UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMANN

FACULTAD DE CIENCIAS
BIOLOGÍA Y MICROBIOLOGÍA
ECOLOGÍA MICROBIANA

Practica N° 6
Determinación de organismos coliformes en muestras de
agua mediante la Técnica de filtración por membrana

Mg. Susan Abigail Fernandez Gonzales

 GENERALIDADES DEL GRUPO COLIFORMES

Coliformes Totales

Son un grupo de microorganismos que comprende varios géneros de la familia enterobacteriaceae. Se

encuentran ampliamente difundidos en la naturaleza, agua y suelo, además, son habitantes normales
del tracto intestinal del hombre y animales de sangre caliente.
Se caracterizan por ser bacilos Gram. negativos, aerobios o anaerobios facultativos, son oxidasa
negativa, no formadores de esporas y son capaces de fermentar la lactosa con producción de acido y
gas a 35ºC +/- 2°C en un tiempo máximo de 48 horas. El grupo de los coliformes son indicadores del
grado de contaminación, y por tanto, de la calidad sanitaria
 Coliformes fecales

Los coliformes fecales, La Escherichia coli se La presencia de Escherichia

también denominados caracteriza por ser una coli en muestras de agua
coliformes termotolerantes, bacteria Gram. negativa, potable, indica la existencia
se caracterizan por soportar capaz de fermentar la de fallas en la eficacia de
temperaturas hasta 45ºC; lactosa a una temperatura tratamiento de aguas, en la
comprende un grupo muy entre 44ºC y 44.5ºC, es indol integridad del sistema de
reducido de positivo, y tiene un origen distribución, y por tanto
microorganismos, entre los específicamente fecal, pues evidencia de contaminación
que se destaca Escherichia está siempre presente en de diferentes orígenes:
coli siendo el más grandes cantidades en las suelo, superficies de agua
reconocido representante de heces de los seres vivos de dulce y tracto digestivo.
contaminación de alimentos sangre caliente y rara vez se
por origen fecal, por lo tanto encuentra en agua o suelo
es el principal indicador de que no haya sufrido algún
higiene en los alimentos tipo de contaminación fecal.
 ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE AGUAS

En el análisis microbiológico de las aguas crudas no se

buscan directamente las bacterias o virus patógenos,
sino algunas bacterias indicadoras de contaminación
por heces fecales y que sin ser patógenas residen en el
intestino del hombre y de los animales, las bacterias
coliformes.
Existen diversas técnicas de análisis microbiológico que
permiten detectar la presencia de ciertos
microorganismos indicadores de contaminación tales
como el método de filtración por membrana, la técnica
del NMP o fermentación en tubos múltiples, los cuales
son utilizados como control de calidad en acueductos o
industrias donde se requiere procesar un gran número
de muestras
 RECOLECCIÓN Y RECEPCIÓN DE MUESTRAS

Para la recolección de muestras de aguas se deben

utilizar frascos de vidrio de fácil esterilización los
cuales son suministrados por el laboratorio que realiza
el análisis, con capacidad de 300 mL. El frasco estéril
debe ser llenado hasta las tres cuartas partes de su
capacidad y tapado inmediatamente. Si la muestra es
agua tratada con cloro, el frasco debe contener 0.5 mL
de tiosulfato de sodio al 10%. La solución de tiosulfato
de sodio actúa como inhibidor del cloro para evitar la
muerte de los microorganismos presentes en la
muestra.
La muestra debe llevarse lo más rápidamente posible
al laboratorio (no demorar más de 4 horas). Si es
necesario demorarla más tiempo se debe refrigerar
desde el momento de la toma (no más de 20 horas).
 CONDICIONES GENERALES PARA LA RECOLECCIÓN DE MUESTRAS:

 Disponer de los recipientes y demás materiales apropiados según el estudio quese vaya
a realizar.
 Cerciorarse que el frasco tenga el aditivo apropiado (Tiosulfato de sodio)
 Asegurarse que la composición de la muestra tomada, refleje fielmente la deltotal del
suministro o fuente de agua, es decir, que sea representativa del sistema.
 Utilizar técnicas de recolección que no afecten por descuido u omisiones lacalidad
del agua recolectada, con respecto a su fuente original.
 Cuando se vaya a tomar muestra para análisis microbiológico no enjuagar elfrasco
con la muestra.
 Para análisis físico-químico el frasco no debe tener aditivos y debe enjuagarse el frasco
con la misma muestra.
 Identificar la muestra.
 Consignar inmediatamente después de la toma todos los datos importantes que permitan
identificar correctamente la muestra:
 Lugar exacto del muestreo
 Fecha y hora de toma
 Cloro residual (total o libre) encontrado en el momento del muestreo
 Otras condiciones especiales: si la muestra viene directamente de la red de distribución,
de un tanque subterráneo o elevado, pozo, etc.
 Si es agua de río, quebrada, laguna, estanque, etc, o motivo de la solicitud (Intoxicación,
control, etc.)
 Anotar las condiciones en el momento de tomar la muestra (temperatura del ambiente,
temperatura del agua, viento, lluvia, etc.).
A. TOMA DE MUESTRAS EN GRIFOS O LLAVES

Se debe limpiar cuidadosamente el grifo o tubo.

