PRÁCTICA # 01

RECONOCIMIENTO DE EQUIPOS Y MATERIAL DE LABORATORIO USADO EN

MICROBIOLOGÍA.

OBJETIVOS
 Reconocer y manejar el material de uso común en el laboratorio de microbiología.
 Tomar conciencia y aplicar las reglas de bioseguridad en el laboratorio de microbiología.
 Conocer las partes, funcionamiento y cuidados que se deben tener para el manejo correcto
de un microscopio óptico.
 Tomar conocimiento del cuidado, manejo y utilidad de un microscopio en el Laboratorio de
Microbiología.

INTRODUCCIÓN
Casi la totalidad de los organismos unicelulares son imperceptibles para el ojo humano, y para
observarlos es esencial el microscopio.

La palabra microscopio, deriva etimológicamente del griego mikros (pequeño) y skoopeo

(observación) y fue acuñado en 1624 por Jean Faber, literalmente significa observar lo pequeño. El
primero en observar a los microorganismos fue Robert Hooke, que observó hongos filamentosos a
principios del siglo XVII, posteriormente el microscopio fue perfeccionado por Antonie van
Leeuwenhoek que en 1667 fue capaz de observar protozoarios y bacterias.

Desde el punto de vista de la óptica, existen dos tipos de microscopio, un microscopio simple que
consta de un solo lente (una lupa, por ejemplo) y el microscopio compuesto que tiene más de uno
(como un microscopio). El uso de este dispositivo es indispensable en el Laboratorio de
Microbiología para el estudio de la morfología y estructura de los microorganismos, así como su
reacción a diferentes colorantes, lo cual, junto con otros criterios, permitirá su identificación, por lo
tanto, es importante conocer su adecuado manejo.

EL MICROSCOPIO
Los microscopios pertenecen a dos clases, el de luz (óptico) y el electrónico, según el principio en
el que se basa la amplificación.

El microscopio óptico, esencialmente está compuesto por un sistema óptico, compuesto por los
oculares, objetivos, espejo, el condensador y el diafragma, así como la fuente lumínica; un sistema
mecánico, el cual es el encargado de mover todas las piezas de la maquinaria y poder dirigir
adecuadamente la observación, consta de tubo porta lentes y cremallera, tornillos macro y
micrométrico, revolver, platina, condensador, brazo y pie

El microscopio electrónico, como su nombre lo indica, se basa en un haz de electrones (en lugar de
ondas luminosas) y un campo magnético para obtener la imagen amplificada. La microscopia
electrónica abarca dos tipos: a) microscopia electrónica de transmisión y b) microscopia electrónica
de barrido, esta última presenta la característica de dar una notable impresión tridimensional,
aunque su poder de resolución es menos que el obtenido al utilizar un microscopio electrónico de
transmisión.

También existen otros tipos de microscopios, como los de campo claro o luminoso, de campo
oscuro, luz ultravioleta, fluorescencia y contraste de fases.

Algo importante es el límite de resolución, que se

define como la capacidad que tiene el microscopio
para diferenciar entre dos objetos que se encuentran
cercanos. Cada microscopio tiene lentes objetivos
con diferentes aumentos que se nombran de la
siguiente forma: lupa (4X), seco débil (20X), seco
fuerte (40X) e inmersión (100X).

El aumento total que tiene un microscopio, se obtiene al multiplicar los aumentos que tiene el
ocular por los aumentos de los objetivos. Es importante mencionar que para hacer observaciones
con el objetivo de 100X, se debe utilizar aceite de inmersión.

RECOMENDACIONES PARA LA ADECUADA CONSERVACIÓN DEL MICROSCOPIO

 No tocar nunca los lentes: Si se ensucian, limpiarlas suavemente con papel de seda especial
para lentes.
 No dejar el porta-objetos sobre la platina, cuando no se está usando el microscopio.
 Limpiar siempre el objetivo de inmersión después de usarlo.
 Mantener seca y limpia la platina del microscopio, si hay un derrame, secarla con un paño.
 No inclinar el microscopio cuando se está trabajando con aceite de inmersión. Este puede caer
a la platina de donde es difícil limpiarlo, o puede gotear al condensador y allí solidificarse.
 Cuando no esté en uso el microscopio, hay que apagarlo, cubrirlo con la funda y guardarlo.
 No forzarlo nunca. Todas las conexiones deben funcionar suave y fácilmente. Si algo no
funciona bien, no intentar arreglarlo uno mismo. Llamar inmediatamente al instructor.
 Las lentes objetivo no deben tocar nunca el porta-objetos.
 No intercambiar los objetivos o los oculares del microscopio distintos, y bajo ninguna
circunstancia, separar las lentes frontales de los objetivos.

