LABORATORIO CLINICO

MANUAL DE BACILOSCOPIA.

TABLA DE CONTENIDO

 MUESTRA
 EL ESPUTO
 RECEPCION CONSERVACION Y TRANSPORTE DE NUESTRAS
 RECEPCIÓN DE LOS PACIENTES
 CONSERVACIÓN
 LA BACILOSCOPIA
 LUGAR DE TRABAJO Y MATERIALES
 PREPARACION Y FIJACION DEL EXTENDIDO
 TINCION
 OBSERVACION MICROSCÓPICA Y LECTURA DE EXTENDIDOS
 INFORME DE LOS RESULTADOS
 DECONTAMINACION Y DESECHO DEL MATERIAL
 CONTROL DE CALIDAD
 BIBLIOGRAFIA

ELABORADO POR: REVISADO POR: APROBADO POR:

Sandra Milena Tejero Moya. Gerencia Gerencia
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MANUAL DE BACILOSCOPIA.

MUESTRA

Para que el laboratorio pueda obtener resultados confiables no sólo es necesario que ejecute las técnicas
correctamente. También necesita recibir una buena muestra, entendiéndose por tal la que proviene del sitio de
la lesión que se investiga, obtenida en cantidad suficiente, colocada en un envase adecuado, bien identificada,
conservada y transportada.

La muestra más examinada es el esputo debido a que, como se ha dicho, la tuberculosis pulmonar es la más
frecuente. Sin embargo, dado que la enfermedad puede manifestarse en cualquier órgano, con menor
frecuencia puede requerirse la investigación de muestras muy variadas: orina, líquido cefalorraquídeo, líquido
pleural, líquido ascítico, sangre, pus de cavidades abiertas, biopsias. Estas muestras de lesiones extrapulmonares
deben procesarse también por cultivo.

EL ESPUTO

El envase

Debe tener las siguientes características:

• Boca ancha: de no menos de 50 mm de diámetro

• Capacidad entre 30 y 50 ml: para facilitar que el paciente pueda depositar la expectoración con facilidad
dentro , sin ensuciar sus manos o las paredes del frasco y para que en el laboratorio se
pueda seleccionar y tomar la partícula más adecuada, con comodidad, para realizar el
extendido .

• Cierre hermético: con tapa a rosca, para evitar derrames durante el transporte
y la producción de aerosoles cuando se abre en el laboratorio. Las tapas a presión
generan mayor riesgo de formación de aerosoles y salpicaduras en el momento de ser
retiradas

• Material plástico transparente,resistente a roturas, para poder observar la

calidad de la muestra cuando la entrega el SR, evitar roturas y derrames de material
infeccioso y para que pueda ser desechado. No se recomienda lavar y reutilizar frascos
de vidrio, para evitar posibles errores en la baciloscopia originados en la transferencia de
material de una muestra a otra y minimizar la manipulación de material potencialmente
infeccioso.

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Número de muestras y momento de la recolección

Para diagnóstico

Como la eliminación de los bacilos por el esputo no es constante, es conveniente analizar más de una muestra
de cada SR (Sintomático respiratorio) para el diagnóstico de la tuberculosis. La primera muestra puede detectar
aproximadamente el 80% de los casos positivos, la segunda agrega un 15% y la tercera un 5% más.

Las normas de los PNCT recomiendan la obtención de dos o tres muestras por SR, para que la probabilidad de
detección de bacilos sea la máxima posible.

La primera muestra debe ser tomada en el momento de la consulta (muestra inmediata), cuando el médico u
otro personal del equipo identifica que un consultante al servicio de salud es SR (es decir con tos persistente
durante 2-3 semanas) La segunda muestra la debe recolectar el paciente en su casa por la mañana al despertar
(muestra matinal). La tercera muestra, cuando sea requerida, puede ser tomada en el servicio de salud, cuando
el paciente concurre a entregar la segunda. También puede ser recolectada por el paciente al despertar en su
casa.

La obtención de la muestra en el momento de la consulta inicial asegura que se pueda realizar al menos una
baciloscopia del SR. Sin embargo, es más probable que se eliminen bacilos en las muestras matinales, por lo que
deben hacerse los mayores esfuerzos para que la persona regrese con otra(s) muestra(s).

Obtención espontánea del esputo

El primer paso para asegurar la calidad de la baciloscopia consiste en explicar al SR, con mucha claridad, la
importancia de examinar muestras de esputo, la necesidad de recolectar esputo y no saliva, la forma de lograr
una buena muestra, dónde colectarla y cómo manipularla hasta entregarla en el laboratorio

Para la recolección de las muestras

• Elegir un lugar bien ventilado y que ofrezca privacidad. Puede ser una habitación bien ventilada y con
acceso de luz natural (sol) o algún lugar abierto no concurrido del patio del Servicio de Salud.
Son inadecuados los lugares cerrados o muy concurridos tales como laboratorios,
consultorios médicos, salas de espera o baños, ya que éste es el proceso más riesgoso entre
todos los necesarios para realizar la baciloscopia.

