La criopreservación es el método donde se utilizan bajas temperaturas con el fin de
preservar las estructuras intactas de las células vivas (tiene como objetivo el mantenimiento
de la viabilidad y funcionabilidad celular a temperaturas bajas y esto se consigue porque el
frio enlentece las reacciones enzimáticas que se producen dentro de las células).
Las células se criopreservan para evitar pérdidas por contaminación, para minimizar
cambios genéticos en líneas continuas y evitar la transformación en líneas finitas. Una
criopreservación exitosa de células requiere seguir protocolos estandarizados y
reproducibles, aunque cada protocolo puede requerir modificaciones según el tipo celular o
línea a usar (la obtención de un protocolo ideal para criopreservar es dependiente del
conocimiento de las propiedades fisicoquímicas de la célula y/o el tejido puesto que este
proceso está afectado por diferentes variables como especie, tipo y estado de la célula a
congelar), para lograr la máxima viabilidad después del descongelamiento. Las células de
mamíferos criopreservadas incluyen líneas celulares inmortalizadas, células primarias
aisladas a partir de tejidos y células madre.
Cabe hacer énfasis en que existen dos métodos de criopreservación y se pueden clasificar
de acuerdo a la velocidad de congelamiento y descongelamiento en protocolos de
congelación lenta-descongelación lenta y congelación lenta-descongelación rápida (la más
usada) en las cuales la adición del crioprotector suele hacerse por pasos y el descenso de la
temperatura se realiza lentamente en un congelador programable.
En la actualidad el mejor método de almacenamiento es la congelación en nitrógeno
líquido. Las células crecidas hasta un 70-80% de confluencia (fase logarítmica del cultivo)
se resuspenden. La suspensión celular, idealmente de alta concentración celular, debe ser
congelada lentamente (descenso de aproximadamente 1ºC/min) en presencia de un agente
preservante (crioprotector) como el glicerol o el dimetilsulfóxido (DMSO).
(Cuando las células reinician su crecimiento el descongelado debe realizarse rápidamente)
Es importante saber que el procedimiento de descongelación es estresante para las células
congeladas por lo que el uso de una buena técnica y trabajo rápido garantizan que una alta
proporción de las células sobreviva el procedimiento.
El entender y aplicar adecuadamente la criopreservación y el descongelamiento de material
biológico es fundamental para los bancos de células de humanos y de células animales, los
laboratorios de cultivo celular (mantener una línea celular en cultivo continuo por largos
periodos de tiempo es costosa, hay un gran riesgo de contaminación así como la posibilidad
de una alteración genética) y los laboratorios de farmacia.
Es importante disponer de alícuotas congeladas de las células con el fin de minimizar la
acumulación de cambios genéticos en las líneas continuas, evitar la senescencia y la
transformación en las líneas finitas, y evitar la pérdida accidental de una línea por muerte o
contaminación.
En la actualidad el mejor método de almacenamiento es la congelación en nitrógeno
líquido. Las células crecidas hasta un 70-80% de confluencia (fase logarítmica del cultivo)
se resuspenden. La suspensión celular, idealmente de alta concentración celular, debe ser
congelada lentamente (descenso de aproximadamente 1ºC/min) en presencia de un agente
preservante como el glicerol o el dimetilsulfóxido (DMSO).
Las células son transferidas rápidamente a nitrógeno líquido (-196ºC) cuando alcanzan una
temperatura inferior a -50ºC, esto se consigue introduciendo los tubos con las células en un
recipiente especial con propanol, e introduciéndolo primero en el congelador de -80ºC.
Hasta llegar a -80ºC, la temperatura debe bajar lentamente para evitar la formación de
cristales intracelulares que puedan dañar a las células.
En el nitrógeno líquido se almacenan sumergidas o en la fase gaseosa superior durante
largos periodos de tiempo (años) sin deterioro celular apreciable. El almacenamiento a
temperaturas tan bajas como -80ºC es posible aunque se detecta deterioro de las células a
las pocas semanas y/o meses.
Las bajas temperaturas afectan la difusión y ósmosis a través de las membranas. El objetivo
de la criopreservación es mantener la viabilidad y funcionalidad celular. Este se consigue
porque el frio enlentece las reacciones enzimáticas que se producen dentro de las células.
Los periodos críticos para la sobrevida celular durante la criopreservación son la fase inicial
del congelamiento y el periodo de retorno a las condiciones fisiológicas normales, por ello
la descongelación de los stocks se ha de realizar rápidamente, diluyendo la suspensión y
eliminando el agente preservante con la máxima rapidez.
La membrana celular es la estructura que sufre mayor daño en la congelación, esto es
debido a la pérdida de fluidez de los componetes lipídicos, dando un alto grado de
fragilidad celular. La lesión celular crioinducida se explica en función de la formación de
hielo intracelular y del estrés osmótico al que se ven inducidas durante la congelación.
