PRACTICA N° 03
TÉCNICAS DE SIEMBRA PARA HONGOS Y BACTERIAS
I. INTRODUCCIÓN
El proceso de colocar las bacterias u otros microorganismos cultivables en medios de
cultivo, recibe el nombre de siembra; esta operación la podemos realizar a partir de
muestras biológicas (orina, pus secreciones, etc.), de análisis para control de calidad
(alimentos, aguas, cosméticos, medicamentos, etc.), procedente de muestras
ambientales (agua, suelo, etc.), o de un cultivo microbiano a otro; si la realizamos de
un cultivo a otro la denominamos subcultivo o repique.
Para el estudio de las bacterias y otros microorganismos cultivables, es necesario,
además, conocer y reconocer la morfología microscópica y macroscópica a partir de
su crecimiento en medios de cultivo; adicionalmente, es posible evaluar el
comportamiento de ellas frente a los diferentes compuestos nutritivos ó
proporcionarles aquellos nutrientes adecuados para favorecer su desarrollo.
Existen técnicas adecuadas para realizar estos cultivos, mediante el uso de algunos
elementos importantes para realizar siembras, como: El mechero (de alcohol o de
Bunsen), el asa bacteriológica (asa de argolla), o micológica (asa recta), cámaras de
flujo laminar o el espacio adecuado en condiciones asépticas y los medios de cultivo
ya preparados y atemperados a 37°C; esta última observación es importante tenerla
en cuenta, ya que los microorganismos objeto de estudio y presentes en las muestras
o cultivos, deben evitar ser estresados con cambios bruscos de temperatura o por
otros factores (incluida la composición del medio de cultivo). Contando con estos
implementos, es posible iniciar adecuadamente el proceso de cultivar o subcultivar
muestras o aislamientos previamente obtenidos.
II. OBJETIVOS
Practicar las diferentes técnicas de siembra para el desarrollo de cultivos y
subcultivos de hongos y bacterias, en medios de cultivo dispensados en tubos
y cajas Petri, así como, en medios de diferente composición y estado.
Desarrollar en los estudiantes la capacidad de selección de una metodología
específica, de acuerdo a los criterios proporcionados, para la aplicación
correcta de las técnicas de siembra de acuerdo al microorganismo y al objetivo
de la prueba.
III. TÉCNICAS DE SIEMBRA
La técnica más usada en el laboratorio de microbiología es probablemente la
transferencia de microorganismos de un ambiente a otro con el propósito de
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cultivarlos. Para determinar los caracteres de cultivo de las bacterias, hongos y otros
cultivables, es preciso obtenerlas en cultivo axénico (o cultivo puro). Existen varios
métodos para aislar las bacterias en cultivo puro con el fin de evaluar sus
características en estos medios.
Se entiende por cultivo puro, una población de células las cuales todas proceden de
una misma célula. Existe gran variedad de técnicas por medio de las cuales las
diferentes especies en una muestra natural pueden ser aisladas en cultivo puro.
3.1. TÉCNICAS DE SIEMBRA EN CAJAS PETRI.
A. Siembra en cajas de Petri por la Técnica de agotamiento, aislamiento o de
estría cruzada.
Es un buen método para el aislamiento de colonias (obtención de colonias
aisladas); mediante esta técnica buscamos obtener colonias separadas a partir
de un inóculo. Para su realización: (i) se toma la caja de Petri en la palma de la
mano y ligeramente inclinada; con la mano contraria, se manipula el asa de
argolla previamente esterilizada por flameado directo a la llama y con ella se
recoge el material de cultivo, para colocarlo en un área periférica de la caja
haciendo movimientos circulares para homogeneizar el inóculo. (ii) El asa debe
ser nuevamente flameada y enfriada en un lateral del agar (procurando no
dañarlo); a continuación, se realiza una estría partiendo de la primera y
arrastrando los microorganismos presentes en ella hacia el extremo contrario de
la superficie del agar. Se debe procurar que, en cada sección de la caja, las
estrías queden trazadas con mayor separación. (iii) Repita el paso ii, por tres
veces (algunos autores reportan solo dos), recordando flamear y enfriar el asa
cada vez que culmine una estría y solo tocar con el asa la estría inmediatamente
anterior, con el objetivo de ir reduciendo la carga microbiana arrastrada por la
argolla. Finalmente se esteriliza el asa antes de descartarla (Figura 1).
