UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA

FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA
CURSO: LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

PRÁCTICA 3: Tinción diferencial alcohol - ácido resistente

INTEGRANTES:
- De La Cruz Yaulli, Christian Eduardo 20171100
- Galván Quispe, Sol Angie Susana 20190498
- Orellana Rosales, Milagros Elsa 20180475
- Quispe Barzola, Julia Jhanelisse 20171067
- Villavicencio, Villarreal Elvis Wiliams 20181350

PROFESORA: ​Ludeña Hinojosa, Yvette

GRUPO: 7

LIMA - PERÚ
2021
 TINCIÓN DIFERENCIAL ALCOHOL -ÁCIDO RESISTENTE

I. CUESTIONARIO:

1. ¿Qué función cumple el fenol y el calentamiento en la técnica de tinción de

endosporas?

El calor ayuda a que el colorante atraviese las gruesas paredes de la espora, la cual
está compuesta por espesas capas de peptidoglucano, y una membrana externa
llamada “cubierta de espora” (responsable de su alta resistencia) (Tortora, G.,
Funke,B. & Case, C. 2007); el calor ablanda las cubiertas exteriores duras,
permitiendo el paso y adhesión de colorante. (Okarin, A. et al. 2017). El fenol,
presente en la carbolfucsina, tiene una función similar; ya que, actúa como solvente
orgánico(Condalab 2019).

2. ¿Cuál de los métodos utilizados cree que le permitirá observar mejor las
endosporas bacterianas? ¿A qué atribuye la diferencia?

Entre los métodos presentados en clase, se enfatizó la eficacia de la técnica de

Schaeffer-Fulton. Dicho método se encuentra entre los más empleados, dado que es
conveniente para poder observar las esporas, las cuales se diferencian de un color
verde de los bacilos que presentan un color rojo. (Silva, et al, 2006) Sin embargo, la
técnica Schaeffer-Fulton presenta un inconveniente; en algunos casos debido a su
resistencia característica, en muchos casos las endosporas requieren ser observadas en
cultivos de 48 horas o posteriores, obstaculizando la apreciación de las mismas al
microscopio.

Por otro lado, se explicó la técnica de Dörner, el cual a diferencia de la primera

técnica nos presenta resultados con las esporas teñidas de color rojo y las células
bacterianas casi incoloras contra un fondo gris oscuro. Debido a ello, concluimos que
el método más conveniente para la observación de las endosporas sea el de
Schaeffer-Fulton, que aunque puede presentar ciertos inconvenientes como se
mencionó, nos permite visualizar mejor las endosporas bacterianas en un medio donde
el contraste esté a favor.

3. ¿Qué efecto produciría reemplazar el alcohol ácido por otro decolorante

como el alcohol cetona?

Las micobacterias (organismos alcohol - ácido resistentes) se consideran Gram

positivos, pero que se colorean difícil e irregularmente de ahí que se emplee el método
de Ziehl-Neelsen (método caliente) o su variante Kinyoun (método frío). Se considera
que la acidorresistencia es debida al alto contenido lipídico de estas bacterias,
fundamentalmente fosfolípidos, ceras y ácidos micólicos (Koneman & Allen,2008)
;este último forma el complejo micolato-fucsina en la pared celular, en la tinción
Ziehl-Neelsen, resistiendo la decoloración por alcohol ácido (...). Existen diferentes
opiniones al respecto y el papel de los ácidos micólicos está entre ellos por tratarse de
un constituyente de la pared micobacteriana, y si esta se aísla por centrifugación y se
purifica no aparece como alcohol ácido-resistente. Quizá la causa sea la formación de
complejo entre la fucsina y algún componente bacteriano y el que este complejo se
mantenga unido cuando se realiza la decoloración, y lo más probable es la formación
de un complejo fucsina-ARN bacteriano, por esta razón cambiar el decolorante
alcohol ácido por alcohol cetona no generaría ningún efecto, y contrario a este sucede
en la decoloración con alcohol cetona de los Gram negativos (Pumarola et al.,1999).

