Idoneidad del sistema
A menos que se especifique algo diferente en la monografía, los parámetros de idoneidad del sistema
se determinan a partir del pico del analito a través de inyecciones repetidas de la solución de aptitud
(Debe especificarse en la metodología a validar el número de réplicas requeridas para evaluar cada
parámetro y en qué soluciones deben evaluarse). Resultados de análisis que no cumplan los requisitos
de idoneidad del sistema, se consideran fuera de especificación, generando la necesidad de intervenir
el método.
En el caso de no contar con especificaciones de idoneidad del sistema iniciar ensayos evaluando:
a. Factor de capacidad mínimo 2 (solo aplica durante el desarrollo y validación del método
analítico); este parámetro no se debe evaluar en el análisis de rutina, a no ser que se identifique que la
cuantificación de algunos de los picos de interés se vea afectada por picos de degradación no
identificados durante la validación.
b. Asimetría: parámetro a establecer durante la fase de desarrollo del método
c. RSD entre inyecciones: máximo 2%. A menos que se especifique algo diferente en la
monografía individual, se calcula con el resultado de 5 inyecciones repetidas del analito. Si el RSD es
mayor al 2%, se calcula con 6 inyecciones.
d. Platos teóricos: parámetro a establecer durante la fase de desarrollo del método.
e. Resolución entre el pico principal y posibles interferentes: parámetro a establecer durante la fase
de desarrollo del método (valor sugerido cuando la monografía no indique un valor, mínimo 1,5).
f. Realizar barridos en un rango de longitud de onda que permita identificar interferencias por parte
de la solución diluyente, entre otros. Para validaciones por UV la concentración de la muestra debe
arrojar absorbancias entre 0,2 y 0,8.
g. Para asegurar la idoneidad del sistema desde el inicio y hasta el final de montaje cromatográfico,
se realizan inyecciones intermedias cada que transcurren 12 horas del Estándar de repetibilidad y de
la preparación de adecuabilidad del sistema (en caso de existir) y al finalizar el montaje
cromatográfico; estas inyecciones deben cumplir a cabalidad con los parámetros de adecuabilidad
establecidos en el proceso de validación del método.
NOTA 1: Los valores de referencia de los numerales a al e pueden ser modificados y establecidos de
acuerdo a los resultados de la validación, soportando analíticamente el resultado en el informe de
validación
Proceso de validación
Selectividad
La selectividad del método se evalúa para garantizar y demostrar que éste es capaz de discriminar sin
interferencias entre el analito y sustancias de composición similar u otros productos que puedan estar
presentes en la muestra (excipientes). Si los resultados obtenidos no cumplen el criterio de aceptación,
se deben realizar ajustes en las pruebas planteadas.
La selectividad se evalúa sometiendo las muestras de placebo, placebo cargado y/o principio activo
(cuando aplique) a las mismas condiciones de estrés para cada ensayo y deben ser evaluadas contra
estándares, blanco y muestras preparadas en condiciones normales el día del análisis.
A partir de la evaluación de la selectividad del método se puede determinar el perfil de impurezas que
pudiese presentar el producto, para lo cual se establece este método como guía en el seguimiento
durante el estudio de estabilidad.
Si el análisis es realizado a través de un método cromatográfico en el equipo incluye arreglo de diodos,
se debe realizar el análisis de pureza del pico, comparando con la pureza obtenida del estándar.
Se definen las siguientes pruebas (muestras sometidas a estrés) para evaluar la selectividad del
método analítico:
• Adición de interferencias: Se aplica en aquellos analitos en los que se tienen identificadas las
posibles interferencias y estas se encuentran disponibles de forma aislada. En estos casos se
comprueba la selectividad comparando los resultados del análisis de muestras con o sin analito en
presencia o ausencia de dichas interferencias. Las interferencias que evaluar comprenden:
placebo, solución diluyente, compuestos relacionados (si se dispone de éstos), entre otros.
