PREPARACIÓN DE EXTENDIDOS
Pedro Fernando Rodríguez Calero (1842520)
[Link]@[Link]
María Isabel Perlaza Franco (1842505)
[Link]@[Link]
Angie Natalia Pineda Osorio (1925556)
[Link]@[Link]
Andrea Velasco Ríos (2041132)
[Link]@[Link]
Laboratorio De Microbiología (745059M-01)
Ramírez Toro Cristina
Universidad del Valle
Escuela de Ingeniería de Alimentos
Cali
2021
2
Tabla Contenido
1. RESUMEN 3
2. INTRODUCCIÓN 4
3. MATERIALES Y MÉTODOS 6
4. RESULTADOS 7
5. DISCUSIÓN 10
6. CONCLUSIONES 13
7. ANEXOS 14
8. BIBLIOGRAFÍA 16
3
1. RESUMEN
La utilización de los colorantes en la microbiología es fundamental para la identificación
de los microorganismos mediante la determinación de su morfología. Así pues, en el
laboratorio se emplearon diferentes métodos de coloración de Gram para apreciar en cada
bacteria su reacción frente a las tinciones. Lo anterior se llevó a cabo mediante materiales
como; cristal violeta, lugol de Gram, alcohol acetona e instrumentos como el mechero y
el asa de siembra. La coloración de Gram se hizo sobre bacterias conocidas como
Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus y Pseudomona aeruginosa. Así
pues, el objetivo principal de esta práctica de laboratorio consistió en la identificación de
las técnicas de coloración más comunes para la observación de la morfología y las
estructuras bacterianas, previo a ello se estudió la preparación del extendido y finalmente
se describieron algunas características bacterianas que se pueden observar mediante la
coloración diferencial, conocida como Coloración de Gram. Como resultado se obtuvo
que el método de la tinción de Gram es efectivo para una clasificación bacteriana (Gram
positivas, Gram negativas), y su diferencia radica en la composición química que tenga
la pared celular. Además, es un método favorable siempre que se tenga los
microorganismos bajo condiciones óptimas; esto principalmente por la sencillez y
economía que maneja.
Palabras clave: Coloración de Gram, Gram positivas, Gram negativas, bacterias,
morfología.
4
2. INTRODUCCIÓN
Los microorganismos son sistemas biológicos que presentan diversas y complejas
estructuras que pueden emplearse para una clasificación morfológica, es decir, mediante
el uso de las características físicas se puede realizar un estudio taxonómico (Kaur, 2009).
Estos estudios de reconocimiento se efectúan mediante el uso de técnicas como la tinción
o coloración, esta se refiere es al uso de colorantes acuosos que contrastan favorablemente
alguna muestra que contenga algún sistema biológico al intentar observarse en un
microscopio (Rodríguez et al., 2015). Así pues, se han desarrollado técnicas tintoriales
que destacan las características morfológicas de los microorganismos. Existe una gran
variedad de tinciones que pueden ser aplicadas dentro del campo de la microbiología. Un
colorante se define como una sustancia capaz de dar color a células, tejidos, fibras,
etcétera. De acuerdo con su origen, se pueden dividir en: colorantes naturales, los cuales
son extraídos de plantas o animales, y colorantes artificiales, que son aquellos de
minerales procesados y manipulados en el laboratorio. Químicamente, el colorante está
constituido de un componente cromóforo y un auxocromo. El cromóforo es todo grupo
aislado, covalente e insaturado, que tiene una absorción característica en la región
ultravioleta o visible; dicho de otra forma, es la capacidad que tiene la molécula para que
sus electrones absorben energía o luz visible, se excitan y emiten diversos colores de
acuerdo con la longitud de emitida como resultado del cambio en el nivel energético
(Madison, 2001). Las tinciones en microbiología son las primeras herramientas que se
utilizan en el laboratorio para el diagnóstico de las enfermedades infecciosas. Desde hace
más de un siglo han ayudado a resolver problemas de etiología microbiana. Hay una gran
variedad de tinciones, que se han ido desarrollando para la detección de los diferentes
agentes infecciosos en los que se incluyen bacterias, parásitos y hongos. (Keller,2013).