• Entregar al SR el envase de recolección ya rotulado con su nombre o número de

identificación y número consecutivo. Estos datos deben ser escritos en la pared del frasco y
no en la tapa para evitar errores, con rótulos que no se despeguen o con lápiz indeleble.

• Solicitar al SR una buena muestra de esputo utilizando la palabra que lo identifica en cada lugar (gargajo, del
fondo del pecho, etc.), instruyéndolo con lenguaje simple y comprensible para que

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- Inspire profundamente llenando sus pulmones de aire tanto como sea

posible

- Retenga el aire un momento

- Expulse luego la expectoración con un esfuerzo de tos, tratando de

arrastrar las secreciones del pulmón

- Recoja el esputo producido dentro del envase tratando de que entre en su

totalidad, sin manchar sus manos o las paredes externas del frasco

- Repita esta operación otras dos veces colocando todas las secreciones en el mismo frasco

- Limpie el exterior del envase con un pañuelo de papel y se lave las manos con agua y jabón

Calidad de la muestra

La muestra de esputo mucopurulenta, proveniente de árbol bronquial, es la que asegura mayor probabilidad de
que se puedan observar bacilos

Mucopurulenta Sanguinolenta Mucosa Salivosa

Una buena muestra tiene aproximadamente 3 a 5ml, es generalmente espesa y mucoide. Puede ser fluida con
partículas de material purulento. El color es variable (blanco, amarillento y hasta verdoso). A veces son
sanguinolentas. Las secreciones nasales, faríngeas o la saliva no son buenas muestras para investigar
tuberculosis, aunque es conveniente examinarlas, de todas formas, porque siempre existe la posibilidad de que
contengan parte de la expectoración o bacilos expulsados por la tos que hayan quedado en la boca, nariz o
faringe .

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RECEPCION CONSERVACION Y TRANSPORTE DE NUESTRAS

RECEPCIÓN DE LOS PACIENTES

La recepción de los pacientes que entregan sus muestras debe ser organizada en un lugar de la unidad de salud
ventilado o donde el aire sea renovado por algún sistema. Debe ser ágil de tal manera que el paciente no espere.
Debe tenerse en cuenta que la permanencia prolongada de pacientes que están expectorando bacilos en una
sala de espera genera riesgo de transmisión de la tuberculosis en el centro de salud a otros pacientes y al
personal.

Para facilitar la identificación oportuna de los casos de tuberculosis las muestras de esputo producidas por los
SR deben poder ser colectadas y entregadas en cualquier hora del día, en el momento más adecuado para el
paciente mientras el centro de salud esté abierto.

El laboratorio debe recibir las muestras durante toda la jornada de atención a los pacientes. Luego puede
regular el momento en que las procesa ya que el esputo puede conservarse unos días, sobre todo si sólo va a ser
examinado por baciloscopia. Aun así, el examen debe ser realizado con la mayor premura posible, dentro de una
rutina lógica de trabajo,

En el momento de recibir la muestra, se deben completar los siguientes procedimientos:

• Comprobar que los envases de las muestras estén claramente identificados en la pared y no en la tapa y
cerrados herméticamente.

• Verificar que estén acompañados por el formulario de solicitud de baciloscopia.

• Observar la calidad de la muestra a través de las paredes del envase, sin abrirlo. Si se trata de saliva o
secreción nasal es conveniente recibirla porque, aun cuando no sea una muestra de buena calidad, puede
contener bacilos. Registrar que es saliva en el formulario. Insistir en las instrucciones indicando al paciente que
recoja otra muestra.

• Ubicar los envases dentro de cajas de plástico con tapa que

pueda ser decontaminadas con solución de hipoclorito de sodio.

Si el paciente no obtuvo esputo y devuelve el envase, también ubicar

el envase dentro de la caja para que luego sea desechado con el
material contaminado como si hubiera sido usado

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Después de recibida la muestra es necesario agilizar los procedimientos en todo lo posible. Cuanto antes se
procese, mayor será la posibilidad de encontrar en ella M. tuberculosis por baciloscopia o cultivo. La
temperatura ambiente y el transcurso del tiempo favorecen la multiplicación de los gérmenes habituales del
árbol respiratorio y de la boca que desnaturalizan las proteínas del esputo, dificultan la elección de la partícula
útil y favorecen la destrucción del bacilo.

CONSERVACIÓN

Si las muestras de esputo no van a ser procesadas en el día, es aconsejable introducir cada envase en una bolsa
de polietileno y anudar la bolsa encima de la tapa, de manera que quede sujeta firmemente. Las muestras
deben ser conservadas en refrigerador, preferentemente dentro de la caja de plástico. Si no se cuenta con
refrigerador, ubicarlas en un lugar fresco y protegidas de la luz.