• Condiciones normales: Preparar estándares y muestras el mismo día del análisis, de acuerdo con
las condiciones nominales definidas.
• Degradación oxidativa: Preparar las muestras adicionando peróxido de hidrógeno para obtener
diferentes concentraciones. Si es necesario, someter a temperatura en un baño maría durante un
tiempo establecido según la naturaleza de la molécula a evaluar tiempo, tener en cuenta la
bibliografía recopilada, dejando claramente definidas las condiciones en el protocolo de validación.
• Degradación ácida: Preparar muestras adicionando ácido clorhídrico (HCl) para obtener
diferentes concentraciones. Si es necesario, someter a temperatura en un baño maría durante un
tiempo establecido según la naturaleza de la molécula a evaluar, posteriormente neutralizar con
NaOH; tener en cuenta la bibliografía recopilada, dejando claramente definidas las condiciones en
el protocolo de validación.
• Degradación alcalina: Preparar muestras adicionando hidróxido de sodio (NaOH) a diferentes
concentraciones. Si es necesario, someter a temperatura en un baño maría durante un tiempo
establecido según la naturaleza de la molécula a evaluar, posteriormente neutralizar con HCl tener
en cuenta la bibliografía recopilada, dejando claramente definidas las condiciones en el protocolo
de validación.
• Fotólisis: Preparar las muestras y exponerlas a diferentes tiempos a la lámpara de luz ultravioleta
y/o luz solar directa o indirecta, teniendo en cuenta la bibliografía recopilada. Si es factible se puede
evaluar la muestra directamente.
• Termólisis: Preparar las muestras y exponerlas en estufa a temperaturas entre 40 °C y 70 °C a
diferentes tiempos, teniendo en cuenta la bibliografía recopilada. Se sugiere exponer las muestras
directamente por un tiempo más prolongado, con el fin de obtener mayor conocimiento del
comportamiento del analito frente a la temperatura durante el estudio de estabilidad.
Adicionalmente, si se cuenta con el producto terminado en su material de empaque definitivo, se
sugiere someterlo a un periodo de entre dos o tres semanas a condiciones de estabilidad acelerada
(siempre y cuando la programación lo permita). Luego de trascurrido este tiempo, preparar las
muestras según el método de análisis definido.
Analizar todas las muestras como se describe a continuación:
• Para todas las condiciones enunciadas anteriormente, preparar dos estándares, dos muestras por
cada condición, muestras de principio activo, placebo cargado y/o producto terminado (cuando
aplique) a la concentración definida para el método y muestras de placebo preparado con relación
al peso equivalente, según la formula consolidada. Así mismo, evaluar la interferencia generada
por la solución diluyente y blanco para cada caso.
• Después de tratar la muestra y placebo bajo las condiciones descritas, continuar según el método
definido y realizar la cuantificación correspondiente, determinar la idoneidad del sistema (si aplica)
y registrar los cromatogramas, espectros o gráficos (según aplique) para cada caso.
• Utilizar los datos de las muestras donde la degradación no haya superado el 30%. En caso de que
la degradación haya superado este porcentaje, es necesario verificar la presencia del activo y de
posibles compuestos de degradación o realizar ajustes a la concentración de los agentes
degradantes, de tal modo que se alcance, en lo posible, una degradación inferior al 30%. Tener en
cuenta que la evaluación del placebo no se hace cuantitativa. Excepto casos específicos
(conservantes, sales), solo es usado para verificar interferencias con los picos de interés. Si no se
obtiene la resolución de las interferencias, es necesario realizar los ajustes necesarios al método.
• Reportar los cromatogramas de cada condición, teniendo en cuenta una escala que permita la
observación de picos de forma clara y legible, con su respectiva identificación. Comparar con
solución diluyente y placebo para comparar picos interferentes.
Después de la evaluación de la selectividad se debe reportar el perfil de las impurezas halladas
durante las degradaciones, e indicar en qué condiciones son producidas. Este perfil debe estar
incluido en la metodología de análisis para el seguimiento durante el análisis del producto en el estudio
de estabilidad.