El concepto de Tinción de Gram fue desarrollado por el científico danés Hans Christian
5
Gram en 1884; hoy en día, sigue siendo una de las tinciones más utilizadas universalmente
debido a lo económico, sencillo y eficaz que resulta. Los principios de la tinción de Gram
están basados en las características de la pared celular de las bacterias, la cual le confiere
propiedades determinantes a cada microorganismo. (Beveridge, 2001).
Este es uno de los métodos de coloración para la clasificación morfológica más comunes,
el cual consiste en teñir una muestra mediante el colorante cristal violeta y así definir si
la muestra es perteneciente al conjunto de las Gram positivas o las Gram negativas. Esta
clasificación se efectúa al ver si la muestra retiene o no el colorante, designando como
Gram positivas a las muestras que logran retenerlo y Gram negativas a aquellas muestras
que pierden la coloración del cristal violeta (Spiegel, n.d). La falta de retención que
presentan las bacterias denominadas como Gram negativas, puede entenderse como la
falta de lípidos en su membrana plasmática lo cual da lugar a una inestabilidad osmótica,
es decir, la diferencia entre las Gram positivas y las Gram negativas se encuentra en la
membrana plasmática y la pared celular (Souza, 2000). De esta forma, La tinción de Gram
es conocida como una tinción diferencial, ya que utiliza dos colorantes y clasifica a las
bacterias en dos grandes grupos: bacterias Gram negativas y bacterias Gram positivas. El
objetivo principal de esta práctica consistió en identificar las técnicas de coloración más
comunes utilizadas para identificar morfología y estructuras de bacterias.
6
3. MATERIALES Y MÉTODOS
Para la realización de la práctica se utilizaron materiales que varían entre láminas
portaobjetos, bandejas de coloración, Mechero y Asa de siembra. Además, se emplearon
reactivos como Cristal violeta, Lugol de Gram, Alcohol-acetona (actúa como
decolorante). Por otro lado, se trabajó sobre cultivos bacterianos como Escherichia coli,
Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Pseudomona aeruginosa.
En la primera parte del laboratorio se realizó la preparación de las láminas,
acondicionando la muestra y extendiéndola sobre cada una de las láminas portaobjetos,
seguido a esto se cubrieron las láminas con cristal violeta por un minuto, se lavaron y se
cubrieron nuevamente por un minuto esta vez con solución lugol, de nuevo se lavaron y
se dejó escurrir el exceso. Luego de esto las láminas con las muestras se decoloraron con
alcohol a 95° hasta que estas dejaron de soltar color, para finalizar, cubriéndolas con
safranina por 30 seg y lavando y secando nuevamente las láminas. Por último, se agregó
aceite de inmersión en las láminas debidamente teñidas y secas, estando listas se procedió
a observar los microorganismos con ayuda del microscopio.
7
4. RESULTADOS
En primera instancia, se siguió la metodología estipulada, haciendo uso de la
bacteria Staphylococcus aereus. Posteriormente, en la Figura 1 se observó el
comportamiento de esta, dando como resultado un color violeta oscuro; indicando
de esta forma que es una bacteria Gram positiva.
Fig 1. Staphylococcus aureus.
En la Figura 2 se presenta la bacteria Bacillus cereus, en la cual se observó que
este microorganismo tiene una tendencia a ser Gram positivo por su color intenso
morado.
Fig 2. Bacillus cereus.
8
En la Figura 3 se observó que la bacteria Escherichia coli, presentó un
comportamiento diferente a las dos anteriores figuras, puesto que se tornó de un
color entre rojo-rosa; indicando de esta forma que es un microorganismo de tipo
Gram negativo.
Fig 3. Escherichia coli.
En la Figura 4 se observó que la bacteria Pseudomona aeruginosa, presentó un
color confuso puesto que se marcaba entre rosa-morado. Finalmente, se concluyó
que el color que prevalece es la tendencia a rosa, lo cual es de tipo Gram negativo.
Fig 4. Pseudomona aeruginosa.
A continuación, se presenta un cuadro en donde se resume la información
adquirida mediante la observación de los anteriores microorganismos.
