ESPECTROFOTOMETRÍA
Docente: Teresa Lanchipa
Nombre: juan Carlos Huanchi Condori
Curso: BIOQUIMICA
Código: 2017-111008
Tema: espectrofotometría
2021
LABORATORIO N°4:
ESPECTROFOTOMETRÍA
1. INTRODUCCION
Muchos experimentos en bioquímica dependen de la medición de absorción de luz
monocromática de una sustancia en solución en la región visible y ultravioleta del
espectro electromagnético. Diversos compuestos sean o no coloreados tienen la
capacidad de absorber luz de una determinada longitud de onda, pero en otros casos, es
necesario transformar la luz en un derivado coloreado usando reactivos apropiados.
Las moléculas de interés biológico adsorben luz en la longitud de onda comprendida
entre 200 y 800 nanómetros (nm), como las purinas, pirimidinas, aminoácidos
aromáticos, ácidos nucleicos, proteínas y otros. Tanto el color (colorimetría) como la
transmitancia (fotometría) de luz de una solución pueden usarse como medida de su
concentración.
Para realizar las medidas de concentración se utiliza un instrumento llamado
espectrofotómetro, el cual contiene un prisma de dispersión entre la fuente de luz y la
muestra para poder seleccionar la longitud de onda analítica adecuada. La
espectrofotometría consiste en comparar la transmisión de la luz a través de una
solución que contiene la muestra.
La ley de Lamber – Beer nos manifiesta que la fracción incidente absorbida por una
solución a una determinada longitud de onda está relacionada con el espesor de la capa
absorbente y concentración de la especie que absorbe.
Esta ley está expresada por la fórmula:
A = ɛ. c. l
Dónde:
A = Absorbancia (0 - 1)
ɛ = Coeficiente de Extinción Molar
C = Concentración (g/L, mg/mL, ug/Ml, etc.)
l = longitud de la cubeta (cm).
Para la transmitancia se aplica la fórmula
T = I/Io
Dónde:
T = Transmitancia (se expresa de 100 – 0%),
I = luz transmitida,
Io = Luz incidente.
Pueden existir limitaciones en la ley de Lamber – Beer, debido a diversas desviaciones
como instrumental, naturaleza de la muestra y el investigador. En la presente práctica
esta luz debe estar entre el 10 y el 90% aproximadamente. La determinación de la
concentración de una solución se puede realizar por el factor de calibración, curva de
calibración y mediante la ecuación A = ɛ. c. l.
2. OBJETIVOS
Encontrar la curva espectral de un colorante.
Determinar la longitud de onda analítica o de mayor absorbancia.
Poner en evidencia la ley de Lambert – Beer, haciendo uso de concentraciones
progresivas de un colorante.
Determinar la curva de calibración y factor de calibración mediante
concentraciones progresivas del colorante.
Determinar la concentración de una sustancia desconocida mediante el uso de la
curva de calibración o factor de calibración.
3. MATERIAL Y METODOS
MATERIALES
Materiales de vidrio Reactivos Agua destilada
Anaranjado de
Tubos de metilo 1mg/L Equipos y otros
ensayo Anaranjado de Espectrofotómetro
Pipetas metilo
desconocido
cubetas
METODOS
Mediante la observación y exploración se aplicará el método de absorción utilizando el
espectrofotómetro.
4. PROCEDIMIENTO
Espectros de absorción y longitud de máxima absorción
En un tubo medir 2ml de un colorante (anaranjado de metilo) y diluirlo con
1mL de agua destilada
Calibrar el espectrofotó metro a cero utilizando agua destilada como blanco.
Seleccionar la longitud de onda de mayor absorbancia.
Longitud
380nm 420nm 460nm 500nm 540nm 580nm
de onda
Curva de calibración
Preparar en tubos de ensayo, diferentes concentraciones con el respectivo
colorante anaranjado de metilo (10mg/L).