Si las muestras van a ser procesadas sólo por baciloscopia y deben inevitablemente ser conservadas por varios
días, pueden ser esterilizadas. Se agrega unas 10 gotas de fenol al 5 % en el día en que se reciben, se tapa el
envase y mezcla suavemente. Este desinfectante mata a todos los gérmenes del esputo, incluyendo a las
micobacterias, pero aun así éstas se colorean por la técnica de Ziehl-Neelsen.

RECEPCIÓN EN EL LABORATORIO QUE HACE LA BACILOSCOPIA

El personal del laboratorio que recibe las muestras debe:

• Colocarse guantes desechables, si están disponibles, o de uso doméstico.

• Abrir la caja sobre la mesada dedicada exclusivamente para este fin

• Inspeccionar las muestras controlando si se han producido derrames.

• Desinfectar el exterior de los envases con algodón con solución de hipoclorito de sodio al 1% si se han
producido pequeños derrames durante el transporte. Si el derrame ha sido
masivo esterilizar toda la caja en autoclave o incinerarla.

• Comprobar que las muestras estén bien identificadas.

• Desinfectar la caja con hipoclorito de sodio al 1%

• Descartar los guantes desechables o sumergir las manos enguantadas con guantes domésticos que van
a ser reutilizados en una solución de hipoclorito de sodio al 1%.

• Lavarse las manos luego de quitarse los guantes.

• Anotar en el Registro de laboratorio los datos de cada paciente, el tipo y calidad de la muestra recibida,
el objetivo del estudio (diagnóstico o control de tratamiento).

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• Anotar los datos de cada paciente, el tipo y calidad de la muestra recibida, el objetivo del estudio
(diagnóstico o control de tratamiento) Calidad y cantidad de los esputos y en la forma de envío.

LA BACILOSCOPIA

La ácido-alcohol resistencia es la propiedad que tienen las micobacterias de captar en su pared fucsina fenicada
(de color fucsia y retenerla aun con la acción de decolorantes, como la mezcla de ácido y alcohol. Esta
característica se debe al alto contenido en lípidos, particularmente a los ácidos micólicos, que poseen en la
pared celular. Así, utilizando una técnica adecuada es posible identificar al bacilo de la tuberculosis en la
muestra del enfermo como un bastoncito rojo fucsia o fluorescente sobre una coloración de fondo que facilita
su visualización

Esta propiedad no es específica del bacilo de la tuberculosis, sino que la tienen todos los bacilos del género
Mycobacterium, aun las micobacterias ambientales y otros pocos microorganismos.

De todas formas, en los países de alta endemia de tuberculosis, una baciloscopia positiva en una muestra
respiratoria de un paciente inmunocompetente tiene muy alto valor predictivo para el diagnóstico de
tuberculosis. Es decir, es muy bajo el riesgo de equivocarse al diagnosticar tuberculosis por baciloscopia.

La coloración de Ziehl-Neelsen es la técnica más apropiada para ser utilizada en todos los laboratorios de los
países de América Latina. Es la recomendada por la Organización Mundial de la Salud (OMS) y la Unión
Internacional Contra la Tuberculosis y Enfermedades Respiratorias (UICTER) por ser la que asegura resultados
reproducibles con un entrenamiento sencillo y la más económica.

LUGAR DE TRABAJO Y MATERIALES

La baciloscopia puede ser realizada en laboratorios de cualquier complejidad, que posean un microscopio con
lente de inmersión en buenas condiciones, algunos insumos de bajo costo e instalaciones simples en el
laboratorio. . Deben seguirse normas básicas sencillas que aseguren calidad y minimicen los riesgos.

Es recomendable que el área de trabajo sea exclusiva, pero no siempre es posible. Si se debe

Compartir un área del laboratorio, es necesario escoger un sitio preferentemente alejado de la entrada, para
evitar corrientes de aire y movimiento de personal alrededor durante el procesamiento de las muestras.

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También es muy recomendable realizar los extendidos y coloraciones en un horario especial, en el momento de
menor trabajo en el laboratorio.

Los requisitos mínimos del laboratorio son:

• Buena iluminación

• Ventanas o extractor para renovar el aire una vez finalizado el trabajo.

• Paredes y pisos lavables que pueda ser desinfectados con solución de hipoclorito de sodio

• Una mesa o mesada para colocar las muestras que se reciban y realizar los extendidos, con dimensiones
mínimas de 1 x 0,50 m, en lo posible cubierta con material liso y resistente a soluciones germicidas (fórmica,
acero inoxidable o materiales similares). En caso de no contar con este tipo de mesada se puede utilizar
bandejas o cubrir la mesa con un vidrio o papel.

• Un lavabo con fuente de agua desagüe, en el que se pueda lavar las manos y realizar la tinción.

• Una repisa o armario para los reactivos, portaobjetos y demás materiales.

• Una mesa para el microscopio.

• Una mesa para escribir los informes y los registros del laboratorio

• Un armario para almacenar los frotis.

El equipo mínimo necesario para realizar las baciloscopias está integrado por los siguientes elementos:

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- Dos batas de uso exclusivo para cada persona que realice baciloscopia.