Criterio de aceptación
Método por HPLC - El método debe evitar interferencias por parte de la fase móvil, solución diluyente,
placebo, otros activos y productos de degradación o compuestos relacionados, en el tiempo de
retención del pico principal con una resolución cromatográfica ≥ 1,5 y pureza de pico > 0,99. Las
condiciones evaluadas deben presentar un porcentaje de degradación inferior al 30%.
Otros métodos - La interferencia generada por la solución diluyente, el placebo u otra interferencia no
debe ser superior a 2%. Las condiciones evaluadas deben presentar una degradación inferior al 30%.
Robustez
Antes de consolidar la metodología de análisis, se deben establecer los márgenes en los cuales el
método es robusto, por lo que se deben tener en cuenta las variaciones que puedan influir en las
condiciones experimentales especificadas. Las variaciones se hacen dependiendo del método y el
producto correspondiente.
Se deben realizar modificaciones relacionadas con: longitud de onda, pH, proporción de solventes en
la fase móvil, concentración de sales en el buffer, flujo, columna cromatográfica (fabricante, lote,
antigüedad, longitud de la columna), temperatura del análisis, tipos de papel filtro (en caso de contar
con más de una referencia), volumen de inyección y preparación de muestra (extracción, tiempo de
agitación, solución diluyente). Este parámetro puede o no ser evaluado, de acuerdo con la revisión
previa de las características del activo y al margen de tolerancia que se le desee dar a variables antes
relacionadas.
Los ensayos se deben hacer de forma independiente o mediante la aplicación del diseño experimental
propuesto por Youden-Steiner para la determinación de los métodos y condiciones requeridos para el
análisis. Tener en cuenta que, para el último caso, el número de factores a evaluar debe ser mínimo de
tres, con un total de ocho experimentos.
Preparar dos estándares y tres muestras a la concentración nominal de trabajo; teniendo en cuenta las
condiciones que son evaluadas. Evaluar cada uno de los ensayos, haciendo los ajustes necesarios al
método de análisis preliminar y determinar el porcentaje de principio activo en cada muestra; así como
la idoneidad del sistema (si aplica).
Criterio de aceptación
Todos los parámetros de idoneidad del sistema deben cumplir con los requisitos establecidos para el
método en prueba. Resultados inferiores en valor absoluto al resultado de la expresión (s*√2), indican
que los cambios realizados al método analítico no influyen significativamente. (s= desviación estándar
de la repetibilidad del método).
Estabilidad de la muestra en solución
Preparar dos muestras de placebo cargado o producto terminado y dos estándares a la concentración
nominal de trabajo. Evaluar tanto muestras como estándares inmediatamente después de su
preparación frente a estándares recién preparados y luego someter dos muestras y dos estándares a
condiciones de refrigeración y otras dos muestras y dos estándares a condiciones ambientales.
Analizar cada solución durante diferentes periodos de tiempo con estándar recién preparado y
determinar el porcentaje de recuperación en cada periodo, así como la idoneidad del sistema (si aplica).
Para la evaluación de la estabilidad de la muestra en solución por medio de técnicas por UV-Visible,
tener en cuenta el uso del mismo blanco para cada condición y periodo de tiempo.
Criterio de aceptación
La respuesta obtenida para la muestra y el estándar en cada tiempo t en condiciones de
almacenamiento ambiente y de refrigeración, presentan un porcentaje de diferencia con respecto al
valor inicial máximo de 2,0%.
Linealidad
La linealidad puede evaluarse con estándar, placebo cargado o producto terminado.
Realizar una serie de por lo menos cinco niveles de concentración, los cuales deben estar
proporcionalmente espaciados, de forma tal que se cubra un rango de trabajo de dos niveles por encima
y dos niveles por debajo de la concentración nominal de trabajo. Cuando se trabaja con la metodología
de placebo cargado, la cantidad de placebo para cada uno de los niveles debe conservarse de acuerdo
con equivalente del 100%.