1 2 3 4 5 6
Anaranjado de metilo
0mL 1mL 2mL 3mL 4mL 5mL
(10mg/L)
Agua destilada 5mL 4mL 3mL 2mL 1mL 0mL
Factor de calibración
Determinar la concentració n de anaranjado de metilo en mg/mL y
mg/100mL para cada tubo.
Encontrar el factor de calibració n para el anaranjado de metilo.
Concentración de una solución desconocida
En un tubo de ensayo medir 5mL de la solució n desconocida.
Medir la absorbancia de la muestra desconocida, utilizando la misma
longitud de onda de má xima absorció n,
Hallar la concentració n de la solució n desconocida.
5. RESULTADOS
Esquematizar el procedimiento de los experimentos.
Mediante el uso de una tabla indicar la longitud de má xima absorció n para
el anaranjado de metilo. Luego graficar en papel milimetrado los resultados
de la tabla.
Longitud de
380nm 420nm 460nm 500nm 540nm 580nm
onda
Absorbancia 0,109 0,325 0,592 0,371 0,099 0,002
0.7
0.59
0.6
A B S O R O R V A N C IA
0.5
0.4 0.37
0.33
0.3
0.2
0.11 0.1
0.1
0
0
350 400 450 500 550 600
LONGITUD DE ONDA
Interpretació n:
En el siguiente cuadro muestra como la longitud de onda 460 nm llego al pico má s
alto con una absorbancia de 0,592.
Para la curva de calibración del anaranjado de metilo, elaborar una tabla indicando la
absorbancia y la concentración de cada sistema de tubos según el caso.
Encontrar el factor de calibración para el anaranjado de metido, mediante el uso de
cálculos matemáticos.
Anaranjado de metilo
1 2 3 4 5 6
(10mg/l)
Absorbancia 0 0.210 0.409 0.611 0.808 1.009
Concentración (mg/ml) 0 0,002 0.004 0.006 0.008 0.01
Concentración (mg/100ml) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
CONCENTRACIÓN (mg/ml)
10 mgx 1ml 0,01 mgx 1ml
1. x= =0,01 mg x= =0,002 mg/ml
1000 ml 5 ml
10 mgx 2ml 0,02 mgx 1 ml
2. x= =0,02 mg x= =0,004 mg /ml
1000 ml 5 ml
10 mgx 3 ml 0,03mgx 1 ml
3. x= =0,03 mg x= =0,006 mg/ml
1000 ml 5 ml
10 mgx 4 ml 0,04 mgx 1 ml
4. x= =0,04 mg x= =0,008 mg/ml
1000 ml 5 ml
10 mgx 5 ml 0,05mgx 1 ml
5. x= =0,05 mg x= =0,01mg/ml
1000 ml 5 ml
CONCENTRACIÓN (mg/100ml)
0,002 x 100 ml
1. x= =0,2 mg/ml
1 ml
0,004 x 100 ml
2. x= =0,4 mg/ml
1 ml
0,006 x 100 ml
3. x= =0,6 mg/ml
1 ml
0,008 x 100 ml
4. x= =0,8 mg/ml
1 ml
0,01 x 100 ml
5. x= =1 mg/ml
1 ml
Curva de Calibracion A. de metilo en gm/ml
1.2
1 1
0.8 0.8
ABSORVANCIA
0.6 0.6
0.4 0.4
0.2 0.2
0
0 0 0 0 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01
CONCENTRACIÓN mg/ml
Hallar la concentració n de la solució n desconocida, usando la curva de
calibració n y/o factor de calibració n, mediante el uso de una tabla.
Anaranjado de metilo Curva de Factor de
desconocido calibración calibración
Concentración (mg/ml) 0,00380mg/ml 0,0040mg/ml
Concentración (mg/100mL) 0,3mg/100ml 0,40mg/ml
Ubicar la concentració n de la solució n desconocida en el grá fico de la curva
de calibració n.