9
Bacteria Staphylococcus Bacillus cereus
aureus
Descripción de lo observado Coco (forma redonda) Bacilo (forma
alargada)
Coloración de la bacteria teñida Rosa violáceo Rosa intenso
Reacción a la coloración de Gram positiva Gram Positivo
Gram
Bacteria Pseudomona aeruginosa. Escherichia coli
Bacilos alargados. Bacilos
Descripción de lo observado
Coloración de la bacteria teñida Rosa violáceo Rosa intenso
Reacción a la coloración de Gram Gram negativas Gram negativos
10
5. DISCUSIÓN
La tinción de Gram basa sus principios en las diferencias entre las paredes celulares de
las bacterias Gram positivas y Gram negativas. La pared celular de las bacterias Gram
positivas posee una gruesa capa de peptidoglicano, además de dos clases de ácidos
teicoicos. Por el contrario, la capa de peptidoglicano de las Gram negativas es delgada, y
se encuentra unida a una segunda membrana plasmática exterior (de composición distinta
a la interna) por medio de lipoproteínas. Por lo tanto, ambos 17 tipos de bacterias se tiñen
diferencialmente debido a estas diferencias constitutivas de su pared. La clave es el
peptidoglicano, ya que es el material que confiere su rigidez a la pared celular bacteriana,
y las Gram positivas lo poseen en mucha mayor proporción que las Gram negativas. (Esaú
et al., 2014).
En la práctica de laboratorio se observó el comportamiento de E. Coli, S. Aureus, B
Cereus, P. Aeruginosa en el proceso de tinción de Gram. Se logró observar en primera
instancia Staphylococcus aureus, que es una bacteria de gran importancia debido a su
participación en diferentes patologías. Este mostró una coloración violeta como resultado
de la tinción se observa en la Figura 1 indicando que se trata de un microorganismo Gram
positivo, lo cual se logró constatar por medio de la teoría, donde se encontró que el
Staphylococcus aureus pertenece al género Staphylococcus que está formado por cocos
Gram positivos, con un diámetro de 0.5 a 1.5 μm, agrupados como células únicas, en
pares, tétradas, cadenas cortas o formando racimos de uvas. (Cervantes, 2014).
Posteriormente se analizó el comportamiento de Bacillus cereu, el cual generó una
coloración rosa debido a la tinción de Gram como se puede observar en la Figura 2,
debido a esto se determinó que se trataba de una bacteria Gram positiva. Esto se pudo
11
comprobar ya que según la literatura Bacillus cereus es un bacilo Gram positivo,
anaerobio facultativo y móvil debido a la presencia de flagelos perítricos; forma esporas
resistentes a condiciones adversas del medio, como altas temperaturas, deshidratación y
radiación, y produce diversas toxinas que contaminan gran variedad de alimentos.
(Sánchez, 2014).
Para la enterobacteria E. coli y se determinó que esta bacteria es Gram negativa, debido
a que se tiñó de tonalidades de rojo y rosado, como se puede observar en la Figura 3, esto
con respecto a la prueba y para comprobarlo, según la literatura la Escherichia coli es un
bacilo Gram negativo, anaerobio facultativo de la familia Enterobacteriaceae, tribu
Escherichia. Como todas las bacterias Gram -, la cubierta de E. coli consta de tres
elementos: la membrana citoplasmática, la membrana externa y, entre ambas, un espacio
periplásmico constituido por péptido-glucano. Esta última estructura confiere a la bacteria
su forma y rigidez, y le permite resistir presiones osmóticas ambientales relativamente
elevadas (Rodríguez, 2002).
En el microorganismo P. aeruginosa, dentro de la prueba de laboratorio, se obtuvo como
resultado válido para Gram negativa como se muestra en la Figura 4, por presentar una
coloración violeta debido al proceso de tinción de Gram, según la literatura Pseudomonas
aeruginosa pertenece a la familia Pseudomonaceae. Se trata de un bacilo recto o
ligeramente curvado Gram negativo, con un tamaño de 2–4 x 0,5-1 micras, y móvil
gracias a la presencia de un flagelo polar. Para estos microorganismos es común que
generen una tinción rosa esto se debe a que los frotis gruesos son propensos a una
decoloración insuficiente, pueden reducir la especificidad, hacer que los organismos
Gram negativos parecía ser Gram positivos y pueden retener artefactos durante la tinción,
12
lo que dificulta la lectura (Chandler, 2013). Ciertos organismos no siempre exhiben
características esperadas de tinción de Gram; en ocasiones, los organismos Gram
positivos aparecerán como Gram negativos, y los organismos Gram negativos retendrán
el cristal violeta durante la etapa de destintado y aparecerán como Gram positivos.