- Microscopio con objetivo de inmersión en buenas condiciones, con una lámpara de repuesto

- Envases para recolección de muestras.

- Aplicadores de madera.

- Láminas portaobjetos nuevas, limpiadas con alcohol y secadas al aire.

- Frascos color ámbar para soluciones colorantes.

- Un soporte para sostener láminas portaobjetos durante la preparación de extendidos.

- Varillas de vidrio u otro soporte inoxidable, de dimensiones adecuadas para sostener láminas
portaobjetos durante la tinción

- Un mechero, preferentemente de gas aunque puede utilizarse uno de alcohol

- Lápiz marcador de vidrio: graso o de tinta indeleble (que no sea de color rojo para evitar errores), con
punta de diamante, de los que se utilizan para marcar cerámicas

- Papel de filtro.

- Papel para limpieza de lentes, pueden ser pañuelos de papel desechables.

- Una pinza.

- Un hisopo.

- Un recipiente para descartar los envases con muestras, con tapa, de material resistente al autoclavado e
inoxidable o que contenga una bolsa roja para residuos patológicos.

- Aceite de inmersión: se recomienda no utilizar aceite de cedro, sino aceites a base de hidrocarburos
sintéticos o de polímeros con índice de refacción de 1,5 debido a que no se secan, no se endurecen y no son
disolventes de la fucsina

- Etanol al 70% o xilol

- Soluciones antisépticas: fenol al 5% hipoclorito de sodio al 1%.

PREPARACION Y FIJACION DEL EXTENDIDO

Si se observan las medidas de bioseguridad recomendadas en el Anexo I, el riesgo del personal de laboratorio de
adquirir la tuberculosis es mucho menor que el de quienes están cerca un enfermo que tose. La mejor medida
para evitar riesgos y errores, que pueden originar resultados imprecisos o falsos, es la sistematización de las
actividades siguiendo las siguientes indicaciones:

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• Lavarse las manos

• Colocarse la bata y guantes

• Ubicar en la mesa de superficie lisa, bandeja o papel embebido en hipoclorito de sodio al 1% sólo lo
necesario para realizar el extendido:

- mechero

- aplicadores

- soporte para los extendidos

- lápiz para marcar láminas portaobjetos

- láminas portaobjetos nuevos, previamente sumergidos en alcohol y secados al aire.

- no más de 12 envases con las muestras.

• Ubicar al lado de la mesa el recipiente para descartar el material con tapa

• Ordenar las muestras según su número.

• Para cada muestra, numerar una lámina portaobjetos, siempre en el mismo borde. Debe ser el mismo
número asignado en el Registro del laboratorio, en el formulario de la orden de examen y en las paredes del
envase que contiene la muestra. Si se utiliza lápiz graso, escribir el número en la cara inferior del portaobjetos
para evitar que se borre durante la tinción. No tocar con los dedos la parte del portaobjetos destinada al
extendido.

• Disponer las muestras a la izquierda del operador, o a la derecha, siempre en la misma posición,
en orden creciente de numeración. Ubicar cada lámina marcada delante de la muestra que le corresponde.

• Usar una lámina para cada muestra. No colocar extendidos de más de una muestra en una lámina.

• Si las muestras estuvieron en movimiento, dejar reposar los envases durante 20 minutos antes de
comenzar a abrirlos.

• Tomar la primera muestra y la lámina correspondiente y colocarlas detrás del mechero de manera que la
llama quede entre el operador y el frasco. Esta posición protegerá al laboratorista de posibles formaciones de
aerosoles al abrir el frasco.

• Destapar con cuidado el envase.

• Partir un aplicador en dos, tratando de que las puntas queden ásperas.

• Tomar una parte del aplicador con la mano izquierda y la otra con la derecha, entre el pulgar y el índice,
y con los extremos irregulares seleccionar la partícula más densa o purulenta de la muestra de esputo. Enrollarla
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en una de los dos partes del aplicador con la ayuda de la otra. Si la muestra contiene varias porciones
mucopurulentas, tratar de mezclarlas con movimientos muy suaves del palillo y luego tomar una porción de la
mezcla. Si sólo hay pequeñas partículas purulentas, escoger tres o más y mezclarlas en el mismo portaobjetos
para homogeneizarlas.

La selección de la partícula más purulenta de la muestra es uno de los pasos más importantes para aumentar la
probabilidad de identificar los casos de tuberculosis mediante la baciloscopia directa de esputo.

• Colocar la(s) partícula(s) seleccionada(s) sobre el portaobjetos y extenderla(s) con el aplicador con
movimientos suaves, circulares, tratando de dispersarla en forma homogénea en el centro de la lámina,
dibujando un círculo u óvalo de 2 cm de largo por 1 a 2 cm de ancho, sin llegar a los bordes de la lámina para
evitar que el operador se contamine al manipularla.

