TÉCNICAS EN

MICROBIOLOGÍA

TÉCNICAS DE
ANÁLISIS MICRIBIOLÓGICO
DE ALIMENTOS

Curso académico 2016/17

 Técnicas en Microbiología

TÉCNICAS DE
ANÁLISIS DE ALIMENTOS

MICROORGANISMOS MARCADORES EN ALIMENTOS

Grupos (o especies) de microorganismos cuya presencia en los alimentos en determinado número
indica que estos productos estuvieron expuestos a condiciones que pudieran haber introducido
microorganismos peligrosos y/o permitido la multiplicación de especies infecciosas o toxigénicas.
Sirven para evaluar tanto la seguridad que ofrecen los alimentos en cuanto a microorganismos y sus
toxinas, como su calidad microbiológica.

Se ha propuesto la distinción de dos grupos de organismos marcadores:

Indices: aquellos microorganismos marcadores cuya presencia en un alimento indica la posible

presencia simultánea de patógenos ecológicamente relacionados. Por ejemplo, E. coli se utiliza
como índice de la posible presencia de patógenos de procedencia entérica, entre ellos Salmonella.

Indicadores: grupos de microorganismos que indican deficiencias en la calidad microbiológica de un

alimento. Por ejemplo, la presencia en alimentos pasteurizados de enterobacterias en un número
significativo (que deberían haber sido eliminadas por el tratamiento) puede advertir de deficiencias
tales como tratamiento térmico insuficiente o recontaminación posterior al tratamiento, y por
tanto un riesgo para el consumidor.

Un mismo marcador puede funcionar como índice o indicador, incluso en el mismo alimento.

El principal objetivo de la utilización de bacterias como indicadores de prácticas no sanitarias es

revelar defectos de tratamiento que llevan consigo un peligro potencial, peligro que no está
necesariamente presente en la muestra examinada pero que es probable pueda encontrarse en
muestras paralelas.

PREPARACIÓN DE LA MUESTRA (ETAPA COMÚN)

El primer paso para poder proceder al análisis microbiológico de un alimento es la toma de la
muestra y la preparación del homogeneizado inicial o dilución madre.

El principio más importante a seguir en la toma de la muestra es que ésta debe ser representativa
del total del alimento. Así, si el alimento a analizar está compuesto de distintas “porciones”, la
muestra debe ser representativa del alimento completo que se está analizando.

El procedimiento más frecuentemente utilizado para la homogeneización de la muestra consiste en

la utilización de un homogeneizador de paletas tipo "Stomacher" en el cual se homogenizan
diluyente y muestra.

En el homogeneizador de paletas la muestra es introducida en una bolsa estéril de plástico

desechable, en la que dos palas de acción recíproca aplican una presión de golpeo controlado
contra la puerta y evitando cualquier contacto entre el equipo y la muestra.

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De esta forma se prepara una suspensión más o menos homogénea de alimento y microorganismos
que permite la preparación posterior de las oportunas diluciones que posteriormente serán
utilizadas en los diversos métodos de recuento.

1. Pesar asépticamente 10 g del alimento directamente en una bolsa de plástico para

homogeneizador.

2. Añadir a la bolsa 90 ml de diluyente estéril, colocar

la bolsa en el homogeneizador y cerrar la puerta.
3. Homogenizar el alimento con el diluyente durante
0,5 a 2 minutos según la consistencia del alimento.
4. Finalizado el proceso, abrir la puerta y extraer la
bolsa. La muestra homogeneizada está preparada
para el análisis.

Así conseguimos el homogeneizado inicial que es directamente la

dilución 1:10.

A partir de esta dilución, preparar diluciones decimales siguiendo el

procedimiento del recuento de microorganismos por siembra en
placa. Tendremos en cuenta que en este caso ya partimos de la
dilución 1:10.

El número de diluciones que se necesita depende de lo

contaminado que este el alimento. De un alimento del que se
sospecha un número alto de microorganismos por gramo hay que
hacer más diluciones que de uno poco contaminado.

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RECUENTO DE MICROORGANISMOS VIABLES TOTALES.

Se trata de conocer el número total de microorganismos presentes en el alimento. Este número no
guarda relación con el de microorganismos patógenos por lo que no puede usarse como índice de
su presencia y sólo debe considerarse un indicador de las características higiénicas generales del
alimento.

Dependiendo de las características del medio utilizado (medio rico, medio limitado en nutrientes
para medida de la microbiota no láctica de alimentos fermentados) y de las condiciones de
incubación (mesófilos, psicrófilos) los microorganismos analizados serán miembros de poblaciones
diferentes. En general se investiga la presencia de microorganismos aerobios o aerotolerantes;
aunque, en ciertas situaciones (alimentos envasados al vacío), puede ser de interés hacer recuentos
de anaerobios totales.

En estas prácticas utilizaremos las siguientes técnicas básicas de recuento de microorganismos

viables:

Recuento de microorganismos viables totales por siembra en placa

A partir de la dilución madre o macerado inicial (dilución 1:10), preparar las diluciones seriadas y
seguir el procedimiento estudiado en la práctica Recuento de microorganismos viables por siembra
en placa.