13
6. CONCLUSIONES
• El método de tinción diferencial Gram es efectivo para la clasificación bacteriana,
a través de la observación del comportamiento de la pared celular frente a este
proceso de coloración; por el cual, proporciona una información esencial sobre la
forma, tamaño y agrupación de las células bacterianas. Es decir, es fundamental
para identificar la morfología de los microorganismos. Además, no solo tiene
aplicación para el reconocimiento de bacterias, sino también para otro tipo de
microorganismos, entre ellos, los hongos y algunos parásitos.
• Es preciso mencionar que el método de tinción de Gram sigue siendo una de las
tinciones más utilizadas universalmente debido a lo económico, sencillo y eficaz
que resulta realizarla. Además, ocupan un lugar muy importante en la
microbiología, permiten reconocer y tratar oportunamente diferentes tipos de
agentes y microorganismos peligrosos ya sea para la industria alimenticia, clínica,
y farmacológica.
• Esta diferencia de tinciones se debe a la estructura de las paredes celulares de
ambos tipos de bacterias. Las bacterias Gram positivas tienen una pared gruesa
compuesta de peptidoglucanos y polímeros, e impermeable, que hace que resista
a la decoloración. En cambio, las bacterias Gram negativas tienen una capa
delgada de peptidoglucanos más una bicapa de lipoproteínas que se puede
deshacer con la decoloración.
• Es fundamental tener un control y condiciones óptimas del cultivo para que el
resultado de la tinción mediante el método de Gram, proporcione resultados
apropiados, además de considerar que para realizar el estudio de algún
microorganismo este debe ser joven.
14
7. ANEXOS
1. ¿Cuál es el propósito de fijación de la muestra?
R// En primera instancia, es importante mencionar que para algunas técnicas tintoriales
(como Gram) requieren antes de su proceso la fijación de las muestras, con la finalidad
de preservar la arquitectura estructural y química de las células. El método físico con
mayor utilización en microbiología es el calor seco, que consiste en exponer directamente
la laminilla a la flama del mechero, con esto se logra detener los procesos vitales de las
células y los microorganismos (López, 2014). Sin embargo, un sobrecalentamiento
repercutirá en la deformación de la morfología de las células bacterianas y asimismo, a
un efecto no deseado. Este método preserva el extendido por poco tiempo, por lo que se
recomienda utilizar un método químico, que precipite proteínas, antes de teñir
(Mollinedo, 2020). Así pues, la fijación de las muestras permite la adherencia de los
microorganismos en el portaobjetos y no permite que estos sean arrastrados durante el
lavado. Por otro lado, se preservan diversas partes de los microorganismos en el estado
natural con la mínima distorsión. La fijación se logra dada a la coagulación de las
proteínas plasmáticas causada por el calor.
2. ¿En la coloración simple que se observa principalmente?
R// “La tinción simple proporciona exclusivamente información acerca de la forma,
tamaño y tipo de agrupación de los microorganismos. Sin embargo, tiene la ventaja de ser
un método muy sencillo y rápido” (Vázquez, 2011). Mediante la coloración simple se
destaca el microorganismo por completo mediante un solo colorante. Esta tinción no sirve
para observar estructuras de los microorganismos, como por ejemplo las esporas.
15
3. ¿Cuál es el objetivo u ocular con que se observa al microscopio una muestra de
microorganismos tipo bacterias?
R// El objetivo que se emplea para la observación es el de 100X o también conocido como
de inmersión, adicionando una gota de aceite de inmersión el cual no permite la refracción
de la luz mejorando la luminosidad.
4. ¿Qué sucede si el colorante permanece por más tiempo del definido?