Entre los equipos y materiales más utilizados en el laboratorio de Microbiología, tenemos:

Aparatos
Son equipos que permiten la preparación y el desarrollo de microorganismos. Dentro de esta
categoría tenemos a los siguientes: Balanza Analítica, Balanza, Autoclave, Vortex, PH-metro,
Destilador, Cámara de Anaerobiosis, Incubadora, Horno, Nevera, Cuenta Colonias, Plancha de
calentamiento y Baño María
Utensilios de sostén.
Son utensilios que permiten sujetar algunas otras piezas de laboratorio. Dentro de esta categoría
tenemos a la Gradilla, Pinzas para crisol, Pinzas para tubo de ensayo.

Utensilios de uso específico.

Son utensilios que permiten realizar algunas operaciones específicas y sólo puede utilizarse para
ello. Dentro de esta categoría tenemos a los siguientes utensilios. Agitador de vidrio, Asa de
siembras, Tapones caucho, Pipetas automáticas, Jeringas, Cubetas, para tinción, Portaobjetos,
Cubreobjetos, Cajas de petri, Crisol, Embudo de polietileno, Espátula, Mechero bunsen, Mortero de
porcelana con pistilo o mano, Termómetro, Malla de asbesto y Escobillas

Utensilios volumétricos.
Son utensilios que permiten medir volúmenes de sustancias líquidas. En esta categoría tenemos a
los siguientes utensilios como el Balón aforado, Pipetas, Probeta.

Utensilios usados como recipientes.

Son utensilios que permiten contener sustancias. Dentro de esta categoría tenemos a: Frasco
gotero, Frascos reactivos, Vasos de precipitado, Matraces, Matraz Erlenmeyer, Frasco lavador,
Tubos de ensayo, Tubo de centrifuga, Frasco de rosca, Desecador

CUESTIONARIO
1. Menciona brevemente como funciona cada uno de los siguientes tipos de microscopio: de
campo claro, de campo oscuro, de contraste de fases, de luz ultravioleta, de fluorescencia y
electrónico.
2. ¿Cuál es la principal utilidad de cada uno de los microscopios antes mencionados?
3. Defina lo que es poder de resolución y discuta los factores que lo condicionan.
4. ¿Por qué es necesario el uso de aceite de inmersión cuando se realizan enfoques con el lente
objetivo de alto poder?
5. ¿Qué cuidados se deben tener en el uso y manejo del microscopio?
6. Entra a [Link] y practica el
funcionamiento de un microscopio con este microscopio virtual. Hacer un resumen del
procedimiento que se debe hacer para lograr una correcta observación.
 PRÁCTICA # 02
DESINFECCIÓN Y ESTERILIZACIÓN POR AGENTES FÍSICOS Y QUÍMICOS.

CONTROL DE MICROORGANISMOS POR AGENTES FÍSICOS Y/O PROCESOS FÍSICOS

ESTERILIZACIÓN POR CALOR

EL CALOR HÚMEDO
El vapor de agua es uno de los métodos más eficaces para destruir microorganismos y, a igual
temperatura, es mucho más eficaz que el calor seco. Hay varias formas de emplear el calor
húmedo.
 Agua a ebullición.  Vapor a presión  Pasteurización
 Vapor fluente  Tyndalización  Ultrapasteurización

CALOR SECO
En una atmósfera seca, totalmente exenta de humedad, las bacterias son resistentes hasta que
tiene lugar la oxidación de sus componentes, lo cual ocurre a temperaturas mucho más elevados
que la que se requiere para coagular las proteínas.
 Incineración y esterilización al rojo  Aire caliente
 Flameado

RADIACIÓN
Las radiaciones son letales para las células microbianas, así como para otros organismos.
 Radiaciones no ionizantes: Son rayos electromagnéticos de longitud de onda mayor que
la luz visible (UV, IR) y que en una gran proporción se absorben como calor.
 Radiaciones ionizantes: Estos pueden ser electromagnéticas o de partículas. Las primeras
son radiaciones de longitud de onda corta tales como los rayos X o los rayos Gamma y las
segundas están constituidas por electrones de alta energía, por ejemplo, los rayos catódicos.

