UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS
UNIVERSIDAD DEL PERÚ, DECANA DE AMÉRICA
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
E.P. DE GENÉTICA Y BIOTECNOLOGÍA
EVALUACIÓN DEL CONTENIDO DE PIGMENTOS
FOTOSINTÉTICOS POR CROMATOGRAFÍA DE PAPEL
CURSO: Fisiología Vegetal
DOCENTE: Giovana Patricia Vadillo Galvez
GRUPO N°2
ALUMNOS:
Espinoza Arias, Angie Elizabeth 19100102
Gervacio Villarreal, Edinson Alfonzo 19100114
Milla Trujillo, Wilber Alexander 19100113
HORARIO: Miércoles 8:00 - 12:00 AM
CICLO: 2021 – I
Introducción
Los pigmentos fotosintéticos que se encuentran en los cloroplastos son moléculas químicas
con la capacidad única para la absorción de la luz solar, entre estos se tienen como principal
representante a las clorofilas (a y b), además de los carotenoides, caroteno y xantofila, de
coloración naranja y amarilla respectivamente (García, 1980).
Con el método de cromatografía los pigmentos fotosintéticos pueden separarse y visualizarse,
este método físico depende de la distribución de los componentes de la mezcla entre las dos
fases inmiscibles: la fase móvil, también es llamada fase activa, que transporta las sustancias
que se van a separar y que progresa en relación con la otra, llamada fase estacionaria. La
existencia de diversos tipos de cromatografía tiene lugar por las diferentes combinaciones de
los estados en los que se pueden encontrar las fases activas (líquido y gas) y estacionarias
(sólido y líquido) (Mancilla, C et al., 2013).
En el caso del presente informe se utilizó la cromatografía en papel donde se da la separación
por distribución entre la fase móvil ,un líquido y la fase estacionaria ,el papel ;con el objetivo
de comparar los diferentes pigmentos fotosintéticos de las hojas de las plantas de sombra y
luz , la identificación de los diversos pigmentos fotosintéticos que se encuentran, calcular el
factor de retardo (Rf) utilizando las mediciones adquiridas por cada hoja analizada y
comparar los resultados obtenidos con bibliografía confiable.
Se someterá a prueba 3 hipótesis elaboradas por el grupo, hipótesis principal : “Las plantas de
sombra presentan mayor cantidad de pigmentos en comparación con las plantas de sol.” y
como hipótesis secundarias : “El pigmento caroteno presentan un mayor valor de Rf que los
demás pigmentos” y “El valor del factor de retardo de los pigmentos es mayor en el eluyente
acetona respecto a alcohol.”
METODOLOGÍA
1. Colecta del material biológico
Figura 1. Hojas con sombreamiento Cyclamen purpurascens.
Figura 2. Hojas sin sombreamiento Hibiscus. tiliaceus.
2. Preparación de la cámara cromatográfica
Figura 3. Frasco izquierdo, 10ml de alcohol 96º; frasco derecho; acetona.
3. Preparación de las muestras
Preparación de la pasta (extracto) del material biológico (hojas sombreadas y no
sombreadas) → se le procede a añadir 5 ml de solvente (2 procedimientos*) antes,
durante y después del aplastamiento*
Figura 4. Preparación de la pasta con el uso del mortero
*Uno usando alcohol 96º y otro con acetona
*se utilizó tiza rallada para darle espesor al extracto
Figura 5. Vasos con los pigmentos filtrados* según sus respectivos solventes y tipo de
sombreamiento.
*Se procede a filtrar con un papel absorbente el extracto resultante.
4. Procedimiento para la cromatografía en papel
Cortamos las tiras del papel filtro* a 1cm de ancho obteniendo así 8 con esa misma
medida → marcamos con lápiz a 1cm de altura respecto a la base de una tira → paso
seguido añadimos el pigmento en forma de gotas en cada tira. → Lo dejamos secar
por un lapso de minutos y si no se tiñe lo suficiente volvemos a repetir el proceso.
Figura 6. Tiras teñidas en la parte inferior con sus respectivos pigmentos
*Tenemos dos tipos de tira (lenta y rápida)
Colocamos cada tira en su respectivo solvente y lo cubrimos con una película de
plástico, papel u otro material que se disponga para evitar la evaporación de dichos
solventes.