4. ¿Por qué no se puede realizar una tinción de Gram a los microorganismos

patógenos como ​Mycobacterium sp​?

Las especies de ​Mycobacterium p​ oseen una pared celular de estructura poco común
que contiene ácido N-glucolilmurámico en lugar de N-acetilmurámico y una cantidad
muy elevada de lípidos.Debido a esta estructura de la pared celular es difícil teñir
micobacterias con los colorantes básicos habituales, como los que se emplean en la
tinción de Gram,pero estos microorganismos resisten a la decoloración con alcohol
acidificado tras la exposición prolongada a un colorante de fucsina básica o con el
calentamiento posterior al agregado el colorante. Esta propiedad importante de las
micobacterias, que depende de su pared celular, se denomina ácido-alcohol resistencia
y permite distinguirlos de otros géneros (Forbes,2009).

5. ¿Qué otros géneros de bacterias pueden formar endosporas?

Además del ​Bacillus spp​. y ​Clostridium spp.​, los formadores de endosporas conocidos
se agrupan en relativamente pocos géneros (la mayoría son varillas gram negativas)
entre los que podemos encontrar: ​Paenibacillus, Sporolactobacillus,
Desulfotomaculum, Thermoanaerobacter, Sporomusa, Sporohalobacter,
Anaerobacter, Alicyclobacillus, Amphibacillus, Heliobacterium, Heliophilum,
Syntrophospora y Desulfitobacterium ​(Hussey, M. & Zayaitz,A. 2012).

6. Revise otras técnicas de tinción de esporas y compárelas con las usadas en

este ejercicio. Destaque ventajas y desventajas.

Técnica de Dorner
● Preparar en un tubo de ensayo una suspensión concentrada del microorganismo
esporulado en agua destilada y agregar un volumen igual de fucsina fenicada de
Kinyoun filtrada.
 ● Colocar el tubo en un baño con agua en ​ebullición​ durante entre 5 y 10
minutos.
● Sobre un portaobjetos limpio mezclar una gota de la suspensión anterior con
una gota de solución acuosa de nigrosina al 10 %, hervida y filtrada.
● Extender y secar rápidamente con calor suave.
● Examinar con objetivo de 100X (inmersión).

Las esporas se tiñen de color rojo y las células bacterianas aparecen casi incoloras
contra un fondo gris oscuro.

Técnica de Dorner modificada

● Se hace un extendido de una suspensión del microorganismo esporulado en un
portaobjeto y se fija al calor.
● La muestra se cubre con una tira de papel de filtro a la que se le agrega fucsina
fenicada. El colorante se calienta de 5 a 7 minutos con la llama del mechero de
Bunsen hasta que se genere el desprendimiento de vapores. Luego se retira el
papel.
● Se lava la preparación con agua y luego se seca con papel absorbente.
● Se cubre el frotis con una película delgada de nigrosina al 10 %, usando un
segundo portaobjeto para extender la nigrosina o una aguja.

La coloración que toman las esporas y las bacterias es igual a la descrita en la técnica
anterior.

Técnica de Shaeffer–Fulton o Wirtz-Conklin

● Hacer un extendido fino con una suspensión del microorganismo esporulado en
un portaobjeto y fijar al calor.
● Cubrir el portaobjetos con solución acuosa de verde de malaquita al 5 % (se
puede colocar un papel de filtro sobre la lámina).
● Calentar sobre la llama del mechero de Bunsen hasta causar desprendimiento
de vapores y retirar la llama. Repetir la operación durante de 6 a 10 minutos. Si
durante el procedimiento se evapora demasiado la solución de verde de
malaquita, se puede agregar más.
● Retirar el papel de filtro (si fue colocado) y lavar con agua.
● Cubrir el portaobjetos con safranina acuosa al 0,5 % durante 30 segundos
(algunas variantes de la técnica usan safranina acuosa al 0,1 % y la dejan por 3
minutos)
Con esta técnica las esporas se presentan de color verde y los bacilos de color rojo.
Tiene el inconveniente de que las endosporas de cultivos jóvenes no se tiñen bien,
dado que se ven extremadamente claras o incoloras. Para evitar esto se recomienda
usar cultivos de 48 horas de incubación.