FACTOR DE CALIBRACIÓN
0,002mg/ml
1. F= =0,0095 2
0,210
0,004 mg/ml
2. F= =0,00977
0,409
0,006 mg/ml
3. F= =0,0098 1
0,611
0,008 mg/ml
4. F= =0,0099 0
0,808
0,01mg /ml
5. F= =0,0099 1
1,009
0,00952+0,00977+0,00981+0,00990+ 0,00991
fx= =0,00978
5
AD= 0,410
[ ] D=0,00978 x 0,410 = 0,0040
0,2 mg/ml
1. =0,95 23
0,210
0,4 mg/ml
2. F= =0,977 9
0,409
0,6 mg /ml
3. F= =0,98 1 9
0,611
0,8 mg /ml
4. F= =0,99 0 1
0,808
1mg/ml
5. F= =0,99 11
1,009
0,9523+ 0,977 9+0,981 9+0,990 1+0,991 1
fx= =0,9786
5
AD= 0,410 [ ] D=0,9786 x 0,410 = 0.401
Graficar en papel milimetrado los resultados de la tabla
Curva de calibración de A. de metilo en
mg/ml
1.2
1
Absorvancia
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0 0 0 0 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01
Concentración mg/ml
Interpretación:
En el cuadro muestra la concentració n de la solució n desconocida que es
0,0038mg/ml de la curva de calibració n con un 0,41.
6. CONCLUSIONES
Concluimos que las soluciones con capaces de absorber un poco de cantidad
en la luz.
A mayor cantidad, mayor es la absorció n de luz.
Despende de la longitud de onda en la que se encuentre para absorber
mayor o menor cantidad de luz, el punto má s alto se conoce como
“coeficiente de extinció n molar.
Según la concentración de un compuesto la absorbancia puede variar, por
ejemplo si agregamos un poco más de nuestro solvente que sería el agua
destilada la absorbancia variaría.
Podría decirse de alguna forma que la longitud de onda y la absorbancia son
proporcionales.
7. CUESTIONARIO
¿Qué entiende por coeficiente de extinción molar?
Es un pará metro que define cuá n fuertemente una sustancia absorbe la luz a una
longitud de onda dada por unidad de masa o por concentració n molar. También
puede ser una medida de la cantidad de luz absorbida por unidad de concentració n.
Específico por cada sustancia, la luz absorbida puede ser: Luz ultravioleta o luz
visible.
¿Qué se entiende por factor de calibración?
Es la relació n entre la concentració n y la absorbancia.
¿Cuándo se usa luz ultravioleta o luz blanca en el método de
espectrofotometría?
Se utiliza habitualmente en la determinació n cuantitativa de soluciones de iones
metá licos de transició n y compuestos orgá nicos muy conjugados. (Pérez, s.f.)
¿Qué es densidad óptica?
Es la absorbancia o denominada densidad ó ptica (OD).Se trata de una escala de colores
disponibles
¿Qué importancia tiene el tubo blanco y el tubo estándar?
El tubo blanco: es una forma de calibrar el aparato; es una muestra a medir la cual
no contiene nada de la sustancia que se busca cuantificar y sirve para ajustar el
aparato a cero (0) de la escala.
El tubo está ndar: se utiliza en algunas mediciones con el fin de hacer una
cuantificació n má s compleja, en el caso de que el reactivo no haga una reacció n
directamente proporcional a la cantidad de sustancia. (Nelson, 2006)
7. BIBLIOGRAFIA.
Nelson. (29 de Enero de 2006). Todoexpertos: tubo blanco, control,
está ndar. Obtenido de Todoexpertos:
https://www.todoexpertos.com/categorias/ciencias-e-
ingenieria/quimica/respuestas/1363718/tubo-blanco-control-estandar
Pérez, G. (s.f.). Espectrometría.com: Espectrometría ultravioleta-visible.
Obtenido de Espectrometría ultravioleta-visible:
https://www.espectrometria.com/espectrometra_ultravioleta-visible