Figura 7. Tiras en su respectivo solvente cubiertas con papel absorbente.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Tabla 1: Registro de valores del Factor de retardo en Heliófilas y esciófilas
En la Tabla 1 se muestran los diferentes valores de factor de retardo con respecto a los
pigmentos fotosintéticos de las hojas de sol (Allium Cepa, H. tiliaceus ) y sombra ( Caladium
bicolor , C. purpurascens ) en base a un eluyente en este caso alcohol o acetona como fase
móvil o líquida y su fase estacionaria o papel filtro. Tales datos fueron agrupados en el
siguiente gráfico para su mejor comprensión y análisis.
Figura 8. Gráfico de puntos de los 8 procedimientos indicados en la metodología.
Según Torossi (2007) “La separación de estos pigmentos fotosintéticos mediante
cromatografía en papel transcurre a través de un mecanismo de adsorción física, donde se
establecen una serie de equilibrios de adsorción-desorción que dependen de la polaridad de
cada pigmento y del tipo de fuerzas intermoleculares que puedan establecer con los
hidroxilos libres de la celulosa del papel y con la estructura del disolvente de la fase móvil.”
En la figura 8 se observa que los diversos pigmentos fotosintéticos en todas las especies se
encuentran en un orden de migración establecido con respecto a su Rf. En el caso de las
clorofilas a y b ambas se caracterizan por tener un anillo tetrapirrólico cíclico, de tipo
porfirina con un catión de magnesio en el centro del anillo y un alcohol insaturado de fitol (
Azcón, 2013), sin embargo su diferencia radica en un sustituyente del carbono C-3 que va
otorgarle a la clorofila b un color verde amarillento a diferencia de la clorofila a, un color
verde azulado, además una mayor polaridad frente a la clorofila a por lo que se absorbe más
intensamente y tendría un factor de retardo menor; por otro lado los carotenoides que
contiene un grupo oxígeno denominadas xantofilas que les otorga mayor polaridad frente a
las xantofilas que no lo contienen (Carranco,2011) además que las fuerzas de tipo van der
Waals, no son lo suficientemente fuertes como para interactuar con la estructura del papel,
por lo que quedan disueltos en la fase móvil y arrastrados por ella, presentando en
consecuencia, un factor de retardo mucho mayor, por lo que se explica este orden
característico de los pigmentos fotosintéticos, donde como lo menciona Torossi F. (2007):
“los más polares quedan retenidos cerca de la línea de aplicación ,mientras que los menos
polares ,cerca de la línea de máxima altura del eluyente.”
En base a los resultados del experimento, la metodología que empleó cada evaluador y el
posterior análisis de los resultados no se puede aceptar la hipótesis principal : “ Las plantas de
sombra presentan mayor cantidad de pigmentos en comparación con las plantas de luz” a
pesar de que al consultarse en la literatura se afirma que las plantas de sombra poseen mayor
número de pigmentos en las antenas de los fotosistemas con el objetivo de un mejor
aprovechamiento de la escasa radiación luminosa incidente. (Azcón,2013)
La no aceptación de nuestra hipótesis se debe a diversos factores , en primer lugar que no se
desarrolló una estandarización de protocolos en el procedimiento para cada evaluador como
la cantidad de trozos de área de hojas utilizadas a la hora del extracto de los pigmentos entre
las hojas heliófilos y esciófilas ya que Azcón (2013) nos indica que “las hojas crecidas en
condiciones de luz débil o hojas de sombra son más delgadas porque poseen menos capas de
células del mesófilo en empalizada, células más cortas, y menor peso por unidad de área
foliar ” y en segundo lugar la cantidad de diluyente utilizado por cada evaluador con respecto
a su especie de planta o la cantidad de volumen de gotas colocadas del disolvente al papel
filtro. Además, que la cantidad de pigmentos difiere entre especies por lo que un mejor
procedimiento se hubiera realizado comparando hojas de sol y sombra en la misma especie y
no cuatro especies de forma independiente, sin embargo es necesario resaltar que la variación
de estos pigmentos también depende del estado nutricional de la planta, edad, factores,
medioambientales y de su historia lumínica previa. (Manrique,2003)
Otro factor importante son los errores experimentales que cometió cada evaluador a la hora
de desarrollar la metodología, tal es el caso de la planta de luz H. Tiliaceus donde se expone
que solo presenta el pigmento caroteno y xantofila (gráfico 8), pero al consultarlo con la
literatura no concuerdo con lo esperado, ya que H. Tiliaceus contiene una fuente de clorofila
a y b alta (Tostado,2017) ,posiblemente el error cometido se debió a un proceso de extracción
muy lento y en alta iluminación ya que las clorofilas , se degradan por el calor, los ácidos y
por acción de la enzima clorofilasa del propio tejido vegetal (Torosi,2007) además esta
degradación da lugar a la formación de feofitinas al perder el átomo central de magnesio por
hidrógeno presentándose con un color pardo oliva. (Lallana,2003)
Es necesario indicar que existe una variación cualitativa de pigmentos fotosintéticos en cada
especie (Anexo 1,2,3) tal es el caso de la especie A. Cepa y C. bicolor donde en el gráfico se
observa la falta del pigmento fotosintético caroteno sin embargo al consultarlo en literatura si
dicho resultado era el esperada se descubrió que diversas investigaciones demuestran que A.
