S1.
Descripción detallada de los métodos
S1.1. Método de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)
La determinación por HPLC de la concentración de L-Asp de todas las muestras hidrolizadas
se realizó según el protocolo previo establecido por Nath et al. [1] El sistema HPLC consistía
en un controlador del sistema SCL-10AVP de Shimadzu (Kyoto, Japón), una bomba LC-
10ATVP de Shimadzu, un autoinyector Shimadzu SIL-10AF y un detector de fluorescencia
Shimadzu RF-10AXL configurado para monitorear 450 nm (350 nm de excitación). La fase
móvil se inyectó a un caudal constante, 1 mL min-1 en la columna de fase inversa (columna
Phenomenex Jupiter C18, 150 mm x 4,6 mm, partículas de 5 μm y tamaño de poro de 300
Å) que se mantiene a 35 ° C. El tiempo de ejecución total se estableció en 12 min. La fase
móvil estaba compuesta por 10% (v / v) de metanol (grado HPLC), 10% (v / v) de acetonitrilo
(grado HPLC) y 5% (v / v) de tampón de propionato de propionato de ortofosfato de
hidrógeno dipotásico stock pH 6.0. Se preparó una solución madre tampón de propionato
de hidrógeno ortofosfato dicotásico añadiendo 1,75% (v / v) de ácido propiónico en una
solución 196 mM de hidrógeno ortofosfato dipotásico. El pH del tampón se equilibró luego
a 6,0 mediante la adición de ácido propiónico. Se prepararon soluciones de OPA para cada
medición mediante la adición de 54 mg de reactivo de OPA y 40 μL de mercaptoetanol a 10
mL de tetraborato de sodio 0,1 M. Se añadió una alícuota de 20 μL de cada muestra a 100
μL de solución de OPA, se mezcló rápidamente y luego se inyectaron 5 μL de muestra
inmediatamente en el sistema de HPLC. Las curvas de calibración se establecieron
preparando estándares de LAsp y L-Asn con una concentración que varió de 5 a 65 μg mL-
1 y los tiempos de retención correspondientes de 2.7 y 4.4 min, respectivamente. Los
estándares se derivatizaron con solución de OPA y se inyectaron en el sistema de HPLC
como se mencionó anteriormente para las muestras hidrolizadas. Una unidad de actividad
de ASNasa (U) se definió como μmol de L-Asp producido por minuto de acuerdo con el área
del pico a los 2,7 min (como se muestra en la Fig. S2) y la concentración de L-Asp
correspondiente dividida por el tiempo de reacción de ASNasa (10 min) :
S1.2. Método de Nessler
El método de cuantificación de Nessler fue establecido por Shifrin et al. y se utilizó un
protocolo de Sigma-Aldrich [2]. El método de Nessler determina la concentración de
amonio liberada después de la conversión de L-Asn en L-Asp por reacción con el reactivo
de Nessler, tetraiodomercurato dipotásico (II), como se muestra en la Fig. S1 (b). Para cada
muestra, después de la reacción de hidrólisis de ASNasa, se diluyeron 100 μL de muestra
reaccionada en 2,15 mL de agua desionizada y se añadieron 250 μL de reactivo de Nessler
a la solución diluida. A continuación, se determinó la concentración de NH4 + de cada
solución mediante espectroscopía de absorción (λmax = 436 nm) usando un lector de placas
(lector de placas multimodo EnSpire, PerkinElmer Inc., Waltham, MA). La curva de
calibración se preparó mediante la reacción del reactivo de Nessler con múltiples diluciones
de solución madre de sulfato de amonio ((NH4) 2SO4) (6 mM), correspondiente al siguiente
rango de concentración: 0.05 a 0.87 μmol mL-1 NH4 +. Una unidad de actividad ASNasa (U)
corresponde a 1 μmol de NH4 + producido por minuto a pH 8,6 y 37 ° C.
S1.3. Método del ß-hidroxamato del ácido L-aspártico (AHA)
El método colorimétrico del ß-hidroxamato del ácido L-aspártico (AHA) utilizado para la
determinación de la actividad ASNasa se adaptó del protocolo desarrollado por Drainas et
al. [3] Para este protocolo, se agregaron 50 μL de ASNasa diluida a tubos de ensayo que
contenían 500 μL de tampón Tris-HCl (50 mM) pH 8,6, 50 μL de solución L-Asn (189 mM).
Además, se agregaron 100 μL de hidroxilamina (a 1 M) y 300 μL de agua desionizada. Los
tubos de ensayo se mantuvieron a 37 ° C en un baño ultratermostático (Ethik Technology,
SP, Brasil), y después de 10 min se inactivó la reacción mediante la adición de una solución
que contenía 5,0% (p / p) FeCl3, 2,5% (p / v) TCA y HCl 0,33 M [como se detalla en la Fig. S1
(c)]. La reacción entre el AHA y el FeCl3 produce una coloración marrón que se puede
cuantificar por absorbancia utilizando un lector de placas (λmax = 500 nm). La curva de
calibración se realizó mediante múltiples diluciones de una solución madre de AHA 5 mM y
la adición de cantidades apropiadas de solución de FeCl3 / TCA / HCl, que van desde 0.01 a
3 μmol de AHA férrico mL-1. Una unidad de actividad ASNasa (U) corresponde a 1 μmol de
AHA producido por minuto a pH 8,6 y 37 ° C por mg de ASNasa.