• Microorganismos aerobios totales:

Determinaremos el número total de
microorganismos aerobios mesófilos siguiendo
la Técnica de recuento en placa por siembra en
profundidad, e incubando a 32 °C en
condiciones aerobias (medio de cultivo: agar
genérico).

Incubar 72 h y expresar los resultados como ufc

/ gramo de alimento (o ml para líquidos).

• Microorganismos anaerobios totales:

Determinaremos el número total de microorganismos anaerobios mesófilos siguiendo
la Técnica de recuento en placa por siembra en superficie, e incubando a 32 °C en
condiciones anaerobias utilizando una jarra de anaerobiosis (medio de cultivo: agar
genérico). Incubar 72 h y expresar los resultados como ufc / gramo de alimento (o ml para
líquidos).
Véase el anexo Recuento de microorganismos anaerobios.

Métodos basados en la reducción de colorantes

Utilizados para determinar la calidad microbiológica en alimentos líquidos lácteos, utilizando

colorantes como el azul de metileno o la resazurina. La actividad bacteriana provoca la reducción
del colorante. Obtendremos así una variable cuantitativa (tiempo de reducción) que puede

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correlacionarse con el número total de microorganismos presentes. Los veremos en detalle más
adelante.

DETECCIÓN Y RECUENTO DE ENTEROBACTERIAS TOTALES

El empleo de las enterobacterias como microorganismos indicadores se basa en que estas bacterias
son destruidas por los tratamientos de pasteurización y el clorado de las aguas con gran facilidad.
Por esto, la presencia de altos valores de Enterobacteriaceae en los alimentos es síntoma de fallos
en el proceso de elaboración o de conservación que pueden acarrear riesgos para el consumidor.

Metodología:

Los métodos generales son el recuento en placa por siembra en profundidad en agar VRBG (con
Cristal Violeta, Rojo Neutro, Bilis y Glucosa) como medio selectivo y diferencial.

El agar VRBG contiene sales biliares y cristal violeta, que

inhiben el crecimiento de las bacterias Gram (+), y rojo neutro
(colorante indicador de pH) que tiñe de rojo las colonias de
microorganismos fermentadores (la degradación de la glucosa a
ácido se pone de manifiesto por el cambio de color del
indicador). La presencia de halo en estas colonias corresponde
a un precipitado de sales biliares.

Partiendo de la dilución madre preparada, seguir el

procedimiento del recuento en placa por siembra en
profundidad utilizando medio agar VRBG.

Una vez solidificado el agar, para forzar las condiciones de anaerobiosis, añadir una segunda capa
de agar y dejar solidificar. Esto limitará la difusión del oxígeno al medio de cultivo, limitando el
crecimiento de microorganismos aerobios. Las enterobacterias crecerán dado que son anaerobias
facultativas.

Condiciones de incubación: 48 h a 37 °C.

Expresar los resultados como ufc / gramo de alimento (o ml para líquidos).

ENUMERACIÓN DE COLIFORMES FECALES Y E. coli.

E. coli es un indicador de contaminación directa/indirecta de origen fecal. Indicador clásico de la
posible presencia de patógenos entéricos en aguas, moluscos, productos lácteos y otros.

Es indicador de la falta de higiene en la manipulación de un alimento y de un almacenamiento

inadecuado.

Siguiendo los procedimientos descritos hasta ahora, realizaremos la enumeración de E. coli por
recuento en placa por siembra en superficie sobre agar FC (Faecal coliforms).

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Dado el bajo número de E. coli permito en alimentos, la siembra de la dilución madre y la 1:100 es
suficiente. Incubar a 44,5 ºC durante 24 h. Recontar las colonias de color azul y expresar los
resultados como ufc por gramo o ml de alimento.

El agar FC es un medio selectivo y diferencial para enumeración de coliformes fecales. Debe su

selectividad a las sales biliares y a la temperatura de incubación (44,5 °C aproximadamente).

La presencia de las sales biliares le confiere un carácter

selectivo para las enterobacteriáceas, que a su vez se
hace selectivo para los coliformes fecales al incubar a 44,5
°C.

Este medio se hace diferencial suplementándolo con ácido

rosólico, lo que hace que las colonias de coliformes fecales
al fermentar la lactosa aparezcan de color azul (a veces
acompañado de un viraje del medio circundante a azul), y
las demás de color gris o rosado.

RECUENTO DE ESTAFILOCOCOS COAGULASA POSITIVOS.

• Indicadores de contaminación por manipuladores (a partir de vías orales, nasales, piel, etc.),
material y equipos sucios.

• Las materias primas de origen animal también pueden ser fuente de contaminación.

• Su presencia en alto número en un alimento indica:

 prácticas de higiene, limpieza y desinfección, y control de temperatura inadecuados,

 peligro por la posible presencia de cepas de Staphylococcus aureus enterotoxigénicas

en nº peligroso.