• Verificar que el extendido tenga grosor homogéneo y adecuado. Si es demasiado fino, es posible
producir un resultado falso negativo. Si es muy grueso, el material puede desprenderse durante la coloración o
puede resultar difícil la visualización de bacilos debajo de una capa gruesa de mucus. Se puede adquirir
entrenamiento poniendo un papel impreso debajo del extendido. El grosor adecuado es el que permite ver pero
no leer un texto impreso a través del preparado. Una vez adquirido el entrenamiento, es preferible no repetir
rutinariamente este proceso para evitar tocar y transferir muestras con los papeles impresos.

• Dejar el extendido en un soporte ubicado al costado de la mesada para que se seque a temperatura
ambiente. El extendido no debe ser calentado a la llama mientras esté húmedo pues el calor fuerte altera la
estructura de los bacilos y su posterior tinción; además puede generar aerosoles.

• Desechar el aplicador en un frasco que contenga una solución de hipoclorito de sodio al 1%; este
frasco irá al autoclave o directamente a incineración.

• Cerrar el envase de la muestra con la que se realizó el extendido y dejarlo en el lado opuesto al lugar
donde están los frascos con las muestras que aún no se han procesado, para evitar confusiones.

• Continuar de la misma manera con cada una de las muestras siguientes.

Conservar las muestras hasta terminar las lecturas de la baciloscopia y verificar que no es necesario realizar
nuevos extendidos o enviarlas para cultivo.

• Limpiar la superficie de trabajo con una toalla de papel o algodón empapado en hipoclorito de sodio al
1% para desinfectarla.

• Descartar los guantes desechables, junto con las muestras en el recipiente destinado a este fin. Si se
trata de guantes de uso doméstico, sumergir las manos enguantadas en solución de hipoclorito de sodio 1%
antes de quitárselos

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• Esperar a que las láminas se hayan secado al aire.

• Tomar de a uno cada extendido con una pinza manteniendo la cara que contiene la muestra hacia
arriba, y pasarlos rápidamente sobre la llama de un mechero tres o cuatro veces cuidando que no se caliente
demasiado.

• Colocar cada lámina fijada en un soporte, puede ser el soporte que se va a utilizar para la coloración.

Los extendidos deben ser coloreados de inmediato, ya que algunos bacilos pueden permanecer vivos después de
fijados con calor hasta que incorporan la fucsina.

PREPARACIÓN DEL EXTENDIDO

ORDENAR LAS MUESTRAS

MARCAR LOS PORTAOBJETOS

PARTIR EL APLICADOR

SELECCIONAR LA PARTÍCULA MÁS PURULENTA

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DEPOSITAR EN EL PORTAOBJETOS

EXTENDER LA MUESTRA UNIFORMEMENTE

FIJAR EL EXTENDIDO CUANDO ESTÉ TOTALMENTE SECO

TINCION

La técnica de Ziehl Neelsen

Coloración

• Disponer dos varillas de vidrio en forma paralela, a una distancia de aproximadamente 5 cm entre
una y otra una sobre un soporte dentro del lavabo/pileta de coloración;

• Filtrar la cantidad de fucsina necesaria para las tinciones a realizar en la jornada. Si el número de
baciloscopias a colorear es pequeño, se puede filtrar la fucsina directamente cuando se la deposita sobre el
extendido a través de un pequeño embudo con papel de filtro.

• Colocar sobre el soporte las láminasfijadas conservando el orden numérico con el extendido hacia
arriba y manteniendo una separación de al menos 1 cm entre ellas.

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• Cubrir totalmente la superficie del extendido con fucsina básica fenicada recién filtrada. Dispensar el
colorante con suavidad, sin salpicar y sin tocar con el gotero o con el embudo los extendidos

• Con la llamade un hisopo embebidoen alcohol calentar suavemente por debajo de los extendidos,
con movimientos de vaivén, hasta que observe que se desprenden los primeros vapores blancos. No
calentar con mechero.

• En caso de derrame del colorante, reponer la fucsina, no dejar secar el preparado.

• En el término de aproximadamente cinco minutos calentar tres veces hasta emisión de vapores; esto es
suficiente para que la fucsina penetre adecuadamente en el bacilo y se fije a sus lípidos. No hervir la fucsina
porque la pared de los bacilos puede destruirse y colorearse mal.

Con una pinza, levantar cuidadosamente la lámina portaobjetos desde el extremo más cercano al operador.
Enjuagar con abundante agua a baja presión, con un frasco o un grifo. Lavar muy suave y cuidadosamente la
superficie eliminando totalmente la solución de fucsina. Girar el extendido y lavar con cuidado también la parte
posterior.

• Inclinar el portaobjetos para eliminar el exceso de agua y así evitar diluir los reactivos que se utilizarán a
continuación.

Decoloración

• Cubrir la totalidad del extendido con solución decolorante y dejar actuar aproximadamente 3 minutos

• Enjuagar con abundante agua a baja presión.

• Verificar que el extendido se ha decolorado (laspartes más gruesas del extendido a lo sumo conservan
un leve tinte rosado). Si se observan cúmulos rojos o coloración rosada intensa, volver a cubrir con solución
decolorante, dejarla actuar entre uno y tres minutos y enjuagar nuevamente.