R// Si el colorante permanece por más tiempo del estipulado esto puede afectar en los
resultados finales, ya que al tener este error sistemático se obtiene una manifestación no
esperada. Así pues, Rojas (2011) lo confirmó en sus estudios de tinciones simples y
compuestas para bacterias, concluyendo que un causante de cambio en el final puede
deberse a un error en la etapa o proceso de tinción.
5. ¿Cuál es la función del aceite de inmersión?
R// “El objetivo de inmersión, comúnmente de 100X está diseñado para emplearse con
aceite de inmersión para microscopía que se aplica sobre la preparación y se interpone
entre esta y el objetivo” (Dorantes, 2018). Así pues, la función del aceite es evitar la
refracción de la luz aumentando el poder de resolución del objetivo 100X, sella o elimina
el espacio entre el cubreobjetos y el objetivo.
16
8. BIBLIOGRAFÍA
Beveridge TJ. Use of the Gram stain in microbiology. Biotechnic & Histochemistry.
2001; 76: 111-118.
Esaú López-Jácome, L., Hernández-Durán, M., Colín-Castro, C. A., Ortega-Peña, S.,
Cerón-González, G., & Franco-Cendejas, R. (2014). Las tinciones básicas en el
laboratorio de microbiología. 3.
[Link]
Estrella Cervantes-García, Rafael García-González,Paz María Salazar-Schettino.
Características generales del Staphylococcus aureus. Revista Latinoamericana de
Patología Clínica. (2014)
Kaur, R., & Embi, M. A. (2009). Self-directedness through asynchronous online
interactions: A Malaysian experience. European Journal of Social Sciences, 9(1),
48–60.
Keller PJ. Imaging morphogenesis: technological advances and biological insights.
Science. 2013; 340: 123-168.
Laura Chandler, Chapter 20 - Challenges in Clinical Microbiology Testing, Accurate
Results in the Clinical Laboratory, Elsevier, 2013, Pages 315-326.
López-Jácome, L. E., Hernández-Durán, M., Colín-Castro, C. A., Ortega-Peña, S., Cerón-
González, G., & Franco-Cendejas, R. (2014). Las tinciones básicas en el
laboratorio de microbiología. Investig. en discapacidades, 3(1), 10-18.
17
Madison BM. Application of stains in clinical microbiology. Biotech Histochem. 2001;
76: 119-125.
Mollinedo Patzi, Marcela Andrea; GONZALES VILLALOBOS, Cynthia. Bacterias
Gram Negativas. Rev. Act. Clin. Med, La Paz, 2020.
Rodríguez-Angeles, Guadalupe. (2002). Principales características y diagnóstico de los
grupos patógenos de Escherichia coli. Salud Pública de México, 44(5), 464-475.
Rodríguez, Y. Y., Arias, L. P., Medina, A. C., Mujica, Y. P., Medina, L. G., Fernández,
K. S., & Mena, A. E. (2015). Alternative stainning technique to determine
mycorrhizal colonization. Cultivos Tropicales, 36(2), 18–21.
[Link]
Sánchez J, Correa M, Castañeda-Sandoval LM. Bacillus cereus un patógeno importante
en el control microbiológico de los alimentos. Rev. Fac. Nac. Salud Pública 34(2):
230-242. DOI: 10.17533/[Link].v34n2a12
Souza, Claudia Ache Saldanha de, AVANCINI, César Augusto Marchionatti, & WIEST,
José María. (2000). Actividad antimicrobiana de Tagetes minuta L. - Compositae
(Chinchilho) frente a bacterias Gram-positivas e Gram-negativas. Brazilian
Journal of Veterinary Research and Animal Science,
37(6)[Link]
Spiegel CA, Roberts M. Mobiluncus gen. Nov., curtisii sp. Nov., Mobiluncus curtisii
subespecies holmesii [Link]. and Mobiluncus mulieris [Link]., curved rods for
the human vagina. Int J Syst Bacteriol 1984; 34: 177-184.
18
Vázquez, C., Martín, A., de Silóniz, M. I., & Serrano, S. (2011). Técnicas básicas de
Microbiología. Observación de bacterias. Reduca (Biología), 3(5).