Para su investigación y recuento, sembrar según la técnica de recuento de microorganismos viables

por siembra en superficie sobre Agar Sal y Manitol. Después de incubar las placas a 30-35°C
durante 18-72 horas, se observa la presencia o no de
crecimiento característico de colonias amarillas rodeadas
de halo amarillento que indica la posible presencia de S.
aureus. Se deberán confirmar colonias sospechosas.

Expresar los resultados como ufc / gramo de alimento (o ml

para líquidos).

El medio de cultivo Agar Sal y Manitol (ASM) se emplea

para el aislamiento selectivo y recuento de estafilococos
patógenos en productos lácteos, cárnicos, marinos y otros
productos alimenticios.

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La formulación del medio se basa en la propiedad, ya enunciada por Koch, de que el crecimiento de
los estafilococos no era inhibido por una concentración de cloruro sódico del 7,5%, mientras que
esto sí sucedía con la mayoría de las bacterias restantes. El efecto inhibidor se debe por tanto a la
alta concentración de cloruro sódico del medio.

El ASM también contiene el azúcar manitol y el indicador de pH rojo fenol. Si un microorganismo

puede fermentar el manitol, se forma un subproducto ácido que hará que el rojo de fenol en el agar
se vuelva amarillo. La mayoría de los estafilococos patógenos, tales como Staphylococcus aureus,
fermentan manitol. La mayoría de los estafilococos no patógenos no fermentan el manitol.

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Anexo. Recuento de microorganismos anaerobios

El procedimiento es exactamente el mismo descrito en las técnicas anteriores, con la diferencia de
que en este caso la incubación se hará en una atmósfera limitante en oxígeno para favorecer el
crecimiento de los microorganismos anaerobios y anaerobios facultativos y limitar el de los
microorganismos aerobios.
• Localizar las placas inoculadas en la jarra de anaerobiosis (son preferibles las placas petri de
plástico del tipo venteado para ayudar a la transferencia del aire entre las placas y la jarra).
• Abrir un sobre de generador de anaerobiosis, retirar el saco de papel del generador y
localizarlo inmediatamente en la jarra en el compartimento interior de la misma diseñado
para este fin. Puede añadirse un indicador de condiciones de anaerobiosis (un colorante
que cambia de color entre los estados oxidado y reducido, como el azul de metileno).
• Cerrar la tapa de la jarra inmediatamente.

Nota: entre que se introduce el saco en la jarra y se

cierra herméticamente ésta, debe transcurrir menos de
un minuto.

Incubar en las condiciones adecuadas y observar las

placas para la presencia de anaerobios.

Generador de anaerobiosis.
El generador consiste en unos sacos que se introducen en la jarra de
anaerobiosis para generar una atmósfera libre de oxígeno. El
compuesto activo es normalmente ácido ascórbico. El oxígeno de la
atmósfera de la jarra es rápidamente absorbido con la generación
simultánea de CO2.
El nivel de oxígeno se reducirá a menos del 1% en 30 min, mientras el
CO2 aumentará hasta el 9 – 13%.

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AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE SALMONELLA.

Características generales de Salmonella.

Todos los microorganismos del género Salmonella son potencialmente patógenos para el hombre.
Producen gastroenteritis infecciosa aguda asociada con intoxicaciones alimentarias.

Los microorganismos del género Salmonella pertenecen a la familia Enterobacteriaceae.

Son bacterias de forma bacilar, no esporuladas, habitualmente móviles mediante flagelos perítricos,
aunque existen especies inmóviles. Son bacilos Gram negativos, anaerobios facultativos, fermentan
la glucosa con producción de gas, pero no fermentan la lactosa.

Medios de cultivo y reactivos

• Caldos genéricos, como el Agua de peptona tamponada

• Caldos selectivos, como el Caldo de Tetrationato
• Medios sólidos diferenciales, como el Agar Salmonella - Shigella
• Kit de identificación bioquímica
• Kit de identificación serológica

Fases del aislamiento e identificación de Salmonella

1. Pre-enriquecimiento en medio líquido no selectivo.

2. Enriquecimiento en medios líquidos selectivos.
3. Aislamiento diferencial sobre medios sólidos selectivos.
4. Confirmación bioquímica de las colonias sospechosas.
5. Confirmación serológica de las colonias sospechosas.

Preenriquecimiento en medio líquido no selectivo

Esta etapa de pre-enriquecimiento no selectivo sirve para que si en el alimento existiese

Salmonella, las células de ésta se multipliquen y se puedan aislar posteriormente; también tiene por
objeto reparar las células que pudieran haber sufrido lesiones subletales. Este último objetivo se
logra siempre sembrando en medios de cultivo líquidos no selectivos (como es el caso del agua de
peptona tamponada) a temperaturas óptimas para el microorganismo que se quiere reparar, en
este caso Salmonella.

• Pesar, asépticamente y en envase estéril (bolsa de homogeneizador), 25 g. de alimento.

• Añadir 225 ml de agua de peptona tamponada.
• Homogenizar en Stomacher.
• Incubar a 37 °C durante 18 a 20 horas.

