UNIDAD DE APRENDIZAJE: Virología
PRÁCTICA 4: HEMAGLUTINACIÒN E No. DE EQUIPO: 03
INHIBICIÓN DE LA INTEGRANTES:
HEMAGLUTINACIÓN ● Cornejo Roblez Arantza Guadalupe
● Mejia Valdes Raúl Alejandro
● Secundino Hernández Jazmin Naomi
OBJETIVO
● Conocer el concepto de hemaglutinación, así como sus tipos.
● Realizar la hemaglutinación viral.
● Identificar la diferencia entre la hemaglutinación y la inhibición de la
hemaglutinación.
DEFINICIONES
Hemaglutinina: La hemaglutinina (H) es una glicoproteína muy inmunogénica, los
anticuerpos específicos que se generan en el hospedero neutralizan el reconocimiento de
los receptores a nivel celular.
Anticuerpos heterófilos: Son anticuerpos tipo IgM que aglutinan hematíes de otras
especies de mamíferos. Aparecen en la fase aguda de la infección con un pico a las 2-5
semanas. Es muy útil para el diagnóstico en niños mayores, adolescentes y adultos, ya
que la sensibilidad es de 85-90%, 50% en la primera semana y un 60-90% en la segunda
y tercera semana de enfermedad y una especificidad de 98-100%.
Gemación viral : El nuevo virus ensamblado «brota» de la célula anfitriona. Durante la
gemación, el nuevo virus acapara parte de la envoltura exterior de la célula. A esta
envoltura, que actúa como recubrimiento, le brotan combinaciones de proteína y azúcar,
conocidas como glicoproteínas
1.1. HEMAGLUTINACIÓN (HA)
La hemaglutinación es la aglutinación de los hematíes o glóbulos rojos. Se trata de una
respuesta biológica común frente a determinados microorganismos, como los virus. Se
debe a la presencia de antígenos en los eritrocitos, capaces de reaccionar con
anticuerpos o bien con proteínas específicas de algunos microorganismos
(hemaglutininas).
Los virus que tienen envoltura poseen en su superficie moléculas llamadas
hemaglutininas que pueden interaccionar con el ácido siálico de la glicoproteinas de
superficie de los glóbulos rojos de determinadas especies animales. La presencia de
estos virus, los eritrocitos se agrupan o “aglutinan”, la capacidad hemaglutinante es
independiente de la infectividad vírica. Otra categoría de aglutinación que involucra la
aglutinación espontánea de los eritrocitos por ciertos virus, es la reacción de
hemaglutinación viral, la cual puede inhibir de manera específica en presencia de
anticuerpos antivirales. Por lo tanto, la hemaglutinación viral puede emplearse para medir
la cantidad de virus o para determinar, por inhibición homologa, el título de los anticuerpos
dirigidos en contra de los virus hemaglutinantes.
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Hemaglutinación e Inhibición de hemaglutinación
La hemadsorción es la adherencia de eritrocitos a una superficie, en el caso de los virus a
las células infectadas. Solo se da en virus con envoltura puesto que el fenómeno requiere
que las hemaglutininas de la envoltura de los virus estén insertadas en la membrana de la
célula infectada antes de que el virus salga por gemación.
Hemaglutinación
1.1.1 TIPOS DE HEMAGLUTINACIÓN
a) Hemaglutinación directa
La presencia de antígenos en la superficie de los glóbulos rojos se puede detectar por la
hemoaglutinación producida cuando se añade un antisuero con anticuerpos frente a
dichos antígenos. Esta técnica se emplea habitualmente para la identificación de los
grupos sanguíneos y Rh, por lo cual la sangre heparinizada se le añaden los antisueros
correspondientes: anti-A, anti-B o anti-AB (todos ellos anti-Rh negativos).
La aglutinación se muestra positiva cuando los glóbulos rojos posean la especificidad del
antisuero añadido. De igual manera se procede con antisueros anti-Rh para la
determinación de los distintos grupos Rh.
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Aglutinación con suero
Grupo sanguíneo
Anti-A Anti-B Anti-AB
O - - -
A + - +
B - + +
AB + + +
Determinación de grupo sanguíneo
b) Hemaglutinación indirecta (HAI)
También llamada hemaglutinación reversa pasiva, se basa en la propiedad que tienen los
anticuerpos de producir aglutinación específica en presencia de glóbulos rojos
sensibilizados con los correspondientes antígenos. En el suero existen anticuerpos
inespecíficos (heterófilos) que son capaces de aglutinar glóbulos rojos de distintas
especies. Su presencia se investiga enfrentando el suero con GR no sensibilizados. Los
anticuerpos interferentes se eliminan mediante tratamiento con 2-mercaptoetanol.
