Universidad de Guayaquil
Facultad de Ciencias Químicas
Carrera: Química y Farmacia
Laboratorio de Análisis Instrumental II
NOMBRE Y APELLIDO DEL ESTUDIANTE:
o Melanie Aguilera Cervantes
o Nathaly Calderón Baque
GRUPO: G2 FECHA: 14/Julio/2021 CICLO I (20201-2022)
Práctica N° Cromatografía de líquidos: Manejo del Cromatógrafo de líquidos, preparación de fase móvil y
4-5 gradientes
Objetivo de la práctica de laboratorio
• Conocer las partes principales de un equipo de cromatografía de líquidos previo al estudio de su
funcionamiento.
• Establecer el trabajo en conjunto de cada parte del equipo y su importancia en el proceso de análisis y
cuantificación para la selección de las condiciones analíticas.
• Identificar tipos de analitos, muestras y campos de aplicación en los que puede ser utilizado un
cromatógrafo de gases.
• Reconocer los componentes de un cromatógrafo de líquidos.
• Elegir la fase móvil de acuerdo a las características del analito y de la columna conforme al artículo
científico proporcionado por el docente.
• Determinar el efecto de aplicación de programación de gradientes de la fase móvil para la separación
cromatográfica.
Introducción
En la cromatografía líquida, la fase móvil es un líquido que fluye a través de una columna que contiene a la
fase fija. La separación cromatográfica en HPLC es el resultado de las interacciones específicas entre las
moléculas de la muestra en ambas fases, móvil y estacionaria.
La cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC) no está limitada por la volatilidad o la estabilidad
térmica de la muestra. Es capaz de separar macromoléculas y especies iónicas, productos naturales lábiles,
materiales poliméricos y una gran variedad de grupos polifuncionales de alto peso molecular. Con una fase
móvil líquida interactiva, otro parámetro se encuentra disponible para la selectividad, en adición a una fase
estacionaria activa.
La HPLC ofrece mayor variedad de fases estacionarias, lo que permite una mayor gama de estas
interacciones selectivas y más posibilidades para la separación.
Aplicaciones
✓ Fármacos: Antibióticos, sedantes esteroides, analgésicos
✓ Bioquímica: Aminoácidos, proteínas, carbohidratos, lípidos
✓ Productos de alimentación: Edulcorantes artificiales, antioxidantes, aflatoxinas, aditivos
✓ Productos de la industria química: Aromáticos condensados, tensoactivos, propulsores, colorantes
✓ Contaminantes: fenoles, Pesticidas, herbicidas, PCB
✓ Química forense: Drogas, venenos, alcohol en sangre, narcóticos
✓ Medicina clínica: Ácidos biliares, metabolitos de drogas, extractos de orina, estrógenos. (Edgar Ernesto
Esquivel Soto, 2004)
EL SISTEMA CROMATOGRÁFICO DE FASE REVERSA:
Fue introducido por Howard y Marlin en 1950. Estos científicos revirtieron la polaridad de las fases con el
objetivo de separar ácidos grasos, así surgió la cromatografía de fase reversa; aquella en la que la fase
estacionaria es no polar y la fase móvil es polar. La técnica de fase reversa, RPC, se ha convertido en el tipo
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de cromatografía más ampliamente utilizada en HPLC, esta técnica proporciona retención y selectividad
óptimas cuando las muestras tienen un carácter predominantemente alifático o aromático.
FASE ESTACIONARIA PARA CROMATOGRAFÍA DE FASE REVERSA:
Consiste en una matriz porosa e insoluble a la que se le han unido químicamente compuestos hidrofóbicos.
Los soportes para casi todos los rellenos se preparan con sílica rígida, formada por partículas
mecánicamente resistentes, porosas y uniformes, con diámetros de 3, 5 o 10 micras.
La superficie de la sílica está constituida por grupos silanol (SiOH) químicamente reactivos que abarcan una
superficie cercana a los 8 μmol/m2.