Enriquecimiento en medio líquido selectivo

En esta fase se pretende restringir el crecimiento de la flora competitiva. Para ello se utilizan
medios que contienen agentes selectivos. Sin embargo no existe ningún medio de cultivo que sea
totalmente selectivo para Salmonella de modo que lo que conseguimos en realidad es evitar el
crecimiento de "parte" de la flora competitiva.

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Agitar el cultivo de pre-enriquecimiento y sembrar,

con pipeta estéril, 1 ml de cultivo en 10 ml de Caldo
de tetrationato (medio líquido selectivo)

Incubar a 37 °C durante 18-24 horas

En el caldo de tetrationato, el tetrationato inhibe el

crecimiento de la mayoría de las bacterias entéricas,
excepto aquellas capaces de reducirlo, como
Salmonella. Las sales biliares, por su parte,
estimulan el crecimiento de Salmonella e inhibe el
de las bacterias Gram (+). El carbonato cálcico actúa
de tampón para evitar el descenso de pH provocado
por la reacción de reducción del tetrationato.

Aislamiento diferencial en medios sólidos

En esta etapa se utilizan medios de cultivo diferenciales que por su composición permiten que las
colonias de Salmonella crezcan con un aspecto característico en cada uno de ellos (colonias típicas).

A partir de los cultivos obtenidos en los distintos medios líquidos selectivos, sembrar
sobre Agar Salmonella - Shigella (SSA) siguiendo la técnica del aislamiento en estría.

En este medio, las sales biliares y el verde brillante actúan inhibiendo bacterias gram (+).
El citrato y el tetrationato inhiben el crecimiento de coliformes y Proteus. No obstante, algunos
coliformes son todavía capaces de crecer y se ponen de manifiesto por el colorante indicador de
pH rojo neutro: las bacterias que no fermentan lactosa, como es el caso de Salmonella y Shigella,
dan colonias incoloras, mientras que las que sí la fermentan hacen virar el rojo neutro dando lugar
a colonias rosas o rojas. Las especies productoras de SH2 dan colonias con un precipitado
negro en el centro.

Incubar en estufa a 37 °C durante 24 horas.

Resultados en Agar SALMONELLA - SHIGELLA

Las colonias sospechosas de

Salmonella crecidas sobre agar
Salmonella - Shigella son
incoloras y/o con precipitado
negro.

Las especies fermentadoras de

la lactosa dan colonias
rosadas.

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Comprobación Bioquímica.

Seleccionar al menos dos colonias sospechosas. Sembrar las colonias sospechosas sobre agar o
caldo nutritivo genérico.
Incubar a 37 °C durante 18 - 24 horas. Comprobar la pureza del cultivo, que servirá para efectuar las
pruebas confirmativas bioquímicas y serológicas.

Sembrar una galería de identificación

bioquímica partiendo de los cultivos
seleccionados.

En la imagen: galería Enterosystem 18R.

Identificación Serológica.

Utilizaremos el “Kit Test para Salmonella”. Es una prueba de aglutinación de látex rápida y simple
para la identificación tentativa de Salmonella.
Fundamento.- Se preparan antisueros polivalentes contra una amplia gama de antígenos flagelares
de Salmonella para recubrir partículas de látex. Al mezclarse con una solución que contenga
Salmonella con estos antígenos, las partículas de látex se aglutinan rápidamente, formando
aglomerados visibles. Con el fin de evitar las reacciones cruzadas con otras enterobacterias, se
retiran los anticuerpos contra los principales antígenos somáticos durante la preparación de los
antisueros.

Dejar caer una gota del reactivo con anticuerpos

sobre una de las áreas de reacción.

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Con ayuda de una pipeta Pasteur estéril, retirar una

gota del cultivo puro problema y depositarla sobre
la gota del reactivo con anticuerpos. Mezclar bien
utilizando un asa de siembra.

Agitar suavemente la tarjeta de reacción durante un

tiempo máximo de dos minutos.

Lectura e Interpretación de Resultados

Resultado positivo

Se considera resultado positivo si se da aglutinación

de las partículas en un máximo de 2 minutos. Esto
indica la presencia de Salmonella.

Resultado negativo

Se considera resultado negativo si no se da

aglutinación y permanece una suspensión azul ligera
en las áreas de reacción en un máximo de 2 minutos
Esto indica que el aislamiento no es Salmonella.

Las reacciones que acontecen tras 2 minutos deben

ignorarse.

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Films secos (Placas 3M™ Petrifilm™)

Son películas deshidratadas de medios de cultivos generales o selectivos en las que se deposita 1 ml
de la muestra que rehidrata el medio.

Procedimiento.

El procedimiento descrito es idéntico para todos los medios Petrifilm que utilizaremos en prácticas,
variando únicamente según el tipo de medio la forma de utilizar el aplicador, así como las
condiciones de incubación según el grupo bacteriológico que se esté investigando en cada caso.

Partiremos de dilución madre y diluciones seriadas ya preparadas.