S1.4. Método de Indooxina
La cuantificación de la actividad ASNasa por el método Indooxine se midió de acuerdo con
Lanvers et al. protocolo [4], en el que se diluyeron 20 μL de solución de ASNasa en tampón
Tris 15 mM a pH 7,3 con 180 μL de solución de ß-hidroxamato (AHA) de ácido L-aspártico
(AHA) 10 mM en tampón Tris 15 mM a pH 7,3 y se complementó con 0,015 % (p / v) de
albúmina de suero bovino (BSA). La muestra se incubó a 37 ° C durante 10 min y la reacción
se detuvo mediante la adición de 250 μL de TCA al 24,5% (p / v). Los precipitados de
reacción se eliminaron mediante 5 min de centrifugación (3050 x g). Se diluyeron 10 μL del
sobrenadante con 40 μL de agua desionizada y se agregaron a 200 μL de una solución de 8-
hidroxiquinolina [relación de volumen 1: 3 de 2% (p / v) de 8-hidroxiquinolina en etanol al
98% y Na2CO3 1 M ] luego se calentó a 95 ° C durante 1 min y se enfrió a temperatura
ambiente [como se muestra en la Fig. S1 (d)]. La absorbancia de las soluciones, que
contienen la indooxina producida, se midió usando un lector de placas (λmax = 710 nm). La
curva de calibración se realizó utilizando una solución madre verde de indooxina obtenida
a 710 nm. Una unidad de actividad ASNasa (U) corresponde a 1 μmol de indooxina
producida por minuto a pH 7,3 y 37 ° C.
La Tabla S3 resume estos datos como una serie de valores de actividad ASNasa informados
previamente y los correspondientes valores estimados de HPLC. Para proporcionar una comparación
más confiable, los datos seleccionados toman en consideración el tiempo de reacción de ASNasa de
10 min, un límite de concentración de ASNasa de hasta 2 mg mL-1 y concentraciones de sustrato
similares (189 mM de L-Asn o 10 mM de AHA). De la Tabla S3, los métodos de Nessler y AHA se
utilizan para cuantificar ASNasa de caldo fermentado por un microorganismo, mientras que el
método de indooxina se utiliza exclusivamente para la determinación de ASNasa en suero. Los
métodos que utilizan diferentes sustratos para la cuantificación de ASNasa, como AHA e indooxina,
sufren menos interferencia del NH3 presente en el medio ya que no cuantifica esta molécula. Sin
embargo, el método de Nessler está muy influenciado por el medio fermentado, ya que después del
crecimiento del microorganismo, se produce la liberación de NH3 como subproducto del
metabolismo de las fuentes de nitrógeno. Grandes cantidades de NH3 afectan el desarrollo del color
del reactivo de Nessler, dando lugar a una solución turbia [18]. Después de la normalización, según
las ecuaciones anteriores (Fig. 2 y nota al pie del ESM de la Tabla S3), algunos valores discrepantes
se acercaron, pero esta condición no se aplica a todos los valores informados (Tabla S3). A modo de
ejemplo, el valor obtenido por el método AHA [13] se volvió mayor que el obtenido por el método
Nessler [8], por ejemplo, 7.1 U mL-1 por AHA y 20.9 U mL-1 por Nessler, cuando se estiman sus
actividades estos los valores se convierten en 21,2 U mL-1 y 17,9 U mL-1, respectivamente. Además,
en el caso del método de la indooxina el comportamiento es similar al del método AHA, es decir, el
valor estimado (150,8 - 754,1 U mL-1) es mayor que el valor reportado (100 - 500 U mL-1). [16] Era
ampliamente conocido que las actividades in vitro a menudo no representan condiciones in vivo,
exhibiendo valores de actividad discrepantes. [19, 20] Aunque, los resultados in vitro obtenidos por
los métodos de AHA y Nessler pueden usarse como una estimación aproximada si La enzima
producida por el caldo fermentado tiene actividad suficiente para ser utilizada en tratamientos in
vitro, se debe tener en cuenta que la determinación de la actividad ASNasa, luego de la inyección en
el torrente sanguíneo puede sufrir interferencia de otras enzimas y moléculas presentes en sangre,
cambiando la correspondiente actividad biocatalítica. Sin embargo, incluso para comparar
únicamente las actividades de ASNasa in vitro, no existe un método universal y estándar para la
determinación de la actividad enzimática. [21-23] En consecuencia, la falta de estandarización
conduce a datos enzimáticos incomparables [22], y aunque se ha propuesto algún desarrollo de
plataformas para la estandarización y unificación de datos enzimáticos, estos aún no se aplican a
todos los informes. [23, 24]