Preparar tres soluciones de muestras madres independientes, a partir de las cuales se realizan las
diluciones correspondientes a cada nivel de concentración; y dos estándares a la concentración
nominal de trabajo. Evaluar bajo el método descrito y determinar la idoneidad del sistema (si aplica).
Relacionar la respuesta del instrumento (áreas, alturas, absorbancias, entre otros) versus la
concentración, realizar un análisis de varianza (ANOVA) con una confianza del 95% (α=0,05 y n-2
grados de libertad), con el fin de comprobar la bondad de ajuste de los datos a un modelo lineal.
Adicionalmente, realizar una prueba t-Student para estimar los intervalos de confianza para la
pendiente y el intercepto con una confianza del 95% (α=0,05 y n-2 grados de libertad).
Criterio de aceptación
Métodos cromatográficos: Coeficiente de correlación (r): ≥ 0,999; coeficiente de determinación (r2) ≥
0,998.
Métodos no cromatográficos: Coeficiente de correlación (r) ≥ 0,99, coeficiente de determinación (r2) ≥
0,98.
Pendiente (b) ≠ 0 Intercepto (a) valor ideal 0
Test de linealidad para la pendiente: texp>t tabla (α=0,05 n-2) Test para el intercepto: texp< t tabla
(α=0,05 n-2) Coeficientes de variación de los factores de respuesta f < 5%
Test de normalidad de los residuales del ANOVA: Fexp >F tabulado
Si la linealidad no cumple la prueba “test para el intercepto” se puede trabajar la cuantificación del activo
o activos, realizando una curva de calibración con estándar; que contenga como mínimo 3 niveles de
concentración sucesivos acorde a la necesidad del rango de cuantificación.
Exactitud
La exactitud se puede evaluar con placebo cargado o producto terminado. Método de placebo cargado
La exactitud puede ser calculada con los datos obtenidos durante la prueba de linealidad. Si no se
cuentan con estos datos, se debe realizar una serie de por lo menos tres niveles de concentración, los
cuales deben estar proporcionalmente espaciados, de forma tal que el rango de concentraciones
incluya como mínimo una concentración por encima y una concentración por debajo del contenido
teórico de principio activo (100%). La cantidad de placebo para cada nivel debe conservarse de acuerdo
con equivalente del principio activo de la formula consolidada.
Preparar dos estándares y tres muestras por cada nivel de concentración y evaluar bajo el método
descrito, determinando adicionalmente la idoneidad del sistema (si aplica). Calcular el porcentaje de
recuperación y la desviación estándar para cada nivel de concentración. Tener presente que si la
potencia del principio activo o producto está por debajo o por encima del contenido teórico (100%), se
debe ajustar al valor correspondiente.
Realizar una prueba t-Student con una confianza del 95% (α=0,05 y n-1 grados de libertad) para
determinar si el valor medio encontrado y el valor considerado verdadero no difieren significativamente
para el grado de probabilidad determinado. Adicionalmente, realizar el test Cochran (G) evaluando si el
factor concentración tiene alguna influencia en los resultados a través del test de igualdad de varianza
de varios grupos muéstrales del mismo tamaño.
Criterio de aceptación
Porcentaje de recuperación promedio: Entre 98,0% y 102,0% y %CV: < 2,0%.
Igualdad de varianzas test de Cochran (G): G exp< G tablas (α=0.05; k=3; n=3), indicando que el factor
concentración no influye en la variabilidad de los resultados.
Si t exp< t tablas (α=0,05 n-1), no existe diferencia significativa entre la recuperación media y 100, por
lo que el método es exacto.
Método de adición de estándares
Utilizar este método cuando no es posible preparar un placebo que no contiene el analito o cuando se
trabaje con producto terminado.