• Colocar la placa Petrifilm en una superficie plana. Rotular sobre el margen superior del film
los datos identificativos de la muestra y dilución a sembrar.
• Levantar el film superior. Con una pipeta perpendicular a la placa, colocar 1 ml de muestra
en el centro del film inferior.
• Bajar el film superior con cuidado evitando introducir burbujas de aire. No dejarlo caer.

• En la placa para el recuento de microorganismos viables totales, colocar el aplicador

centrado en la gota de medio con la cara del aplicador con reborde hacia abajo y presionar
ligeramente para marcar sobre el medio el límite de la placa.

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• En las placas con forma circular preformada, como es el caso de las de coliformes, colocar si
es necesario el aplicador con la cara lisa hacia abajo sobre la muestra y deslizar suavemente
para repartir la muestra sobre el área circular. No girar ni deslizar el aplicador.

• Levantar el aplicador. Esperar un minuto a que solidifique el gel.

• Incubar las placas Petrifilm cara arriba en pilas de hasta 20 placas a temperatura de
incubación adecuadas según el grupo bacteriológico en investigación.

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PRUEBAS DE CALIDAD DE LA LECHE

La leche fresca de vaca es un alimento de composición compleja; ya que contiene la lactosa en

solución acuosa, las proteínas en estado coloidal, la grasa en estado de emulsión y los
minerales formando complejos con la caseína o bien en forma de sales en solución acuosa. El
equilibrio fisicoquímico de la leche es solo temporal y puede modificarse rápidamente por
factores físicos o bien por factores químicos siendo los más importantes, la separación parcial
de los glóbulos de la grasa y la coagulación de la caseína promovida por el pH del medio
acuoso (debido a la producción de acido láctico por las bacterias lácticas). La minimización
de los cambios de la leche fresca de la vaca antes de ser sometida a cualquier proceso
de conservación o transformación, es determinante para su aceptación y es a través de
los análisis que podemos evaluar su nivel de calidad.

Pruebas de reducción de colorantes

El tiempo de decoloración de un colorante indicador de óxido-reducción da una medida del

grado de contaminación de una leche, pero la relación no es estrecha ya que la actividad
reductora varía bastante según los grupos bacterianos considerados.

1. Prueba del tiempo de reducción del azul de metileno (TRAM) o Prueba de la

reductasa.

El mecanismo del Azul de Metileno para valorar la calidad microbiológica está relacionado con
la actividad reductora de las bacterias que en el proceso de respiración eliminan el oxígeno
disuelto en la leche.

El potencial redox de la leche fresca es aproximadamente de

0,35 – 0,40 V debido principalmente al contenido de O2 presente
en la leche. En este potencial el azul de metileno se encuentra
en su forma oxidada (azul). Si por cualquier causa este O2 es
separado, el Eh disminuye. Esto es lo que ocurre durante el
crecimiento bacteriano. Si la población bacteriana inicial es muy
elevada, el consumo de O2 será elevado y por lo tanto el Eh
caerá rápidamente provocando la rápida reducción del azul de
metileno, que pasa a la forma incolora (reducida). Si por el
contrario el nº de microorganismos es pequeño, el Eh disminuirá
lentamente.

A intervalos regulares se observa el color de la mezcla, pudiendo

así definirse diferentes categorías de leches según el tiempo de reducción del azul de metileno
(TRAM) hasta la forma incolora.

Prueba:

Indicador: 5 mg de azul de metileno disueltos en 100 ml de agua estéril.

• Colocar los tubos de ensayo estériles y adicionar a cada uno 1 ml de la solución de

indicador
• Adicionar 10 ml de cada muestra de leche. No mezclar.

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• Llevar los tubos a un baño a 36 °C junto con un tubo patrón (leche sin indicador).
Cuando la temperatura de la muestre alcance 36 ± 1 °C, mezclar el contenido por
inversión 3 veces para una perfecta distribución del colorante y la crema. Tapar el
baño María para proteger los tubos de la luz.
• Comenzar a contar el tiempo de reducción en el momento
en que se invierten los tubos y observar frecuentemente su
color durante la primera media hora sin agitarlos. Una
muestra se considera reducida cuando presenta 4/5 del
volumen decolorados.
• Si una muestra se decolora durante un período inferior a 30
min, registrar el resultado como “TRAM = 30 min”.
• Si la mezcla no está totalmente decolorada, se sigue a
intervalos de una hora hasta que al menos 4/5 estén
decolorados. Mezclar el contenido por inversión en cada
observación.

El tiempo se registra en horas enteras. Así, si a las 2 1/2 horas se

observa decoloración, el resultado se registra como “TRAM = 2 horas”.

Existen muchas tablas que intentan correlacionar el TRAM con el número de microorganismos
por ml de leche, pero esta correlación debe hacerse para cada zona de producción ya que está
afectada por numerosos factores.

2. Prueba de la reducción de la resazurina.

Representa una modificación de la prueba de la reductasa, en que se substituye el azul de

metileno por la resazurina, colorante derivado de la oxazina. Es más sensible que el azul de
metileno para detectar ligeros cambios en el potencial de óxido-reducción, por lo que permite
obtener resultados más rápidos.