FILTRACIÓN
 Filtros de tipo bujía  Filtros de membrana
 Filtros de porcelana  Filtros Seitz o discos filtrantes de
 Filtros de vidrio sintetirizado asbesto
DESECACIÓN
La desecación o secado de la célula microbiana y su ambiente disminuye en gran parte la actividad
metabólica o la detiene totalmente, y además se produce la muerte de algunas células. la
desecación varía dependiendo de algunos factores: la clase de microorganismos, el material donde
se deseca, el proceso de desecación, las condiciones físicas a las que se exponen los organismos
desecados, por ejemplo, luz, temperatura y humedad.

ESTERILIZACIÓN GASEOSA
El óxido de etileno es un gas que se difunde a través de los materiales porosos y penetra
fácilmente la mayoría de los plásticos.

CONTROLES DE ESTERILIZACIÓN
Existen dispositivos de distinta naturaleza que sirven como indicadores de la calidad de la
esterilización realizada. Los más simples son productos químicos que cambian de color a 121ºC.
Se comercializan dentro de sobres, o en la superficie de cintas.
Se utilizan también monitores biológicos, las esporas de Bacillus stearotermophilus, por ejemplo,
tienen una tolerancia conocida al calor húmedo. Se colocan tiras impregnadas con esporas en
lugares estratégicos en el interior de la autoclave. Cuando se abren los recipientes luego de ser
esterilizados, la tira asépticamente colocada en un caldo de cultivo, se incuban durante 24 a 48
horas. Si la esterilización fue eficiente no deberá haber desarrollo en estos cultivos.

LIMPIEZA GENERAL U ORDINARIA

Colocar el material en recipientes que contengan soluciones detergentes apropiadas, procurando
que el material quede totalmente sumergido; para eliminar materia orgánica, dejar actuar durante
24 horas, si el material tiene sales someterlo a un ligero calentamiento con HCl concentrado por
espacio de 30 minutos.

PROCEDIMIENTO
 Envolver con papel las cajas de Petri como lo indique el profesor, anotar en el papel el
número de equipo y la fecha de preparación.
 Poner en la boquilla de las pipetas un filtro de algodón, de tal manera que el aire pase
libremente a través de él, envolver con papel cada pipeta, marcando en la envoltura el volumen de
cada una de ellas.
 Tapar cada uno de los tubos y matraces con torundas de algodón; las torundas deben
prepararse a la medida de la boca del matraz o tubo, no deben deformarse, ni ser forzada su
entrada, ni de caerse al ser invertidos estos y deben llevar una cubierta de gasa para evitar que la
pelusa contamine al medio de cultivo.
 Colocar los tubos en un cesto de alambre o en un bote y cubrirlos con papel Kraft (esta
envoltura protege los algodones y evita que durante la esterilización estos se humedezcan.
 Los hisopos se preparan con aplicadores de madera y algodón, el cual debe ser enrollado
con fuerza y en suficiente cantidad, de tal manera que no se desprenda ni presenta asperezas.
 Todo el material debe ser identificado con su correspondiente etiqueta antes de ser
esterilizado.

RECOMENDACIONES GENERALES
 El material que se utiliza en los análisis microbiológicos debe ser exclusivo para este fin.
 Para el lavado ordinario usar soluciones detergentes alcalinas o neutras.
 Para tratamiento severo utilizar mezcla crómica, ácido nítrico caliente, ácido sulfúrico,
alcohol, hidróxido de potasio en alcohol o fosfato de sodio en solución acuosa.
 Clasificar y separar el material contaminado del no contaminado y colocarlo en los lugares
asignados para cada caso, en áreas físicas bien separadas.
 El material contaminado debe colocarse en recipientes adecuados para su esterilización y
lavado posterior.
 El agar proveniente de matraces, tubos, cajas, etcétera, una vez esterilizado debe
recolectarse en bolsas de plástico de alto punto de fusión para su eliminación posterior, no debe
eliminarse por el drenaje.
 Las pipetas contaminadas inmediatamente después de su uso deben colocarse en
recipientes que contengan soluciones germicidas, se les quita el algodón de la boquilla y se
procede a su esterilización.
 Los portaobjetos y cubreobjetos luego de lavados y secados deben colocarse en un vaso
con alcohol para desengrasarlos y posteriormente secarlos con papel seda o higiénico.

