Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
Jefferson Domínguez1, Natalia Trujillo1, Alek Vásquez1.
1. Departamento de biología, Programa de biología, Facultad de educación y ciencias.
Universidad de Sucre.
Resumen
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica biotecnológica ampliamente utilizada.
Emplea un par de oligonucleótidos para lograr limitar una determinada región de interés, y una
polimerasa para extenderlos, utilizando ambas hebras de gen en cuestión como una plantilla. Es decir,
tiene como fin amplificar o reproducir un número de copias de una región específica de ADN, para su
posterior evaluación. La PCR se caracteriza por su alta especificidad y sensibilidad, por lo que se
convierte muy útil en el diagnóstico de virus, bacterias y parásitos. La reacción en cuestión, es llevada
completamente in vitro y necesita para su desarrollo elementos fundamentales: 2 oligonucleótidos
sintéticos o cebadores (primers), una enzima termoestable, Taq polimerasa, y 4
desoxirribonucleótidos (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) y DNA molde. En esta práctica se preparó la
mezcla partiendo de buffer de PCR, DNTPs, MgCl2 y los demás componentes ya mencionados, para
la identificación de los fragmentos de ADN de T. gondii en un paciente. El procedimiento típico
inició con la desnaturalización por el calor, que permite la apertura de las dobles cadenas, seguido de
un proceso de alineación, que consiste en la unión de los cebadores que se encuentran en la mezcla de
la reacción, hasta que se da la etapa de extensión. Finalmente los resultados se analizaron a través de
electroforesis y el tamaño de los fragmentos que se amplificaron en Excel.
Introducción
La reacción en cadena de la polimerasa es una técnica bastante común para hacer variables copias de
una región de DNA, dicha región puede ser un gen cuya función es altamente variada, por lo que se
utiliza en muchas áreas de la biología o medicina (Alberts, B, Jhonson. et al, 2002). La PCR depende
de la capacidad para desnaturalizar las moléculas de DNA de doble hebra y renaturalizar las hebras
individuales complementarias en una forma controlada. En donde, todos los componentes de la PCR
son agregados en un tubo, juntos con los cofactores que necesita la enzima (MgCl2 y KCl). Este
procedimiento permite obtener una duplicación exponencial de secuencias, por medio de un proceso
cíclico de desnaturalización, alineación y extensión (Winter, P, et al, 2002).
En cada ciclo se duplica la cantidad de copias de la secuencia que se desea entre los sitios del cebador
y por lo tanto, la secuencia tiene un incremento cada vez mayor. Si la reacción es eficiente puede
llegar a producir millones de copias, a partir de unas cuantas copias de la región en blanco, gracias a
que el DNA que se genera en una ronda sirve como molde para la siguiente ronda de síntesis.
Los resultados de la PCR se pueden visualizar mediante electroforesis en gel de agarosa, en donde se
logra una separación según el tamaño. En el gel se incluye un marcador de peso molecular encargado
de comparar el tamaño de los fragmentos de DNA resultantes de la PCR, con ayuda de bromuro de
etidio (Griffiths, AJF, et al, 2005). En esta importante práctica la PCR llevada a cabo se utilizará con
el fin de detectar T. gondii y así, posteriormente, generar un diagnóstico seguro. De igual forma
conocer claramente cómo funciona la reacción en cuestión que tiene tanta aplicabilidad en nuestro
entorno.
Materiales y métodos
Se realizó inicialmente la preparación de la mezcla para PCR o master mix, la cual constó de
diferentes reactivos. Estos se mantuvieron todo el tiempo a baja temperatura y fueron empleados para
determinar la cantidad de máster a utilizar en las diferentes muestras. Tales reactivos y sus
determinados volúmenes están expresados en la tabla 1.
Reactivos Volumen µL
Agua filtrada estéril 10.05
Buffer PCR 5.0
MgCl2 1.25
DNTP’s 2.5
Cebador N1 2
Cebador C1 2
Taq Polimerasa 0.2
Muestra de ADN 2
Volumen total 25
Tabla 1. Reactivos para master mix y cantidades en microlitros.
Teniendo en cuenta los valores de la tabla, se preparó la mezcla, luego de descongelar los reactivos
que se mantienen a baja temperatura. Posteriormente se añadió 2,5 µL en ocho tubos de ensayo, así
como también se formuló un tubo de control negativo adicionando 2 µL de agua esteril. Con los tubos
preparados, se adiciona 2 µL de las muestras de ADN en cada uno, incluyendo el control positivo.
Los tubos fueron llevados al termociclador, aplicando el siguiente perfil térmico correspondiente a
toxo 1:
Ciclos Etapas Temperatura (°C) Tiempo(min)
1 Desnaturalización 94 2
inicial
Desnaturalización 94 1
30 Alineación 53 1
Extensión 72 1
1 Extensión final 72 5
Finalizada la primera ronda, se realizaron nuevamente los procesos llevados a cabo con los reactivos
de la tabla 1, obteniendo una vez más 8 tubos de muestra y 1 de patrón negativo. Aquí se empleó los
productos de la PCR ronda 1, de los cuales se agregó 2 µL a cada tubo, teniendo en cuenta la adición
del producto del control positivo al último tubo y finalmente se aplicó el perfil térmico
correspondiente a toxo 2 para ser analizados en electroforesis en gel de agarosa al 1,8%.