• Eliminar el exceso de agua inclinando el portaobjetos

Coloración de fondo

• Cubrir todo el extendido con solución de azul de metileno.

• Dejar actuar durante un minuto.

• Enjuagar las láminas en ambas caras con agua a baja presión y limpiar la parte inferior con un algodón si
ha quedado coloreada.

• Observar si las láminas conservan la numeración clara y visible. Si no es así volver a numerarlas.

• Dejar secar las láminas a temperatura ambiente, apoyándolas en posición vertical en un soporte sobre
un papel absorbente. No apoyar papel absorbente sobre el extendido.
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TINCIÓN DE ZIEHL NEELSEN

CUBRIR CON FUCSINA FILTRADA

CALENTAR HASTA EMISIÓN DE VAPORES TRES VECES DURANTE 5

MINUTOS

LAVAR CON AGUA

CUBRIR CON DECOLORANTE DURANTE 3 MINUTOS

LAVAR CON AGUA

CUBRIR CON AZUL DE METILENO DURANTE 1 MINUTO

LAVAR CON AGUA

SECAR AL AIRE

OBSERVACION MICROSCÓPICA Y LECTURA DE EXTENDIDOS

La observación microscópica debe cumplir principalmente dos objetivos:

• Determinar si en el extendido hay BAAR

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• Si los hay, cuantificar aproximadamente la riqueza en bacilos.

Características morfológicas del bacilo de la tuberculosis

Los bacilos acidorresistentes tienen entre 1 y l0 µm de largo. Con la coloración de Ziehl Neelsen se observan
como bastoncitos delgados, ligeramente curvos, rojo fucsia, destacándose claramente contra el fondo azul. En
los extendidos teñidos con auramina los bastoncitos se observan con fluorescencia amarilla. A veces se observan
con gránulos o cuentas intensamente coloreados en el interior. En la muestras de esputo pueden presentarse
aislados, apareados o

Agrupados. Es muy difícil distinguir el bacilo de la tuberculosis de otras micobacterias por examen microscópico.
Algunas micobacterias que no son M. tuberculosis pueden aparecer como bastones muy largos o como bacilo
cocos.

Otros microorganismos pueden presentar distintos grados de ácidorresistencia, como Rhodococous spp .
Nocardía spp . legionella spp . y los quistes de Críptosporidio e Isospora spp . Se observan como cocos, bacterias
con formas variadas (pleomórficas), filamentos que a veces están cortados, o como esferas de gran tamaño si se
las compara con las bacterias.

De todas formas, es poco frecuente encontrar más de 10 microorganismos ácido alcohol resistente diferente a
M. tuberculosis en las muestras de esputo de los SR. Cuando el baciloscopista observa alguno que no tiene
forma de bastón debe consultar al supervisor.

Lectura de extendidos coloreados por Ziehl Neelsen

• Ubicar cerca del microscopio todos los elementos necesarios: - aceite de inmersión

- pañuelos o trozos de papel suave

- el Registro del Laboratorio

- un lapicero

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- una caja para guardar portaobjetos

- un frasco con xilol o con etanol a 70%.

• Depositar una gota de aceite de inmersión en un extremo del frotis, sin tocar el preparado con el gotero.

• Enfocar el extendido donde ha colocado la gota de aceite, con la lente 100x de inmersión

• Observar cada campo microscópico en superficie y profundidad, moviendo permanentemente el tornillo

micrométrico, antes de desplazarse al campo contiguo.

• Seguir un recorrido en líneas rectas, sistemático para recorrer el extendido evitando repetir la
lectura de algunos campos. Ej.: de izquierda a derecha:

• Observar la calidad del extendido y de la coloración. Si no fuesen buenas, repetir nuevamente la

baciloscopia de esa muestra.

Bueno Grueso Fino

Mal decolorado No homogéneoEscaso material

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MANUAL DE BACILOSCOPIA.

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• Si se observan anormalidades, identificar las causas

- Si observa BAAR que se mueven en forma anormal, pueden ser bacilos provenientes de otra
baciloscopia que fueron arrastrados por el aceite de inmersión y es necesario reemplazarlo y repetir la
baciloscopia.

- Si se observan cuerpos extraños (artefactos) que se mueven cuando se desplaza el portaobjetos,

pueden ser restos de alimentos, precipitados o cristales. Si sólo se mueven cuando se gira el ocular, se
trata de suciedad que está en el ocular y hay que proceder a limpiarlo.

- Si no se mueven, la suciedad o bacilos contaminantes puede estar en los objetivos, el

condensador, el espejo o la fuente de iluminación; proceder a limpiarlos.

• Contar el número de campos que ha leído y el número de BAAR que ha identificado. Se puede utilizar
una cuadrícula de 10 cuadrados por 10 cuadrados, que representan los 100 campos microscópicos, como
ayuda para registrar la cuenta. En cada cuadrado anotar el número de BAAR que se observa. Si no observa
BAAR consignar 0.