CUESTIONARIO
1. ¿En qué consiste la pasteurización, la ultrapasteurización y qué finalidad tiene?
2. ¿En qué principio se basa el funcionamiento de la autoclave?
3. ¿Qué método de esterilización es el más recomendado para el siguiente material:
 Un medio de cultivo termolábil
 Un medio de cultivo termoestable
 Material de vidrio
 Un medicamento termolábil cuya vía de administración es intravenosa
 Instrumental quirúrgico
 Material de curación contaminado
4. ¿Cuál es el fundamento de la esterilización por calor seco?
5. ¿Cuál es el fundamento de la esterilización por medio de radiaciones (UV, infrarroja,
radiaciones ionizantes)?

PRÁCTICA # 03
TÉCNICAS DE COLORACIÓN Y RECONOCIMIENTO MICROSCÓPICO DE FORMAS
BACTERIANAS

OBJETIVOS
 Conocer los diferentes tipos de tinciones y colorantes para realizar el análisis microscópico
de una muestra, observando la morfología microscópica del microorganismo y sus
afinidades tintoriales.
 Que el alumno aprenda las técnicas de preparación de frotis, fijación y tinción más utilizadas
en el estudio microscópico de cultivos microbianos. Que obtenga la información básica para
hacer la descripción inicial de los microorganismos.

INTRODUCCIÓN
En general, las bacterias y otros microorganismos son transparentes, lo que dificulta su estudio
cuando los exámenes se realizan en fresco. Por eso para distinguirlos del medio es necesario
hacer una coloración (tinciones simples), las cuales también sirven para contrastar o realzar
distintas características morfológicas o estructurales (tinciones diferenciales).

En muchas especies, las células hijas resultantes de un evento de división por fisión tienden a
dispersarse por separado el medio, debido a la actuación de fuerzas físicas (movimiento
browniano, cizallamiento, corrientes de convención, etc). Esto hace que al observar al microscopio
una población de estas bacterias veamos mayoritariamente células aisladas. La observación a
microscopio de las bacterias nos permite diferencias cuatro formas básicas que son:

Cocos: estas son células bacterias en

forma esférica que se pueden agrupar
individualmente, en parejas(diplococos),
formando racimos irregulares en varios
planos de división (estafilococos), formando
cadenas (estreptococos), dos planos
perpendiculares (tétradas cuatro células, en
un plano) o múltiplos tres planos
ortogonales (sarcinas paquetes pequeños).
 Bacilos: son células en forma de bastón alargados, que a su vez pueden tener varios aspectos:
cilíndricos, fusiformes, en forma de maza, etc. Atendiendo a los tipos de extremos, estos pueden
ser: redondeados (lo más frecuente), cuadrados, biselados, afilados y que pueden presentarse
individualmente, en parejas (diplobacilos), formando cadenetas (estreptobacilos), bacilos en
empalizada o en paquetes de cigarrillos (debido a giros de 180º), dos bacilos en ángulo (en forma
de letra V o L).

Espirilos: al igual que los bacilos tienen un eje más largo que otro, pero dicho eje no es recto, sino
que sigue una forma de espiral, con una o más de una vuelta de hélice y que generalmente no se
agrupan.

Vibrios: proyectada su imagen sobre el plano tienen forma de coma, pero en el espacio suelen
corresponder a una forman en espiral con menos de una vuelta de hélice.

TÉCNICAS PARA REALIZAR UNA PREPARACIÓN COLOREADA

Una preparación coloreada exige la sucesión de tres pasos: preparación del extendido, fijación y
coloración.

1.- Preparación del extendido

Debe utilizarse un portaobjetos limpio y desengrasado.

Si el cultivo proviene de un medio líquido, se transfiere con el asa una gota del mismo y se extiende
hasta formar una fina película que cubra el centro del portaobjetos.

Si el cultivo proviene de un medio sólido, se mezcla la muestra con una gota de agua sobre un
portaobjetos y se extiende la suspensión bacteriana hasta formar una fina película sobre el
portaobjetos sin tocar los bordes.