FASE MÓVIL PARA CROMATOGRAFÍA DE FASE REVERSA:
La retención hidrofóbica del soluto en la fase estacionaria puede disminuirse añadiendo un disolvente
orgánico a la fase móvil acuosa. Al decrementar la polaridad de la fase móvil, la distribución de los solutos
se cambia hacia la fase móvil. La cantidad de muestra que se une a la fase estacionaria depende de la
concentración del ligando inmovilizado, de las propiedades químicas y físicas de la molécula que va a ser
adsorbida y de la polaridad de la fase móvil y estacionaria. Así, conforme menos polar sea la fase móvil,
menor será la adsorción de la muestra a la fase estacionaria.
MÉTODO DE ELUCIÓN EN GRADIENTE:
Se lleva a cabo variando de forma continua la composición de los disolventes de forma que su fuerza vaya
incrementando durante el tiempo de análisis. Normalmente se procede de esta forma, utilizando una fuerza
de fase móvil más débil al principio para ir incrementándola después. Existe dos tipos de gradientes:
❖ Lineales: La velocidad de cambio del disolvente fuerte es lineal en el tiempo.
❖ Exponenciales: Éstos a su vez pueden ser:
✓ Convexos: Rápidas en alcanzar la composición final de la fase móvil. Se utilizan para picos
superpuestos al final del cromatograma.
✓ Cóncavos: Lentas en alcanzar la composición final de la fase móvil. Se utilizan para picos
superpuestos al principio del cromatograma. (Peña., 2011)
IMPORTANCIA DE CONTROLAR EL PH DE LA FASE MÓVIL EN LA HPLC DE FASE INVERSA:
Durante el desarrollo de un protocolo de análisis de cromatografía de líquidos de fase reversa (RPLC). Uno de
los aspectos más importantes es el tiempo que soportará la columna. La sílice posee numerosas propiedades
que la convierten en un soporte excelente para columnas HPLC de fase reversa. Sin embargo, su solubilidad
aumenta notablemente cuando la fase móvil alcanza un valor de pH entre 7 y 8 o superior. Se recomienda
iniciar el desarrollo de métodos de fase reversa con fases móviles de pH bajo, ya sean los analitos ácidos,
neutros o básicos, existen varias razones para aplicar estas directrices: a pH bajo, los analitos ácidos serán
neutros y quedarán bien retenidos; y los grupos silanol residuales de la superficie de la sílice del relleno
estarán protonados. Por lo tanto, habrá menos interacciones secundarias entre los analitos ácidos y básicos y
la superficie de la sílice. Lamentablemente, la retención de los compuestos básicos, que tienen carga positiva a
pH bajo, a menudo será baja o dará lugar a una forma de pico deficiente en estas condiciones. Una razón
adicional para utilizar un pH bajo es la baja estabilidad de las columnas de sílice a pH alto. (Long, 2015)
pKb
Compuesto pKa
Ácido benzoico 4.20 9.8
Ácido sórbico 4.76 9.3
Uracil 9.45 4.5
Naproxin 4.15 9.85
2
Fenoprofen 7.3 6.7
Ibuprofen 4.91 9.09
Diflunisal 2.94 11.06
Instrucciones o consideraciones previas
o Investigar el pKa o pKb (según corresponda) de los compuestos citados en la Tabla 1.
o Graficar en Excel (adjuntar la imagen) del gradiente de la figura 3 del artículo de referencia (Aimee N.
Heyrman, Richard A. Henry; Technical Bulletin TB 99-06).
o Indicar la influencia que tiene el porcentaje de modificador ácido en el ajuste de pH y la separación
cromatográfica.
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Reactivos de laboratorio
1. Metanol (grado HPLC)
2. KH2PO4 (calidad reactivo)
3. Acetonitrilo (grado HPLC)
4. Ácido Trifluoroacético
Materiales de laboratorio
1. Columna C18 (150 x 4.6 mm x 5 um)
Equipos de laboratorio
1. Cromatógrafo de líquidos − Detector UV Detector
Actividades desarrolladas / Técnica operatoria o procedimiento
• Preparar una solución de patrón ácido benzoico y ácido sórbico (solución mezcla) del orden de 25 ppm de
concentración.