La resazurina es una oxazona que da color azul a la leche. Por pérdida de O2 se reduce en dos
etapas: en la primera pasa por diferentes tonalidades de violeta hasta rojo-rosa, color éste
debido a la formación de resorufina. Esta etapa de reducción es irreversible. Si la pérdida de
O2 continúa, la reducción pasa a una segunda etapa reversible, en la cual la resorufina se
reduce a dihidroresorufina, compuesto incoloro que por oxidación puede pasar de nuevo a
resorufina.

Prueba:

Indicador: resazurina al 0,005% p/v en agua destilada estéril.

En un tubo esterilizado se mezclan 10 ml de la leche con 1 ml de la

solución colorante. Después de homogeneizar, se coloca la
mezcla durante un tiempo de incubación constante (10 min) a 37
°C y se compara el color resultante con una escala cuyos colores
tienen los siguientes valores comparativos:

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La cifra 6, color azul

corresponde a leche normal,
calidad excelente; la cifra 0,
color blanco, corresponde a
leche de muy mala calidad.

Clasificación de la leche según las pruebas de TRAM y Resazurina:

Calificación TRAM Resazurina (color)

muy buena 5 horas o más azul celeste

buena 2 a 5 horas violeta-azulado

suficiente 30' a 2 horas violeta rojizo

insuficiente 30' rojo-rosa

mala 30' incoloro

Notas.

Tanto en la prueba del azul de metileno como en la de la resazurina, estos colorantes apenas
se reducen por la presencia de microorganismos psicrófilos y termorresistentes.

La refrigeración de la leche provoca tiempos de reducción de los colorantes más prolongados.

Se han introducido por ello modificaciones de estos métodos para que se adapten al examen
microbiológico de la leche refrigerada, como someter las muestras de leche a una incubación
previa durante 15 – 20 h a 12 – 15 °C y a continuación realizar las pruebas.

En general se ha observado que esta pre-incubación intensifica la rigurosidad de las pruebas,

sobre todo para las leches que tienen una microbiota pricrotrofa importante. Los tiempos de
reducción del azul de metileno se reparten entre los 15 min y las 7 h, y la concordancia con los
recuentos totales de bacterias es muy satisfactoria. Sólo las leches de muy buena calidad
(menos de 100.000 bacterias/ml) reducen el azul de metileno es 6 o más horas.

Prueba del alcohol (reacción de estabilidad proteica)

La leche fresca tiene una acidez de 0,12 a 0,18% en ácido láctico y un pH de 6,5 – 6,7. Valores
superiores de acidez, con la consiguiente disminución del pH, se debe generalmente a
descomposición bacteriana propia de leches de baja calidad. Esta condición puede

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demostrarse mezclando la leche con igual volumen de etanol de 68°, ya que el alcohol a esa
concentración produce floculación o coagulación del producto cuando la acidez es igual o
superior a 0,19 – 0,21%.

En la leche fresca, la caseína se encuentra en forma de caseinato cálcico formando un coloide

que le da el aspecto blanco y turbio a la leche. Cuanto mayor sea la acidez de la leche, mayor
será la fracción de caseína que se encuentra en forma libre y soluble. El alcohol actúa
desnaturalizando y deshidratando la caseína de la leche, que coagula.

Normalmente una leche positiva a la prueba del alcohol tiene mal olor y sabor ácido, ácido
mayor al 0,19%, se corta a la ebullición y contiene millones de bacterias.

Una prueba de alcohol positiva indica también poca estabilidad de la leche al calor, lo cual es
muy importante si el producto va a ser pasteurizado o esterilizado.

Procedimiento:

• En un tubo colocar un volumen dado de la muestra

homogénea (p. ej. 2 ml) y añadir igual volumen de etanol
68° (m/m). Tapar el tubo.
• Mezclar suavemente los líquidos invirtiendo el tubo 2 ó 3
veces, sin agitación.
• Observar a contraluz e inclinando el tubo en varias
direcciones si ha ocurrido floculación o coagulación de la
mezcla. Anotar las observaciones.

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GALERÍAS DE IDENTIFICACIÓN BIOQUÍMICA.

Sistema de identificación ENTEROSYSTEM 18R.

La batería de pruebas ENTEROSYSTEM 18R es un sistema de identificación rápida para
enterobacterias y otras bacterias Gram (-). Básicamente consta de 18 test bioquímicos
estandarizados y miniaturizados y una base de datos.
Este sistema presenta las ventajas de ser rápido, eficaz y de permitir realizar numerosas
pruebas a la vez. Cada tira de ENTEROSYSTEM 18R contiene 18 microtubos o pocillos con
distintos sustratos deshidratados. En cada pocillo se realiza una prueba bioquímica distinta.

Los microtubos se inoculan con una suspensión de microorganismos, en agua o solución

salina, que rehidrata los medios. Las tiras se incuban a 37°C y por efecto del metabolismo
bacteriano se van a producir cambios de color espontáneos o bien al añadir reactivos.

La lectura de las reacciones se hace mediante comparación con una tabla de lectura donde
se indica si los microorganismos deben considerarse positivos o negativos para cada reacción según
el color aparecido.