1.2. HEMAGLUTINACIÓN VIRAL
Este fenómeno fue descrito por primera vez por Hirst en 1941, quien observó en un embrión de
pollo la aglutinación de glóbulos rojos en un vaso sanguíneo roto, mientras realizaba pases de virus
de influenza en el líquido alantoideo. Hirst reconoció la importancia de este hallazgo y describió la
hemoaglutinación como un método para el ensayo de virus.
Hemoaglutinación es la propiedad que tienen ciertos virus para unir y aglutinar eritrocitos de
mamíferos y aves, debido a las proteínas que poseen en su capa externa. Algunos virus son
capaces de aglutinar los glóbulos rojos. La hemaglutinación (HA) es la unión de los eritrocitos
producida por el virus o por alguna estructura del mismo. El resultado visible de la HA viral es un
patrón formado en el fondo del pozuelo por los eritrocitos unidos por la hemaglutinina viral.
Está hemoaglutinación inducida por virus puede usarse para facilitar la identificación de un virus
desconocido.
1.2.1. MECANISMO DE HEMAGLUTINACIÓN
La actividad enzimàtica de las proteínas virales (hemaglutininas) produce hemaglutinaciòn en la
cual los eritrocitos se unen por medio de enlaces no covalentes. Se ha demostrado que el glóbulo
rojo contiene cerca de 300 sitios en los cuales se puede absorber un virus.
Muchos virus contienen proteínas en su capa externa que los capacitan para aglutinar glóbulos
rojos de varias especies. En influenza y algunos paramixovirus, la hemaglutinación de la superficie,
que es una glicoproteína, se fija al glóbulo rojo que posee receptores complementarios
1.2.2. VIRUS HEMAGLUTINANTES
Son microorganismos hemaglutinantes los ortomixovirus y paramixovirus, alfavirus, flavivirus y
bunyavirus, así como algunos adenovirus, rinovirus, parvovirus, y coronavirus.
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Familia Géneros o especies Hematíes afectados
Adenoviridae La mayoría de las especies Mono y/o rata, 37°C
Poxviridae Orthopoxvirus Pollo, 37°C
Parvoviridae La mayoría de las especies Cobayo, hámster, cerdo, humano, mono, 4°C.
Togaviridae Alfavirus Ganso, paloma, pollito; pH y Tª críticos.
Flaviviridae Flavivirus Humano
Orthomyxoviridae Influenza A Pollito, humano, cobayo, 4°C.
Paramyxoviridae Parainfluenza (E. de Newcastle) Pollito, humano, cobayo, 4°C
Coronaviridae Varias especies Rata, ratón, pollito
Bunyaviridae Varias especies Ganso; pH crítico.
Rhabdoviridae Rabia Ganso, 4°C.
Reoviridae Reovirus, Rotavirus Humano
Virus Hemaglutinantes
1.2.3 USO DE LA HEMAGLUTINACIÓN
1.2.3.1. INVESTIGACIÓN VIRAL
1. El diagnóstico para la identificación de un virus aislado.
2. Sirve para titular partículas virales activas o inactivas en una suspensión.
3. Permite purificar y concentrar virus.
4. En investigación, es de gran importancia biológica en la unión de los virus a células
hospedadoras, su liberación y posibles mecanismos de infección.
5. La prueba en placa permite determinar la presencia de virus hemaglutinantes en el líquido
infectado.
La característica principal de la técnica de hemoaglutinación viral es la rapidez, además del bajo
costo de los reactivos y la simplicidad de su realización, por lo que determina su fácil adaptación al
laboratorio de escasa infraestructura.
1.2.3.2. INVESTIGACIÓN EPIDEMIOLÓGICA
Para ejercer en forma eficiente el control o erradicación de una enfermedad, es imprescindible
realizar el diagnóstico preciso y oportuno de la misma.
Descubrir anticuerpos es importante para documentar la prevalencia de una infección en individuos
y poblaciones. En México, se instituyeron campañas de control y erradicación de enfermedades de
carácter epidémico, las cuales están normalizadas.