Fig. 1. Pasos para la siembra de bacterias por la técnica de agotamiento (y otros
microorganismos emulsionables como las levaduras) (Fuente: Rojas, A.).
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B. Siembra en cajas de Petri por la Técnica de siembra en cuadrantes.
El objetivo de esta técnica, es el de diluir el inóculo a medida que se realizan
estrías en la superficie del agar. Para realizar la siembra, la caja se divide en
cuatro cuadrantes (imaginariamente o con un marcador vidriográfico por la base
de la caja); se procede a esterilizar el asa en el mechero, se toma el inóculo y se
inicia el rayado de la superficie del agar, en cuatro cuadrantes consecutivos (sin
esterilizar el asa posteriormente o tomar nuevamente inóculo). Las cajas así
sembradas, se incuban a la temperatura adecuada de acuerdo a la bacteria. Con
esta técnica de siembra, se espera que al menos en el cuarto cuadrante (última
estría realizada), se encuentren colonias de la bacteria aisladas (Figura 2).
Fig. 2. Técnica de siembra en cuadrantes, donde se observan las cuatro estrías
realizadas una a continuación de la otra y sin cargar el asa nuevamente (Fuente:
Rojas, A.).
C. Siembras en cajas de Petri por la Técnica de siembra masiva.
Este método es muy utilizado para obtener un gran número de microorganismos
(incremento de inóculo), en la superficie de un agar. Esta técnica de siembra
utiliza un hisopo, el cual se pasa por toda la superficie de la placa en distintas
direcciones y finalmente por el borde para que, el crecimiento de los
microorganismos sea total en la superficie de la placa (Figura 3).
Fig. 3. Procedimiento para la realización de una siembra por la técnica masiva,
utilizando hisopos estériles y sobre la superficie de un agar en caja Petri (Fuente:
Rojas, A.).
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D. Siembras en cajas de Petri por la Técnica de punción.
Método de siembra utilizado para observar el crecimiento de hongos y así más
adelante establecer su morfología; así como, para la transferencia o subcultivo
de cepas previamente almacenadas y /o conservadas. Consiste en tomar parte
de micelio con un asa micológica (o asa recta), y por una punción suave en el
centro de la caja inocular el microorganismo a estudiar. Dependiendo del
objetivo, pueden hacerse múltiples picaduras en el agar (varios puntos de
siembra) (Figura 4).
Fig. 4. Procedimiento para la realización de una siembra por la técnica de
punción, utilizando asa micológica y sobre la superficie de un agar en caja Petri
(Fuente: Rojas, A.).
3.2. TÉCNICAS DE SIEMBRA EN MEDIOS CONTENIDOS EN TUBOS.
La siembra de medios contenidos en tubos requiere mayor cuidado, puesto que un
solo organismo contaminante del aire puede superar en crecimiento al
microorganismo de interés, por lo tanto, se deben tener las siguientes precauciones:
- Mantener inclinado el tubo que contiene el cultivo que se va a transferir, de modo
que los microorganismos del aire caigan en las paredes externas del tubo y no en
la boca de este. Los tapones se deben mantener en la mano contraría a aquella
que contiene el tubo, sosteniéndolos entre el dedo meñique, el anular y el dedo del
corazón. Nunca deben colocarse sobre la mesa de trabajo o algún otro lugar.
- Flamear la boca del tubo antes de cerrarlo después de la siembra o inoculación.