Realizar una serie de por lo menos tres niveles de concentración, los cuales deben estar
proporcionalmente espaciados por encima del 100%. Preparar tres soluciones madre de producto
terminado, de cada una de las madres hacer las diluciones necesarias para obtener cuatro muestras a
la concentración nominal de trabajo.
Adicionar cantidades conocidas de estándar a tres de estas muestras para obtener tres niveles de
concentración diferentes y un nivel a la concentración nominal de trabajo.
Evaluar bajo el método descrito, determinando la idoneidad del sistema (si aplica), calcular el promedio
y la desviación estándar para cada nivel de concentración.
Hallar las respuestas experimentales netas, restando las respuestas obtenidas en las muestras sin
adición de estándar de las respuestas de cada nivel de concentración con la adición de estándar.
Usar la recta de calibración obtenida en la linealidad, para la interpolación de los datos y la
determinación del porcentaje de recuperación.
Realizar una prueba t-Student con una confianza del 95% (α=0,05 y n-2 grados de libertad) para
determinar si el valor medio encontrado y el valor considerado verdadero no difieren significativamente
para el grado de probabilidad determinado.
Criterio de aceptación
Porcentaje de recuperación promedio para valoración: Entre 98,0% y 102,0% y %CV: < 2,0%.
Si t exp< t tablas (α=0.05 n-2), no existe diferencia significativa entre la recuperación media y 100, por
lo que el método es exacto.
Precisión
La precisión se evalúa mediante las pruebas de Repetibilidad del método, la Repetibilidad instrumental
y precisión intermedia
Repetibilidad del método
Preparar dos estándares y seis muestras a la concentración nominal de trabajo; una de estas muestras
replicarlas seis veces y emplearlas para el análisis de repetibilidad instrumental. Analizar las muestras
bajo el método descrito y determinar la idoneidad del sistema (si aplica).
Determinar la repetibilidad del método, hallando el coeficiente de variación y los intervalos de confianza
de las respuestas obtenidas.
Criterio de aceptación
El coeficiente de variación debe ser menor a 2,0%.
Los valores individuales y el valor de la media deben encontrarse dentro del intervalo de confianza.
Repetibilidad instrumental
Determinar la variabilidad de una sola muestra analizada repetidamente seis veces. Ver repetibilidad
del método, calcular el coeficiente de variación de las respuestas obtenidas.
Criterio de aceptación
El coeficiente de variación de las respuestas obtenidas debe ser menor que el coeficiente de variación
del método dividido la raíz cuadrada de dos.
Precisión intermedia
Esta prueba debe ser realizada por dos analistas diferentes, en días diferentes y en equipos
diferentes, siempre y cuando la metodología permita el cambio de equipo.
Cada analista debe preparar dos estándares y seis muestras a la concentración nominal de trabajo. De
ser posible analizar la misma muestra y/o el mismo lote. Analizar bajo el método descrito, determinando
la idoneidad del sistema (si aplica) y determinar el coeficiente de variación de las respuestas obtenidas.
Criterio de aceptación
El coeficiente de variación debe ser menor a 2 veces el %CV de la repetibilidad del método y el %CV
para cada grupo de análisis debe ser menor a 2,0%.
Límite de Detección y Cuantificación
Se evalúa en aquellos casos en que la metodología sea utilizada en pruebas de detección y
cuantificación de impurezas o productos de degradación. Ver numeral 4.3.3 Compuestos relacionados.
Metodología para la transferencia
Valoración
• Determinar la homogeneidad de varianza para las dos muestras independientes con la prueba de
F Fischer y hallar el coeficiente de variación para cada análisis individual y el global de los dos
análisis. Se calcula el F como la razón de la varianza mayor sobre la menor.
• Dependiendo del resultado de la prueba F Fischer (Homogeneidad de las varianzas), determinar la
homogeneidad de las medias de las dos muestras independientes con la prueba de t-Student a dos
colas y probabilidad del 95% (α=0,05).
Compuestos Relacionados
• Comparar la diferencia absoluta de las medias para las dos muestras independientes.