Ciclos Etapas Temperatura (°C) Tiempo(min)
Desnaturalización 94 1
14 Alineación 53 0,5
Extensión 72 0,5
1 Extensión final 72 10
Resultados
Luego de haber realizado la prueba de PCR, se procedió a observar los resultados de la electroforesis
en gel de agarosa, esto con el fin de verificar si hubo una correcta amplificación de moléculas de
ADN. En la Figura 1 podemos observar dicho resultados
Figura 1. Electroforesis en gel de agarosa de fragmentos de ADN de T. gondii
Posteriormente se realizaron los cálculos correspondientes al peso de los fragmentos de ADN
presentados en la electroforesis. Así mismo se construyó una gráfica en donde hallamos la ecuación
de la recta y la varianza, siendo estos y = -0,0639x + 3,7533 y R² = 0,9847 respectivamente. Tal
como se observa en la gráfica 1, la tabla 2.0 y 2.2.
Gráfica 1. Ecuación de la recta
Tabla 2.0. Mediciones de pesos, logaritmos y antilogaritmos.
Tabla 2.1. Pesos de fragmentos obtenidos en las corridas 1 y 2.
Análisis de resultados
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica de laboratorio que se utiliza para hacer
múltiples copias de regiones específicas de ADN. Los componentes clave de una PCR son la Taq
polimerasa, los cebadores, el ADN molde y los nucleótidos (componentes del ADN). Esta prueba
consta de 3 etapas las cuales son: Desnaturalización la cual se lleva a cabo a una temperatura de
96°C, en esta etapa la reacción se calienta lo suficiente como para separar o desnaturalizar las hebras
de ADN. Esto proporciona un molde de cadena única para el siguiente paso. El templado es la
segunda etapa, este paso consiste en enfriar la reacción para que el cebador pueda unirse a la
secuencia complementaria en la plantilla de ADN monocatenario. La última etapa es conocida como
extensión, esta consiste en aumentar la temperatura de reacción para permitir que la polimerasa Taq
extienda el cebador, sintetizando así una nueva hebra de ADN. En el método PCR se emplea un par
de cebadores para hibridar con el ADN de la muestra y definir la región del ADN que será
amplificada (Díaz, A. S, et al. 2014).
La detección de ADN de toxoplasma se realiza mediante una prueba de PCR en la cual se utilizan dos
pares de cebadores y a su vez se realizan 2 rondas. La primera ronda incluye la amplificación de un
fragmento de 193 pb con los cebadores N1 5'-GGAACTGCATCCGTTCATGAG-3 y C1 5'-
TCTTTAAAGCGTTCGTGGTC-3'. Luego se realizan los respectivos cálculos para hallar el peso de
los fragmentos de ADN y se llega a la conclusión de que el paciente sufre de toxoplasmosis. La
segunda ronda consistió en la amplificación de un fragmento de 96 pb con los cebadores N2 5
-TGCATAGGTTGCCAGTCACTG-3 y C2 5 - GGCGACCAATCTGCGAATACACC-3 , y se
obtuvo que el paciente amplifico nuevamente por lo tanto es positivo,además al analizar los
resultados de los cálculos fue posible observar que estos estaban cerca al valor teórico
Conclusión
Una de las principales ventajas de la PCR es la novedosa tecnología que permite detectar de manera
confiable, rápida y efectiva muchas afecciones. Como en este caso que facilitó determinar la
toxoplasmosis en un paciente. Principalmente gracias a oligonucleótidos sintéticos, específicos para
determinado gen, encargados de facilitar la amplificación de una secuencia nucleotídica.
Bibliografía
● Díaz, A. S., Rentería, L. F., Cortez, J. A., & Palacios, E. S. (2014). PCR: reacción en
cadena de la polimerasa. Herramientas moleculares aplicadas en ecología: aspectos
teóricos y prácticos, 53.
● Aoyaki K. 2001. PCR. En: A. S. Gerstein (ed.). Molecular biology problems solver: A
laboratory guide. Wiley-Liss, Inc. Electronic, pp. 292-328.
● Becerril Parra, D. E., Torres Guerrero, E., Moreno Coutiño, G., Aguilar Sarmiento, A.
S., Arenas Guzmán, R., & Hernández Castro, R. (2015). Reacción en cadena de la
polimerasa (pcr) y sus aplicaciones en dermatología. Dermatología cosmética,
médica y quirúrgica, 13(3), 214-219.
[Link]
● Newton, CR, Graham, A. y Ellison, JS (1997). PcR (pág. 192). Oxford, Reino Unido:
BIOS Scientific Publishers.