- Esterilizar el asa adecuadamente (toda la porción que entra en contacto con el
medio de cultivo).
- Sumergir el asa en el medio de cultivo, sin tocar las paredes del tubo.
- Enfriar el asa en una parte del medio, sin deteriorar el mismo.
- Después de realizar la siembra, esterilizar el asa y flamear nuevamente la boca del
tubo.
- Siembre trabaje con material abierto, en cámara de flujo laminar o en su defecto
con mecheros Bunsen.
- En las siembras por picadura y mixtas, evite romper el medio de cultivo, así como,
utilice asas totalmente rectas.
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A. Siembra en tubos por estría simple.
Se realiza en un tubo con medio sólido inclinado (en bisel o pico de flauta), y
deslizando el asa sobre la superficie expuesta del agar de manera que se
marquen surcos o estrías (Figura 5A).
Siembra mixta en tubos.
Se realiza sobre medios inclinados o en bisel, haciendo una picadura hasta el
fondo del tubo con asa recta y luego haciendo una siembra en estría sobre la
superficie expuesta del agar, deslizando el asa por la superficie en bisel
marcando las estrías; de tal manera que, con el asa cargada se realizan los dos
tipos de siembra y sin retirarla del tubo (Figura 5B).
B. Siembra en tubos por picadura.
Se designa con este nombre a la siembra que se realiza con asa recta en tubos
con medios sólidos y semisólidos generalmente sin inclinar. Se realiza
introduciendo el asa cargada con el microorganismo al medio de cultivo por el
centro de la superficie y llegando con el extremo del asa al fondo del tubo (Figura
5C y 5D).
C. Siembra en tubo en medio líquido.
Para transferir material a partir de un medio líquido o sólido a otro líquido, puede
usarse el asa bacteriológica (de argolla), o en algunos casos, pipetas estériles o
hisopos. Si Usted utiliza asas bacteriológicas, inocule el microorganismo en el
medio líquido haciéndola rotar del mango (Figura 5E).
Fig. 5. Técnicas de siembras aplicadas a medios de cultivo contenidos en tubos,
donde: (A) Siembra por estría simple, (B) siembra mixta (picadura y estría), (C y
D) siembra por picadura en agar inclinado y recto y, (E) siembra con asa
bacteriológica en medio líquido (Fuente: Rojas, A.).
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NOTA: En cualquier siembra que usted realice debe marcar previamente las cajas
Petri o los tubos de manera clara, completa, legible, con la identificación respectiva y
la fecha. Para análisis clínico, marcar siempre las cajas en la base de la caja Petri y
para análisis de control de calidad de alimentos u otras materias primas, marcar las
cajas en la tapa de la caja Petri. Luego de realizada la siembra, usted debe
proporcionar la temperatura y el tiempo adecuado para la proliferación o crecimiento
bacteriano, para ello dispone de la incubadora o en dado caso, un lugar adecuado a
temperatura ambiente. Recuerde que las cajas Petri se incuban invertidas; si el inóculo
no se ha adsorbido, espere 10 minutos, si este tiempo no es suficiente incube las cajas
con la tapa hacia arriba por 30 minutos antes de invertirlas. Lo anterior, tiene como
objetivo impedir que el agua de condensación que pueda formarse en la tapa de la
caja, caiga sobre el medio dispersando el crecimiento bacteriano y evitando la
formación clara de las colonias.
IV. MATERIALES Y EQUIPOS.
(Realice una preparación de agar y aplique las diferentes técnicas de siembra)
V. DISCUSIÓN
5.1. ¿Cuál es el objetivo o finalidad de una siembra por agotamiento?
5.2. Mencione brevemente el proceso de purificación de un aislamiento bacteriano
obtenido en agares.
5.3. Explique brevemente la metodología para realizar siembras en placa profunda
y placa en superficie.
VI. CONCLUSIONES
VII. BIBLIOGRAFÍA
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