1.2.4. PRESENCIA DE FALSOS POSITIVOS
A pesar de que el ensayo de HA/IHA es considerado como altamente específico debido a que se
desechan las reacciones de hemaglutinación falsas (que no son inhibidas por el antisuero), las
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suspensiones de GR preparadas sin cuantificar por espectrofotometría pueden introducir
variaciones en la lectura de los títulos hemoaglutinante, lo que contribuye a generar resultados
falsos positivos.
La aparición de “falsos positivos” pueden ser debidas a:
● Mala calidad del suero.
● Reacciones cruzadas con anticuerpos producidos frente a antígenos relacionados.
1.3 DIFERENCIAS ENTRE UNA SEDIMENTACIÓN ERITROCITARIA Y UNA
HEMAGLUTINACIÓN
1.3.1 SEDIMENTACIÓN ERITROCITARIA
Es la precipitación de los eritrocitos (glóbulos rojos) en un tiempo determinado (1-2 horas),
que se relaciona directamente con la tendencia de los glóbulos rojos hacia la formación de
acúmulos (pilas de monedas) así como a la concentración plasmática de proteínas
(globulinas y fibrinógeno).
La capacidad y la velocidad de formar estos acúmulos depende de la atracción de la
superficie de los glóbulos rojos; esto se va a medir mediante la VSG (velocidad de
sedimentación globular), la cual consiste en Consiste en medir la velocidad con la que
sedimentan (decantan, caen) los glóbulos rojos o Eritrocitos de la sangre, provenientes de
una muestra de plasma sanguíneo(Citratado o con EDTA) , en un periodo determinado de
tiempo, habitualmente una hora.
Los factores que afectan la VSG son:
● Factores plasmáticos: Los más importantes son las Proteínas plasmáticas,
especialmente el Fibrinógeno y las globulinas (sobre todo alfa-1-Antitripsina,
Haptoglobina, etc.). Cabe mencionar que la albúmina posee un escaso efecto
sobre la VSG. Se cree que estas proteínas disminuyen la carga electrostática de la
membrana de los hematíes, disminuyendo la repulsión entre ellos y favoreciendo
su agregación.
● Factores físicos: Sobre todo la morfología eritrocitaria y el VCM, observándose que
a mayor tamaño de los hematíes, mayor velocidad de sedimentación.
● Factores ajenos a la sangre: Temperatura, Hemólisis, tiempo transcurrido desde la
extracción o limpieza de material.
● Inflamación: Uno de los efectos sistémicos que tiene el proceso inflamatorio, es un
aumento de la VSG.
Es un marcador inespecífico, no relacionado con ninguna enfermedad en concreto, cuya
elevación implica procesos inflamatorios, infecciosos o neoplásicos. Por otra parte, sus
valores son ampliamente variables por múltiples factores aún mal establecidos (se sabe
que aumenta con la edad), por lo que su interpretación debe estar en el contexto de la
clínica y el resto de pruebas analíticas. Existen tablas de valores normales máximos por
edad y sexo.
1.3.2 HEMAGLUTINACIÓN
Es la tendencia de los hematíes a formar agregados en forma de "pilas de moneda". Estos
sedimentan de forma muy lenta por lo que van a determinar la velocidad de todo el
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proceso. Se trata de una respuesta biológica común frente a determinados
microorganismos, como los virus, y se emplea rutinariamente en técnicas de tipado de
grupos sanguíneos o en la determinación de cargas virales. La hemaglutinación se debe a
la presencia de antígenos en los eritrocitos, antígenos capaces de reaccionar con
anticuerpos o bien con proteínas específicas de algunos microorganismos (entre las que
destacan las hemaglutininas). Hay hemaglutinación indirecta (pasiva), hemaglutinación
directa y hemaglutinación viral.
Inhibición de la hemaglutinación:
La inhibición de la aglutinación de los eritrocitos recubiertos con antígeno por el antígeno
homólogo es un método sensible y específico para la identificación de pequeñas
cantidades de antígeno soluble en la sangre o en otros líquidos de los tejidos. El principio
de este análisis es que, el anticuerpo incubado previamente con antígenos homólogos
solubles o de reacción cruzada, es «inactivada» cuando se incuba con eritrocitos
recubiertos de antígeno.
Este método de inhibición de la hemaglutinación ha resultado muy útil para la
identificación de HBsAg en la hepatitis y para la identificación del antígeno factor VIII en
la hemofilia y trastornos afines de la coagulación.