cepa contiene pigmentos carotenoides ( Guillamón,2020) y que el fenotipo de [Link]
resalta por la variada gama de colores correspondientes a pigmentos como la clorofila A y B,
xantofilas, carotenos y antocianinas (Valenzuela et al,2016) por lo que expone un error a la
hora de la extracción. Con respecto a la planta de sombra C. Purpurascens se visualizan y se
encuentra en una óptima distribución todos los pigmentos en el eluyente acetona, mientras
que en el alcohol solo se observa la coloración de xantofila, esto podría deberse por las
diferentes características de cada eluyente que será explicado más adelante (Figura 11 ).
Figura 9. Gráfico de cajas del factor de retardo (Rf) por cada tipo de pigmento fotosintético.
El Rf producido por la clorofilas b, clorofila a, xantofila y caroteno presentan rango de
valores distintos (figura 9), siendo el rango de valores de Rf del caroteno mayor que el resto.
Se observa en esta figura una amplia variabilidad de los datos producido posiblemente a los
distintos tiempo y procedimiento que se emplearon cara cada tipo de tratamiento. A partir de
este análisis preliminar podemos concluir que en promedio los carotenos presentan un Rf
mayor que el resto de pigmentos, pero, para una mayor certeza de esta afirmación se realizó
el análisis estadístico respectivo.
Para poder confirmar nuestra hipótesis es necesario realizar la prueba ANOVA para muestras
independientes, previo a aplicar esta evaluación se verificó la normalidad y homocedasticidad
de los datos lo que resultó con un nivel de confianza de 95% que los datos presentan
normalidad y que sus varianzas de los cuatro grupo son iguales según la prueba de
normalidad de Shapiro-Wilk (anexo 4) y la prueba de homocedasticidad de Bartlett (anexo 5),
respectivamente. Luego, se aplicó la prueba ANOVA resultando un p-value<0.05 (anexo 6) lo
que indicaría que al menos una media de los cuatro grupos de datos es diferente, esto supuso
la aplicación de comparaciones múltiples para saber que media es la mayor. Entonces,
mediante la prueba post hot de TukeyHSD (anexo 7) se puede afirmar con un nivel de
significancia del 5% que la media de Rf del caroteno es mayor que la media del Rf de la
clorofila a y b, por otro lado, con un nivel de significancia de 20% se acepta que la media del
Rf del caroteno en mayor que la media del Rf de la xantofila. En conclusión, al caroteno
presenta en promedio mayor Rf que los demás pigmentos con diferente nivel de confianza; de
esta manera se aceptaría la Hx y concordaría con otros estudios en el cual manifestaron que
los carotenos presentan un mayor Rf que los demás pigmentos (Salinas et al., 2003).
Figura 11. Gráfico de cajas de los valores de Rf por tipo de eluyente empleado
En la figura 11 se visualiza los dos diferentes eluyentes que actúan en la fase móvil de la
cromatografía , se observa que existen mayor rango de valores del Rf de acetona con una
amplia dispersión de datos, también que el valor de la mediana es mucho mayor con respecto
al alcohol, además se verifica que los valores Rf alcanzados fueron mayores en la acetona
por cada pigmento específico en cada especie de planta utilizada (Figura 8 ), a excepción de
un valor que también se visualizan en el gráfico con la presencia de un dato atípico en el
eluyente acetona , este podría indicar un error procedimental que puede corresponder a que
en la cámara cromatográfica no se saturó totalmente con el diluyente o que al aplicar la
muestra en la tira de papel filtro específico no se dejó evaporar el disolvente, por lo que hubo
un tiempo mínimo del secado antes de colocarse en la cámara cromatográfica.