Las pruebas de que consta la galeria son las siguientes:

ONPG: presencia de ß-galactosidasa. El sustrato utilizado es o-nitrofenil-ß-D-galactósido.
LDC: presencia de lisina decarboxilasa. Se utiliza lisina como sustrato.
ODC: presencia de ornitina decarboxilasa utilizando como sustrato ornitina.
ADC: producción de arginina descarboxilasa. Como sustrato se utiliza arginina.
PD: producción de ácido cetónico fenilpirúvico utilizando como sustrato fenilalanina. El aminoácido
aromático fenilalanina sufre una desaminación oxidativa catalizada por la fenilalanina desaminasa.
CIT: utilización de citrato.
UR: presencia de ureasa. El sustrato es urea.
H2S: producción de sulfuro de dihidrógeno utilizando como sustrato tiosulfato de sodio.
MAL: fermentación/oxidación de malonato.
VP: prueba de Voges-Proskauer; utilizando como sustrato piruvato sódico se analiza la
producción de acetoína.
IND: degradación de triptófano hasta indol.
GLU: fermentación/oxidación de glucosa.
MAN: fermentación/oxidación de manitol.
INO: fermentación/oxidación de inositol.
SOR: fermentación/oxidación de sorbitol.
SAC: fermentación/oxidación de sacarosa.
ARA: fermentación/oxidación de arabinosa.
RAF: fermentación/oxidación de rafinosa.

En la siguiente tabla se indican las diferentes pruebas bioquímicas que se realizan en el test de
identificación de enterobacterias Enterosystem 18R así como el color que aparecerá si el resultado
de la prueba es positivo:

Prueba Reacción / Enzimas Negativo Positivo

ONPG Beta-galactosidasa sin color amarillo
LDC Lisina descarboxilasa amarillo-naranja rojo
ODC Ornitina descarboxilasa amarillo rojo o naranja
ADC Arginina descarboxilasa amarillo-naranja rojo
PD Ácido fenilpirúvico amarillo negro-marrón

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 Técnicas en Microbiología

CIT Utilización del citrato verde claro azul oscuro o verde

UR Ureasa Amarillo-naranja rojo o rosa
H2S Producción de SH2 amarillo precipitado negro
MAL Fermentación/oxidación de malonato azul o verde amarillo
VP Producción de acetoína sin color rosa-rojo
IND Producción de indol amarillo rojo
GLU Fermentación/oxidación de glucosa azul o verde amarillo
MAN Fermentación/oxidación de manitol azul o verde amarillo
INO Fermentación/oxidación de inositol azul o verde amarillo
SOR Fermentación/oxidación de sorbitol azul o verde amarillo
SAC Fermentación/oxidación de sacarosa azul o verde amarillo
ARA Fermentación/oxidación de arabinosa azul o verde amarillo
RAF Fermentación/oxidación de rafinosa azul o verde amarillo

Procedimiento
1.Preparación del inóculo. Preparar un cultivo puro del microorganismo a identificar en al menos 4 ml
de caldo genérico. Alternativamente, tomar una colonia bien aislada y resuspender homogéneamen-
te en 5 ml de solución fisiológica estéril.
2. Inoculación de los pocillos. Transferir 0,2 ml de la suspensión bacteriana a cada pocillo.
3. Añadir dos gotas de parafina o aceite de vaselina estéril a los pocillos LDC (2), ODC (3), ADC (4),
URE (7) y H2S (8), para obtener anaerobiosis.
4. Incubar a 37 °C durante 24 h.
5. Después de la incubación, añadir los siguientes reactivos en los pocillos VP (10) e IND (11):
VP: Añadir dos gotas de α-naftol 6% y una gota de KOH 40 % y esperar 15 – 20 minutos.
Positivo= color rojo o rosa fuerte.
IND: Añadir dos gotas de reactivo de Kovacs.
Positivo= aparece un anillo rojo en los dos primeros minutos de la reacción.

Interpretación de los resultados

La lectura de los resultados se lleva a cabo por comparación de los colores de cada pocillo con los
de la tabla de lectura.

Figura 1. Tabla de lectura del sistema de identificación Enterosystem 18R.

Identificación
Del conjunto de reacciones se obtiene un perfil numérico. Los pocillos están separados en grupos
de tripletes. En total hay 6 tripletes.

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 Técnicas en Microbiología

A cada pocillo se le da el valor 0, 1, 2 ó 4 según corresponda:

• Si la reacción es negativa: "0",
• Si la reacción es positiva: "1" si es el primer pocillo de un triplete, "2" si es el
segundo, "4" si es el tercero.
Se suman los valores de cada triplete. Con las sumas de los seis tripletes se obtiene un código de 6
cifras.
Con este código se busca en la tabla de identificación la especie de que se trata.