Técnica de Möeller

● Cubrir el frotis con cloroformo por 2 minutos.

● Descartar el cloroformo.
● Cubrir con ácido crómico al 5 % durante 5 minutos.
● Lavar con agua destilada
● Se cubre la lámina con carbol fucsina-fenicada y se expone a la llama del
mechero de Bunsen hasta la emisión de vapores; luego se retira de la llama
unos instantes. Se repite la operación hasta cumplir 10 minutos.
● Lavar con agua.
● Usar etanol acidificado (alcohol clorhídrico) para decolorar. Se deja durante 20
o 30 segundos.
● Lavar con agua destilada.
● Contrateñir cubriendo la lámina con azul de metileno por 5 minutos.
● Lavar con agua destilada.
● Se deja secar y se lleva la muestra al microscopio.

Las esporas se ven de color rojo y los bacilos azules. Es importante no aspirar los
vapores, pues son tóxicos y a largo plazo pueden ser cancerígenos.

Técnica de Möeller modificada sin calor

En el año 2007 Hayama y sus colaboradores crearon una modificación de la técnica de
Möeller. Eliminaron el paso del calentamiento del colorante y lo sustituyeron por la
adición de 2 gotas del surfactante Tergitol 7 por cada 10 ml de solución de carbol
fucsina-fenicada. Se obtuvieron los mismos resultados.
USOS:
La coloración de esporas brinda una información muy valiosa y útil para la
identificación del patógeno, pues la presencia de la misma, su forma, ubicación dentro
del bacilo y la capacidad de deformar la célula vegetativa o no, son datos que pueden
orientar sobre la especie involucrada dentro de un determinado género.
En este contexto, vale decir que las esporas pueden ser redondas u ovaladas, pueden
estar ubicadas en el centro o también en posición paracentral, subterminal o terminal.
(Gil,2021)

Los reactivos usados en la técnica de Dorner y en la técnica de Dorner modificada,

suelen ser accesibles en el mercado, lo que las convierte en técnicas económicas de
realizar. Sin embargo, suelen obtener resultados poco satisfactorios, ya que la
nigrosina tiende a opacar demasiado el fondo de la muestra haciendo difícil su
visualización.

La técnica de Shaeffer-Fulton o Wirtz-Conklin, es la más usada; ya que, su

procedimiento es simple, los reactivos son accesibles y el contraste entre la espora y la
célula vegetativa es el óptimo para su observación.

A pesar de que la técnica de Moller y la técnica de Moller modificada también

obtengan un contraste satisfactorio, utilizan un reactivo tóxico, cancerígeno y volátil,
el cloroformo; lo que las convierte en procedimientos potencialmente nocivos; por lo
que, deben ser realizadas bajo la campana de extracción para evitar inhalar los vapores
tóxicos del cloroformo, lo que le da un grado de dificultad mayor a diferencia de otras
técnicas de tinción. Además la técnica de Moller modificada usa el Tergitol 7 en vez
del calor, generando un gasto adicional en reactivos.
II. BIBLIOGRAFÍA

❖ Condalab (2019) Fucsina Fenicada: composición, principios y usos. Recuperado el

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❖ Silva M, García M, Desongles J, Ponce E. (2006). Técnico especialista en laboratorio,
del Servicio Gallego de Salud (SERGAS). Volumen II. Editorial MAD. Sevilla-España,
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❖ Tortora, G., Funke,B. & Case, C.(2007) Introducción a la Microbiología. 9° Edición.
México: Panamericana. Recuperado el 04/02/2021 de
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n+de+endosporas&hl=es&sa=X&ved=2ahUKEwiwzLmZ6tDuAhWig-AKHRNyDrgQ
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