Muestras respiratorias:
Las muestras respiratorias se recogerán mediante la emisión de un esputo o bien
mediante un aspirado o lavado bronquial. Las muestras deben homogeneizarse y
concentrarse de la misma forma que para el estudio de mico bacterias.
Toma de muestra de mucosas:
Se dispondrá de una torunda estéril de algodón y un contenedor de torunda, con o
sin medio de transporte. En caso de existir lesiones blanquecinas a nivel de boca,
vagina o glande, se frotará la torunda en la zona de lesión o secreción. Si el paciente
solo presenta enrojecimiento, se humedecerá la torunda con unas gotas de agua o
solución salina estéril y se efectuará una rotación por la superficie enrojecida. Si no
existiesen evidencias de secreción y/o enrojecimiento, se procurará pasar la torunda
por una zona lo suficientemente amplia como para asegurar la recuperación de la
mayor cantidad posible de microorganismos.
Líquidos estériles:
Si la muestra es orina, L.C.R. o cualquier líquido estéril, se someterá a
centrifugación y se sembrará el sedimento, o bien se filtrará a través de membranas
especiales y se cultivará dicha membrana sobre el medio de cultivo. En el caso del
hemocultivo, seguirán el procesamiento habitual.
Recomendaciones generales para una toma de muestra:
• Examinar la solicitud para constatar que ha sido cumplimentada
correctamente y que contiene los datos necesarios para una inequívoca
identificación del paciente. Se recomienda que la solicitud lleve adherida la
etiqueta identificativa.
• Es necesario cerciorarse, sin lugar a duda, de que el paciente al que se le va
a realizar la toma de muestra es el mismo cuyos datos figuran en la solicitud.
El preguntarle su nombre, o incluso sus apellidos, puede ser insuficiente,
sobre todo si éstos son comunes.
• La muestra debe quedar perfectamente identificada con la misma etiqueta de
código de barras que se adhiere a la solicitud.
• Para evitar confusiones entre muestras de pacientes
no realizar más de una extracción al mismo tiempo:
una vez completada la extracción o recogida de la
muestra de un paciente, identificado el tubo y
colocados la hoja de petición y muestra/s en la bolsa
de envío, proceder a la extracción del siguiente
paciente.
• Dependiendo de las determinaciones analíticas solicitadas la muestra se
recogerá en diferentes tubos y contenedores
MUESTRA DE FLUIDOS CORPORALES
Extracción de sangre
Es el espécimen más usado habitualmente para los estudios analíticos por la
riqueza de datos que puede aportar, por su funcionalidad y por ser relativamente
fácil su obtención. Dependiendo del tipo de estudio.
Recuerde que una extracción mal realizada, o realizada en el momento equivocado,
puede ser peor que no tomar ninguna muestra.
Extracción de otras muestras: orina, líquido Cefalorraquídeo y otros líquidos
orgánicos, heces, saliva.
CONCLUSIÓN
Podemos deducir que la rama de la micología es muy extensa, en la cual como
laboristas clínicos debemos tomar en cuenta ciertas normas para poder manipular
correctamente las muestras de hongos ya sean patógenos o no patógenos, de no
ser así estamos poniendo en riesgo la vida del paciente si no se le diagnostica
correctamente y por supuesto la de uno mismo si no portamos el equipamiento para
manipular estas muestras biológicas, ya que al momento de la toma de muestra no
sabemos a qué situación de salud nos enfrentamos.
REFERENCIAS
ALEXOPOULOS C.J. Y MIMS W. (1.985). Introducción a la Micología. Omega.
Sociedad Micológica de Madrid RECUPERADO:
[Link]
Micológica de Durango RECUPERADO: [Link]