2.- Fijación
Este paso se efectúa para que los microorganismos queden adheridos al vidrio y no se desprendan
del portaobjetos con los lavados. Existen dos tipos de fijación: con calor (o método de Koch –
Flameado por 3 veces) y fijación química (inundar con alcohol metílico o formalina al 5 %, se deja
actuar 3 minutos y se lava con agua.

3.- Coloración
En este paso se hacen actuar sobre el preparado ya fijado las soluciones de colorantes de acuerdo
al método de tinción que se realice.
TIPOS DE TINCIONES

TINCIÓN SIMPLE
Se entiende por tinción (o coloración) simple al teñido de los microorganismos aplicando sólo una
solución colorante. Este tipo de tinciones pueden ser positivas o negativas.

TINCIÓN COMPUESTA (O DIFERENCIAL)

Aunque existen múltiples tipos de tinciones, aquí vamos a referirnos a los dos métodos de
coloración compuesta más comúnmente empleados en la práctica corriente del laboratorio de
microbiología: la tinción de Gram y la de Ziehl-Neelsen. Estas coloraciones permiten diferenciar las
bacterias incluso cuando tienen igual forma y tamaño, por esta razón es una “tinción diferencial”.

PROCEDIMIENTO

TINCIÓN DE GRAM
ETAPAS EN LA TINCIÓN DE GRAM
PASOS MÉTODO GRAM POSITIVA GRAM NEGATIVA
Cristal Violeta (luego de 30 seg. Las células se
Las células se tiñen de
Colorante básico se lava con agua el exceso de tiñen de color
color violeta.
colorante) violeta.
Las células
Lugol (pasado 1 min. se lava con Las células continúan
Mordiente continúan teñidas
agua el exceso de lugol) teñidas de color violeta.
de color violeta.
Alcohol de 95% o Alcohol- Se deshidratan las paredes
Aumenta la
acetona (durante aprox. 30 seg. celulares y las células
Decoloración porosidad y la
y luego lavar con agua para continúan teñidas de color
célula se decolora.
eliminar el resto de disolvente) violeta.
Fucsina o Safranina (luego de 30 Las células teñidas
Las células se
Contraste seg. se lava con agua el exceso permanecen de color
tiñen de rosa
de colorante) violeta
Observar al Colocar sobre el frotis una gota
Violeta Rosa
microscopio de aceite de inmersión.
 TINCIÓN DE ZIEHL- NEELSEN

ETAPAS EN LA TINCIÓN DE ZIEHL – NEELSEN

ÁCIDO
ÁCIDO
ALCOHOL
PASOS MÉTODO ALCOHOL
NO
RESISTENTE
RESISTENTE
Colorante básico Fucsina …. ….
Calentar la preparación hasta que
aparezcan humos blancos.
Calor Se tiñe de rosa Se tiñe de rosa
Lavar con abundante agua el exceso de
colorante

Alcohol – clorhidrico (aprox. 30 seg. y lavar

Decoloración Permanece rosaSe decolora
el resto de decolorante)

Azul de metileno (luego de 30 seg. se lava

Contraste Permanece rosaSe tiñe de azul
con agua el exceso de colorante)

Observar al Colocar sobre el frotis una gota de aceite

Rosa Azul
microscopio de inmersión.

CUESTIONARIO
1. Describa los dos tipos generales de fijación e indique ¿cuál emplearía para bacterias y cuál
para protozoos?
2. Dé tres ejemplos de colorantes básicos, ácidos y neutros
3. ¿Qué sustancias suelen emplearse como mordientes, dé tres ejemplos?
4. Indique el método usado para la tinción de flagelos
5. ¿Qué son los gránulos metacromáticos, que otro nombre reciben y que colorantes se usan
para su tinción?
6. ¿A qué se conoce como tinción negativa y por qué recibe ese nombre?
7. Indique como se realiza el método de tinta China para observar cápsulas.
8. Menciona dos funciones que tiene la pared celular en las bacterias.
9. Investiga las diferencias de la pared celular de las bacterias Gram positivas y Gram
negativas
10. Investigue 3 tipos de tinción para bacteriología, exceptuando la de Gram y Ziehl- Neelsen,
como se realizan y para que microorganismos son aplicables.