Ejemplo de identificación de una enterobacteria con el sistema Enterosystem 18R:

FECHA MUESTRA

GRUPO 1 GRUPO 2 GRUPO 3 GRUPO 4 GRUPO 5 GRUPO 6

Test 1-ONPG 2-LDC 3-ODC 4-ADC 5-PD 6-CIT 7-UR 8-H2S 9-MAL 10-VP 11-IND 12-GLU 13-MAN 14-INO 15-SOR 16-SAC 17-ARA 18-RAF

Positividad del
1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4
código
Resultados + + + - - - - - - - + + + - + - + -
Suma de códigos 7 0 0 6 5 2
CODIGO NUMÉRICO: 700652 IDENTIFICACION: Escherichia coli

Completa el resultado para tu muestra problema:

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 Técnicas en Microbiología

CONTROL MICROBIOLÓGICO
DE SUPERFICIES
El control microbiológico de superficie nos proporciona información sobre la cantidad de
microorganismos presentes sobre una superficie. Esta evaluación generalmente se hace utilizando
placas de contacto (RODAC).

Las placas de contacto o RODAC (Replicate Organism Direct Agar

Contact) son placas de 55-60 mm de diámetro llenas con medio
de cultivo hasta obtener una superficie convexa, que sobresale
del borde de la placa. Estas placas pueden preparase en el
laboratorio o adquirirse comercialmente ya preparadas.

Generalmente se utilizan para determinar la calidad

microbiológica de superficies planas. Para tomar la muestra
se abre la placa y se presiona sobre la superficie a ensayar,
sin deslizarla. Se tapa la placa y se incuba bajo las
condiciones adecuadas. Según el grupo de microorganismos
a analizar, varía el medio de cultivo utilizado y las
condiciones de incubación.

Después de la incubación, se cuenta el número de colonias y teniendo en cuenta el área de la placa,

se calcula el número de ufc por 100 cm2.

NOTA: Es necesario desinfectar la superficie evaluada luego de tomar la muestra, ya que podrían
quedar restos del medio de cultivo que favorecen el crecimiento de los microorganismos.

Para la práctica se proporcionarán placas de contacto para el recuento de microorganismos

aerobios totales (con medio TSA) y para la investigación de enterobacterias (con medio VRBG).

1. Seleccionar para el muestreo una sección de la mesa, del suelo, equipo, pared, etc. que
tenga una superficie mínima mayor a la de la placa Rodac.
2. Identificar la placa con los datos necesarios.
3. Retirar la tapa de la placa RODAC y presionar suavemente la superficie del agar sobre el
área de muestreo elegida.
4. Tapar la placa e incubar durante 48 - 36 h a 32 ± 1 °C (investigación de mesófilos totales) o
48h a 37 ± 0,5 °C (enterobacterias).
5. Limpiar el área muestreada, para eliminar los residuos de agar.
6. Recontar las colonias y calcular el número de ufc por 100 cm2 de superficie (la superficie de
las placas Rodac utilizadas es de 25 cm2).

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 Técnicas en Microbiología

Nivel de Higiene (fuente: hoja técnica Contact slide,

Liofilchem®) según el número de ufc de aerobios
mesófilos en la superficie analizada:

• Hasta 8 ufc/100 cm2: Muy bueno

• Hasta 32 ufc/100 cm2: Bueno
• Hasta 100 ufc/100 cm2: Satisfactorio
• Hasta 360 ufc/100 cm2: Dudoso
• >360 ufc/100 cm2: Insatisfactorio

Otro soporte ampliamente utilizado son los laminocultivos o contact slide.

Un laminocultivo consiste en una lámina plástica a la que se adhiere en cada una de sus caras un
medio de cultivo (agar bacteriológico) que permite el cultivo de microorganismos para su análisis
microbiológico. La lámina plástica se protege dentro de un tubo plástico transparente y se fija al
tapón (de forma fija o flexible dependiendo de su aplicación) y permite su manipulación sin tocar el
medio de cultivo con los dedos.

Los laminocultivos se presentan con agares iguales por ambas caras o bien diferentes, para análisis
de distintos patógenos o indicadores microbiológicos en tomas de muestra de superficies por
contacto.

Después de inocular el agar por contacto con la superficie de muestreo, se incuba para facilitar el
crecimiento bacteriano y su posterior lectura e interpretación.

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 Técnicas en Microbiología

Bibliografía
Beerens, H., Luquet, F.M. 1989. Guía Práctica para el Análisis Microbiológico de la
Leche y los Productos Lácteos. Editorial Acribia, Zaragoza. 162 págs.

Cátedra de Ciencia y Tecnología de la Leche. 2003. Introducción al Control de Calidad

de la Leche Cruda. Guía Práctica. Varios autores. Dpto. de Producción e Industria
Animal. Facultad de Ciencias Veterinarias. Universidad de Zulia. Maracaibo. 24 págs.
Recurso disponible en internet.

Pascual Anderson, M.R., Calderón y Pascual, V. 1999. Microbiología Alimentaria.

Metodología Analítica para Alimentos y Bebidas. Ed. Díaz de Santos. Madrid. 464 págs.

Universidad de Salamanca. 2004. Microbiología de los Alimentos. Departamento de

Microbiología y Genética. Laboratorio de Tecnología Educativa.

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