• Encender el sistema cromatográfico: detector y desgasificador.
• Preparar 0,05 M de KH2PO4, filtrar y desgasificar.
• Colocar en el software las condiciones básicas del método analítico
➢ Temperatura de la columna: 35°C
➢ Flujo: 1.0 mL/min o Volumen de inyección: 10 uL
➢ Longitud de onda 235 nm
• Inyectar en el sistema cromatográfico 10 uL de la solución patrón.
• Registrar los tiempos de retención de los compuestos.
Resultados obtenidos
TABLA DE DATOS
COMPUESTO pKa pKb
Ácido benzoico 4,20 9,80
Ácido sórbico 4,76 9,24
Uracil 9,40 4,60
Naproxin 4,20 9,85
Fenoprofen 7,30 6,7
Ibuprofen 4,40 9,39
Diflunisal 2,69 11,31
o Graficar en Excel (adjuntar la imagen) del gradiente de la figura 3 del artículo de referencia (Aimee N.
Heyrman, Richard A. Henry; Technical Bulletin TB 99-06).
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Indicar la influencia que tiene el porcentaje de modificador ácido en el ajuste de pH y la separación cromatográfica:
El pH bajo disminuye la solubilidad de los ácidos orgánicos en agua y requiere el uso de un
porcentaje orgánico más alto en la fase móvil para la elución práctica en condiciones de RP.
El pH toma un papel importante durante la separación, debido a que este parámetro es el que
controlará el grado de ionización del soluto, modificando su equilibrio de hidrólisis en el eluyente.
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Discusión de resultados
• La condición de pH de la fase móvil debe ser ajustada al estar frente analitos no ionizables o neutros, dado el
caso de que se presenten contaminantes o impurezas ionizables.
• El pH de la fase móvil cambiará ligeramente a medida que cambia el porcentaje orgánico en la fase móvil.
• Tomando de ejemplo la figura 3, se puede observar a un compuesto que no es de interés para el análisis y por lo
tanto, es tratado como una impureza muestra un comportamiento variable influenciado por la carencia de una
solución tampón, esto debido a que se trata de un compuesto ionizable, en ausencia del buffer presentó un pico
inconstante y deficiente llegando a solapar a un analitos de interés, mientras que, en presencia de dicha
solución se evidenció como un pico mejor formado y que además eluyó en menor tiempo, separándolo
adecuadamente de los analitos que eran objeto de ensayo logrando de esta manera, la obtención de una mejor
visibilidad de los cuatro analitos estudiados, por ende, pese a que estos analitos son compuestos que no
muestran influencia por el pH dela fase móvil al ser neutros, el control de este factor se vuelve imprescindible al
haber en la matriz de la muestra compuestos que si son ionizables y son afectados por estas variaciones
Conclusiones
• Se concluye que el control óptimo del pH normalmente dará como resultado una fase móvil que contiene
tampón y composiciones ácidas que resistirán el cambio cuando se introduzca la muestra y forzarán a los
analitos ionizables a adoptar predominantemente una forma (ionizada o neutra) a medida que entran en la
columna.
•
Recomendaciones
• Se deben seguir las buenas prácticas de laboratorio en la preparación de las fases móviles para asegurar que los
resultados se puedan reproducir dentro y entre laboratorios.
• El pH de la fase móvil debe seleccionarse de modo que sea al menos ± 1,5 unidades de pH del pKa del analito.
Bibliografía
1. Edgar Ernesto Esquivel Soto, L. I. (24 de 06 de 2004). Sistema de Hplc. Scielo, 25-45. Obtenido de
[Link] Hplc/cromatografia_de_fase_reversa.pdf
2. Long, W. (15 de 12 de 2015). [Link]. Obtenido de
[Link]
3. Peña., M. S. (2011). Cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC). Redalyc, 48-78. Obtenido de
[Link]