El análisis estadístico resultó que los dos grupos de datos observados en la figura 11
presentan distribución normal y sus varianzas son iguales con un nivel de confianza de 95%
para ambos aspectos, según la prueba de normalidad de shapiro-Wilk (anexo 8) y la prueba
de homocedasticidad de fisher (anexo 9), respectivamente. La prueba T-student para la
comparación de medias presentó un p-value<0.05 (anexo 10), entonces, con 5% de nivel de
significancia se afirma que la media de los Rf producida por la acetona es mayor que la
producida por el alcohol, es decir, que los pigmentos fotosintéticos en promedio avanzaron
más con el eluyente acetona que con el alcohol, de esta manera se acepta nuestra hipótesis
que fue respaldado con la literatura consultada donde señalan que el diluyente contribuye a
que los pigmentos puedan separarse mediante sucesivos equilibrios de adsorción-desorción y
que su polaridad es un favor clave para la separación de los pigmentos fotosintéticos,
aclarando que se les caracteriza en términos de polaridad, a pesar de que no todos poseen un
momento dipolar (Torossi, 2007). Está polaridad relativa se describe mediante la fuerza
eluyente o serie eluotrópica de cada disolvente donde el alcohol cuenta con un índice de
polaridad de 4,3 y la acetona con 5,3 (Skoog ,2003 ) con lo que se procede a mencionar que
mientras mayor es la fuerza eluyente del disolvente más rápido será la adsorción de los
pigmentos, además que la acetona tiene un amplio margen de solubilización y escasa
selectividad (Rodriguez,2002); por lo que con respaldo estadístico y bibliográfico se aceptaría
nuestra tercera hipótesis.
Conclusión
Se observa una mejor separación de los pigmentos utilizando como eluyente a la acetona en
vez del alcohol, además, las tiras de corrida rápida o delgada necesitó menos tiempo que la
tira gruesa para alcanzar similar nivel de avance de un mismo pigmento. Por otra parte, en
todas las especies utilizadas en este experimento se observa la presencia de clorofila a y b, a
excepción de algunos grupos de tratamientos.
Por último, los Rf de los pigmentos que utilizaron como eluyente la acetona presenta un
rango de valores altos y variados que los producidos por el eluyente alcohol. Asimismo, el
caroteno es el pigmento que alcanzó un mayor recorrido en cada una de las tiras ya sea
utilizando como eluyente al alcohol o la acetona.
Referencias bibliográficas
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la concentración de aminoácidos en tubérculos de Caladium bicolor en dos etapas
fenológicas.(pp. 181-209). Clave Editorial
ANEXOS
Anexo 1. Cromatografía de los pigmentos de la hoja de C. purpurascens (sombreada) y H. tiliaceus (soleada); las descripciones se señalan en la
misma imagen.
Anexo 2. Cromatografía de los pigmentos de la hoja de A. cepa, la tira gruesa es de corrida
rápida y la delgada de corrida lenta, además, la imagen de la derecha se utilizó como eluyente
la acetona y el de la izquierda alcohol.
Anexo 3. Cromatografía de los pigmentos de la hoja de C. Bicolor. A la derecha se muestra la
tira rápida y lenta en el eluyente acetona y el de la izquierda alcohol. Donde R corresponde a
tira rápida y L a tira lenta.
Anexo 4. Prueba de normalidad de Shapiro-wilk para los datos de la Rf de la clorofila a,b,
xantofila y caroteno resultando un p-value de 0.3737, 0.626, 0.804 y 0.07067,
respectivamente.
Anexo 5. Prueba de homocedasticidad de bartlett para cuatro grupos de datos (clorofila a, b,
xantofila y caroteno) resultando un p-value de 0.4806.
Anexo 6. Prueba de Igualdad de varianzas (ANOVA) para los datos de la Rf de clorofila a,b,
xantofila y caroteno resultando un p-value de 0.00346.
Anexo 7. Comparaciones múltiples de medias de cuatro grupos de datos (clorofila a, b,
xantofila y caroteno) con la prueba Post hot de TukeyHSD
Anexo 8. Prueba de normalidad de shapiro wilk para los Rf producidos por los eluyentes de
alcohol y acetona.
Anexo 9. Prueba de homocedasticidad de fisher para los Rf producidos por los eluyentes de
alcohol y acetona.
Anexo 10. Comparación de medias mediante la prueba T-Student para los Rf producidos por
los eluyentes de alcohol y acetona.