Algunas de las substancias que se absorben para la hemaglutinación:
• Antígenos de Escherichia coli.
• Antígenos de Yersinia.
• Lipopolisacáridos de Neisseria meningitidis.
• Antígenos de Toxoplasma.
• Derivado proteico purificado (DPP).
• Endotoxina de especies de Micoplasma.
• Virus.
• Antibióticos, especialmente penicilina.
• Ovalbúmina.
• Albúmina sérica bovina.
• Haptenos.
• Antígenos de polen.
• Gonadotropina coriónica.
Al realizar esta técnica se debe poner especial atención en la posible interferencia de
anticuerpos heterófilos, los cuales pueden aglutinar inespecíficamente a los eritrocitos.
Estos son anticuerpos naturales, no adquiridos por inmunización a los glóbulos rojos
utilizados, pero capaces de aglutinarlos. Generalmente son del tipo IgM. Cuando dicha
interferencia se presenta, se deben absorber las muestras de suero a menudo con
eritrocitos lavados no cubiertos por antígeno, para eliminar los anticuerpos heterófilos o
ser tratados con 2-Mercaptoetanol, el cual actúa sobre la cadena J de las IgM
inactivándolas.
Las ventajas de emplear eritrocitos para recubrirlos con antígeno son su disponibilidad
inmediata, la sensibilidad como indicadores y la posibilidad de almacenamiento
prolongado a 4°C. Se emplea el grupo O para estas pruebas, puesto que no presenta
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antígenos de superficie, además que el grupo O tiene aglutininas anti-A y anti-B, Si la
sangre aglutina con anti-A, el grupo sanguíneo es A; si aglutina con anti-B, el grupo
sanguíneo es B; si lo hace con anti-A y anti-B, el grupo sanguíneo es AB, y si no aglutina
con ninguno de los dos antisueros, el grupo sanguíneo es O. La aglutinación ocurre
cuando las aglutininas se unen a dos eritrocitos a la vez, lo que hace que éstos se
agrupen o aglutinen. Además de la aglutinación, la unión aglutinina-aglutinógeno produce
hemólisis por lesión de la membrana celular del eritrocito.
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en_campo_-_giron,_j.pdf
MATERIALES Y REACTIVOS
● 1 tubo lila con EDTA ● Sangre de pollo/humano tipo O+
● Centrífuga ● Solución salina fisiológica
● 1 micropipeta de 50 μL ● Cepa de Newcastle
● 1 micropipeta de 1000 μL
● 12 tubos de ensaye de 16x150 mm
● Gradilla
● 1 Espejo
● 1 Cronómetro
● Puntas de micropipetas azules y
amarillas.
PROCEDIMIENTO
Preparación de Glóbulos Rojos Lavados:
1. Extraer la sangre de pollo (previamente vacunado); y conservarla en un tubo con
anticoagulante.
2. Centrifugar a 1500 rpm por 5 min.
3. Eliminamos el sobrenadante (plasma).
4. Agregar al tubo (Paquete Celular) solución salina fisiológica y mezclar.
5. Volver a centrifugar a 1500 rpm por 5 min.
6. Luego, tomamos de 0.7 mL de glóbulos rojos del paquete celular y lo
7. Eliminamos el sobrenadante y volvemos a repetir el proceso de lavado
Reacción de Hemoaglutinación:
1. Colocamos 8 tubos en una gradilla, colocando al primero 180 μL de SSF y del tubo 2 al 8
añadir 100 μL de Suero Fisiológico (figura 1).
2. Con una pipeta tomar 20 μL de cepa de Newcastle y depositarla en el tubo No. 1 (dilución
1:5).
3. Repetir hasta obtener las diluciones 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320, 1:640, 1:1280 (el tubo
N° 09 es el control se le añadirá 0.5 mL de la cepa New Castle).
4. Tomamos 100 μL del tubo 01 y depositarlo en el tubo Nº 02, (dilución 1:10).
5. A cada tubo colocamos 100 μL de los glóbulos rojos lavados al 1% (incluyendo el tubo
control).
6. Dejamos reposar al medio ambiente durante 15 a 20 minutos.
7. Pasado el tiempo, colocamos debajo de la gradilla un espejo, para observar si hay
“hemaglutinación positiva” (formación de una malla delgada, gris) o hemoaglutinación negativa (se
observa un punto rojo).
8. La última dilución en la cual aparece HA es el título del virus (este es el inverso de dicha
dilución).
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