El número total de campos a examinar depende de si se encuentran bacilos y en que concentración

Promedio de BAAR encontrados Número mínimo de campos útiles a examinar

Ninguno 100

Menos de 1 por campo 100

1 a 10 por campo 50

Más de 10 por campo 20

De 1 a 9 en todo el extendido 100

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• Para calcular el promedio de BAAR encontrados por campo, sumar el total de BAAR contados y dividir
ese total por el número de campos observados. Cuando los bacilos se presentan agrupados, una estimación
aproximada del número de bacilos presentes en el cúmulo es suficiente para calcular este promedio.

• Los campos leídos deben ser “campos microscópicos útiles”. Se considera campo microscópico útil a
aquel en el cual se observan células bronquiales (leucocitos, células ciliadas) o fibras mucosas, que aparecen
teñidos de azul. Los campos sin estos elementos no deben ser considerados para contar el total de campos
observados, a menos que contengan BAAR.

• El extendido preparado tal como fue descrito permite observar 100 campos microscópicos en línea
recta. Puede ser necesario leer una segunda línea para encontrar los 100 campos útiles.

• Un micros copista experimentado completa la lectura de 100 campos en aproximadamente cinco

minutos.

• Al finalizar la lectura, girar el revolver de los objetivos y retirar el portaobjetos de la platina

• Comprobar el número de identificación y registrar el resultado.

• Antes de examinar el portaobjetos siguiente, limpiar suavemente la lente de

inmersión con un trozo de pañuelo de papel absorbente. Esto evita la
transferencia de material al siguiente frotis que se va a leer.

• superficie observada con la lente 40 x es 4 veces mayor a la superficie

observada al leer con 100 x.

Procedimientos a seguir frente al hallazgo de menos de 5 BAAR en 100 campos

observados

Debido a la posibilidad de que se trate de artefactos de coloración, se recomienda:

• Ampliar la lectura a 200campos.

• Si con esa lectura no se encuentran más bacilos, hacer otro extendido de la misma muestra, tratando de
elegir partículas purulentas.

• Si la lectura del segundo extendido no modificael resultado del anterior la muestra debe informarse con
el número exacto de bacilos observados, consignando en el Libro de Registro el hallazgo y solicitar una
nueva muestra.

• Enviar para cultivo estas muestras

INFORME DE LOS RESULTADOS

La siguiente es la escala adoptada internacionalmente para el informe de los resultados de extendidos

examinados por la técnica de Ziehl Neelsen:

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• Registrar inmediatamente el resultado de la lectura en el Registro del Laboratorio. Marcar los resultados
positivos en rojo, para identificarlos rápidamente.

• Escribir el resultado en el formulario adoptado.

• Verificar que el informecontenga

- El nombre del paciente

- El número de identificación de la muestra

- El método de tinción utilizado

- El resultado del examen microscópico expresado según la escala estandarizada

- La fecha

- Toda observación que considere relevante, por ejemplo la calidad de la muestra si es inadecuada

- Firma del responsable del examen microscópico

• Enviar el resultado lo más pronto posible al centro de salud o al médico que solicitó el examen. El
tiempo que tarda en enviar los resultados es indicador de la eficiencia de su laboratorio.

DECONTAMINACION Y DESECHO DEL MATERIAL

• Desechar las muestras colocándolas en el recipiente de descarte, junto con los aplicadores y los papeles
que eventualmente se hubieran utilizado en todas las etapas, y los guantes desechables.

DERIVACIÓN DE MUESTRAS PARA CULTIVO

El cultivo incrementa la posibilidad de detectar el bacilo de la tuberculosis en las muestras de casos que están
afectados por un bajo número de bacilos, como los niños (tuberculosis primaria) o pacientes con tuberculosis
extrapulmonar. Además, permite diferenciar el bacilo de la tuberculosis de otras micobacterias en muestras
donde se pueden encontrar ambos, como en orina, contenido gástrico, o las de pacientes que viven con VIH. Por
último, permite conocer la sensibilidad de bacilos a drogas antituberculosas e identificar los casos que pueden
no responder al esquema de tratamiento de primera línea. . Esto puede ocurrir entre pacientes tratados en
forma irregular o con dosis insuficientes, y entre sus contactos.

El laboratorio debe encauzar la investigación por cultivo en los siguientes casos aun cuando no exista solicitud
de cultivo por parte del médico.