La abertura de salida y sus inmediaciones deben
flamearse con llama de alcohol. Se deben escoger
grifos que no tengan escapes por el vastazo,
debido a que el agua que sale por allí se
contamina e invalida la muestra. Se deja fluir el
agua lo más intensamente posible para quitar las
impurezas adheridas. Posteriormente se debe
regular el chorro de agua al espesor de un lápiz.
Se llena rápidamente el frasco hasta la mitad más
o menos, si es para examen microbiológico
evitando salpicaduras y totalmente lleno si es para
análisis físico-químico.
En pozos con bomba debe bombearse lenta y
uniformemente durante 10 minutos antes de
tomar la muestra.
B. TOMA DE MUESTRAS EN POZOS CARENTES DE BOMBA

Preparar el frasco de la siguiente manera:

Fijar un alambre al cuello del frasco. Envolver el conjunto en papel de aluminio y esterilizar. Al
tomar la muestra no tocar el exterior del frasco. No tomar de la parte sobrenadante del pozo.
C. TOMA DE MUESTRAS EN RÍOS, LAGOS, QUEBRADAS, REPRESAS

Se debe estudiar la situación de acuerdo con los recursos del laboratorio, objeto del examen, fuente de
contaminación, etc., excepto en casos especiales, no tomar muestra superficialmente en sitios donde
permanezca estancada ni donde se presenten turbulencias por agitación accidental.
Se realiza el procedimiento de la siguiente manera:

 Colocarse frente a la dirección de las corrientes de agua.

 Sumergir el frasco debajo de la superficie del agua unos 15 a 20 cm, realizando un semicírculo en la
dirección de la corriente. Así se evita contaminar el agua por las manos del operario. Si no hay
corriente de agua, crearla por el movimiento del frasco.
 Evitar recoger material flotante. Este se puede tomar como muestra especial.
 Evitar tomar material del fondo.
D. TRANSPORTE Y ALMACENAMIENTO DE LAS MUESTRAS

Si las muestras no van a ser analizadas

antes de una hora de haber sido
tomadas, deben refrigerarse durante el
transporte a 4ºC, y deben estar completa
e inconfundiblemente identificadas.
No debe de transcurrir más de 6 horas
entre la toma de muestra y el análisis y
máximo 2 horas en el laboratorio. Si esto
no se puede cumplir, las muestras deben
ser conservadas a temperatura inferior a
4ºC sin ser congeladas.
 MÉTODO DE FILTRACIÓN POR MEMBRANA

Para la detección de coliformes totales y coliformes

fecales (E. coli) se utiliza el método de filtración por
membrana, el cual es un método altamente
reproducible, puede usarse para analizar volúmenes de
muestra relativamente grandes y se obtienen
resultados en menor tiempo que con el NMP. Sin
embargo, no puede aplicarse a cualquier tipo de
muestra y tiene sus limitaciones. A los efectos de la
filtración por membrana debe replantearse la definición
de coliformes: bastones Gram. (-), aerobios o
anaerobios facultativos, que dan colonias oscuras con
brillo metálico en medio Endo, luego de 24 horas de
incubación a 35ºC +/- 2°C. La determinación de
coliformes fecales por filtración puede hacerse a partir
de las colonias desarrolladas en Endo o directamente
incubando la membrana en medio m-FC e incubando a
44,5ºC.
 FUNDAMENTO DEL MÉTODO DE FILTRACIÓN POR MEMBRANA

La muestra de agua se hace pasar mediante vacío por

un filtro de celulosa de 0.45 micras de tamaño de poro,
para que queden retenidas en él, las bacterias de tipo
coniforme y las mesofílicas. El filtro es colocado en un
medio de cultivo especifico para lo que se desea
determinar en la muestra (coliformes totales,
coliformes fecales y microorganismos mesofílicos),
incubando a 35ºC +/- 2ºC durante 18 a 20 horas.
CARACTERÍSTICAS DEL FILTRO DE MEMBRANA

Se debe utilizar filtro de membrana con un diámetro de poro que permita una completa retención de
las bacterias coliformes. Se debe tener en cuenta que estos filtros estén libres de químicos susceptibles
de inhibir el crecimiento y desarrollo bacteriano, que posean una velocidad de filtración satisfactoria.

VENTAJAS Y DESVENTAJAS DEL MÉTODO DE FILTRACIÓN POR MEMBRANA

El método de filtración por membrana es un método ágil y poco dispendioso. La lectura de resultados
se da en un menor tiempo (24 horas) a comparación del método NMP, además se puede utilizar en
pruebas de campo, empleando accesorios adecuados. El análisis se dificulta en muestras de aguas muy
turbias o con abundante carga bacteriana. Este inconveniente es posible remediarlo, haciendo
diluciones de la muestra o haciendo inóculos muy pequeños de acuerdo con el tipo de muestra a
analizar.
 USO DEL EQUIPO DE FILTRACIÓN POR MEMBRANA

Colocar el Con pinzas estériles

Colocar el embudo estéril colocar un filtro de
porta filtros sobre el celulosa en cada porta
estéril sobre receptáculo y filtros, con la
la base del fijarlo con las cuadricula hacia arriba,
manifold pinzas que trae sobre la parte porosa
el equipo del receptáculo

Colocar el Llenar el embudo

embudo y con 80 a 100 ml
adicionar la de agua destilada
muestra a estéril
analizar
 Cerrar las llaves
Dejar filtrar
del manifold y
aplicando
adicionar 20 – 30
vacío
mL de alcohol al
70%

Pasar el mechero por cada

Abrir las llaves
filtro para encender el alcohol,
del manifold y
dejar el alcohol encendido
dejar filtrar
durante 3 minutos
Adicionar
nuevamente 100 mL Cerrar las llaves
de agua destilada del manifold y
estéril y dejar filtrar retirar el embudo

Cuando finalice el
filtrado de cada una de
las muestras cerrar las
llaves del manifold,
retirar el embudo,
tomar el filtro con
pinzas estériles y
colocarlo sobre la
superficie del medio
Endo y m-FC
Incubar las cajas Realizar el
a la temperatura recuento de las
adecuada: Medio colonias
Endo: 37°C +/- características:
2°C Medio Endo:
Medio m-FC: colonias rojas
44.5°C en baño Medio m-FC:
maría colonias azules