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Muestra Examinada para y tomada de un paciente Encaminar la

muestra para

Esputo diagnostico con síntomas respiratorios

persistentes y dos o más
cultivo
muestras anteriores con
baciloscopias negativa

Cualquiera diagnóstico inmunodeprimido

Baciloscopia negativa o
positiva

Cualquiera diagnóstico niño

Baciloscopia negativa Cultivo e

identificación

Lavado bronquial diagnóstico cualquiera

Contenido gástrico

Baciloscopia negativa o
positiva

Cualquiera diagnóstico • con antecedentes de prueba de

tratamiento
Baciloscopia positiva sensibilidad
• contacto de
directa a partir de
paciente
la muestra
multirresistente
(si el resultado de

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• expuesto a
infección
hospitalaria o en cárceles
la
donde se asisten/ internan
casos resistentes a las drogas baciloscopia es 2+
o 3+)
Esputo control de tratamiento • que finalizó dos o
o cultivo y
mas meses de
Baciloscopia positiva
tratamiento prueba de
sensibilidad
• que convirtió su
baciloscopia de negativa
a positiva

CONTROL DE CALIDAD

El control de calidad permite evaluar si la información producida por el laboratorio es precisa, reproducible y
oportuna.

Instaura un sistema de alarmas que permite prevenir, descubrir y corregir errores Resulta más eficaz para
detectar y asistir a los casos de tuberculosis y para controlar la enfermedad

El control de calidad es un procedimiento que emprenden en conjunto los distintos niveles de la red de
laboratorios y tiene como objetivo a elevar y mantener la calidad de trabajo. No tiene carácter punitivo
(aplicación de sanciones).

CONTROL DE CALIDAD INTERNO

Es responsabilidad de cada laboratorio que realiza baciloscopias. En particular, el responsable del laboratorio
debe establecer en la rutina de trabajo un sistema de controles regulares y continuos de los puntos críticos.

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El control de calidad interno comprende

• la evaluación de materiales, equipos, reactivos

– el desempeño del personal

– los procedimientos

– la precisión y oportunidad de los informes

– la oferta y aplicación adecuada de la baciloscopia

– el rendimiento de la baciloscopia para detectar casos

• el seguimiento de los resultados de los controles de calidad

• las medidas correctivas a aplicar cuando la imprecisión del resultado excede

los límites considerados aceptables o se producen demoras evitables

Causas de error en la microscopía

Falsos Falsos
positivos negativos

• No representativa de la lesión X

Inherentes a la • Recogida en momento inadecuado X

muestra • Insuficiente X

Mal conservada X

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Inherentes al • Mala selección de la partícula útil X X

operador
• Defectos en la realización del extendido: X X

• - extendidos finos, gruesos o poco X X

homogéneos
• X X
- fijación de extendidos húmedos o a
• X X
temperaturas superiores a 60ºC
• X X
Defectos en la realización de la coloración:
• X X
- calentamiento deficiente o excesivo
X
- decoloración insuficiente
X
- precipitación de cristales por uso de
reactivos no filtrados o calentamiento excesivo X
- decoloración excesiva X
Defectos en la lectura: X
- uso de microscopio en mal estado

- lectura de un número insuficiente de campos

- observación de 1 solo nivel del extendido

- poco entrenamiento para diferenciar bacilos

de artificios de coloración.

Transferencia de bacilos de un extendido a otro por

el asa mal flameada, salpicaduras o el dispensador
de aceite de inmersión contaminado.

Confusión de muestras y/o extendidos

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Errores en trascripción de resultados

• Límite de sensibilidad 5 .000-10 .000 bacilos/ml de

Inherentes a la X
muestra se detectan BAAR que pueden ser no
técnica patógenos y no cardias hay 1 a 9 va/100 campos X
X

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CONTROL DE CALIDAD EXTERNO

De láminas

Es responsabilidad del laboratorio de referencia. Todas las láminas deben ser conservadas durante al
menos un mes, porque pueden ser solicitadas por el laboratorio de referencia para su relectura.

Conservación de las láminas:

• Quitar el aceite de las láminas leídas presionando muy suavemente sobre ellas un papel
absorbente.

• Colocarlas en elsoportede coloraciones y cubrirlas o sumergirlas en un recipiente para lavado de

láminas portaobjetos, con xilol o alcohol 70%, durante no más de 30 segundos.

• Volcar el alcohol o xilol y dejar secar al aire.

• Comprobar que la numeración esté visible en las láminas.

• Guardarlas en cajas para láminasportaobjetos, o dentro de una caja común

envueltas individualmente en papel, en paquetes que agrupen las de un día o de una semana,
rotulados con la fecha, en el orden en que se realizaron. No poner en este rotulo el resultado de
cada una.

• Conservarlas en lugar seco y fresco.

• Descartarlas después de un mes si no han sido solicitadas por el laboratorio de referencia.

Eventualmente, se puede recibir del laboratorio de referencia un panel de láminas para colorear, leer e
informar. Este panel debe ser introducido en el procedimiento de rutina, sin realizar procedimientos
especiales para este control.

Mantener en un archivo los resultados de los controles de calidad externo. Analizar cada resultado e
implementar medidas correctivas, si fueran necesarias, siguiendo las recomendaciones del laboratorio
de referencia.

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BIBLIOGRAFIA.

MANUAL PARA EL DIAGNOSTICO BACTERIOLOGICO DE LA TUBERCULOSIS. Normas y guía técnica.

Organización Panamericana de la salud. 2008

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