BACULOVIRUS
• Baculoviridae: familia de virus infectivos para
invertebrados.
• Genoma: ADN de doble cadena, circular, dentro
de una càpside recubierta de envoltura viral.
• Estructuralmente definida por una simetría
cilíndrica.
• Se caracteriza por ensamblar los viroides maduros
en el núcleo celular.
• 2 Géneros: NUCLEOPOLYHEDROVIRUS y
GRANULOVIRUS
BACULOVIRUS: NUCLEOPOLYHEDROVIRUS
• Contiene uno o
más
nucleocápsides por
envoltura.
• Los viriones
(incluyendo la
envoltura) están
adicionalmente
envueltos en una
matriz de
POLIHEDRINA.
• Contienen
múltiples viriones
por CUERPO DE
OCLUSIÓN.
BACULOVIRUS: GRANULOVIRUS
• Contiene una única nucleocápside por
envoltura.
• Los viriones están envueltos en una matriz de
GRANULINA.
• Contienen un único virión por CUERPO DE
OCLUSIÓN.
BACULOVIRUS: ciclo de “vida”
• Los baculovirus presentan dos formas distintas
durante su ciclo de vida.
1. Los virus derivados ocluidos (ODV):
responsables de la infección primaria del
hospedero y están presentes en una matriz
proteica (polihedrina o granulina).
2. Los virus de gemación (BV) budded virus: se
liberan de las células hospederas durante la
infección secundaria.
BACULOVIRUS: ciclo de “vida”
• La infección inicial se
produce cuando el
hospedero, un insecto
susceptible, se alimentan de
las plantas que están
contaminadas con la forma
de oclusión del virus.
• La proteína de la matriz se
disuelve en el medio alcalino
del tracto digestivo del
hospedero, liberando los
ODVs que luego se fusionan
con la membrana celular del
epitelio columnar del
intestino del hospedero y se
introducen en la célula en
endosomas.
BACULOVIRUS: ciclo de “vida”
• Las nucleocápsides escapan de los endosomas y son
transportados al núcleo (posiblemente mediados por
filamentos de actina).
• La transcripción y replicación viral se produce en el núcleo de
la célula y nuevas partícula BV se desprenden por gemación
desde el lado vasolateral que propagan la infección
sistemáticamente.
• Durante la gemación, las partículas BV adquieren partes de la
membrana de la célula hospedera con glicoproteínas virales
expresadas.
BACULOVIRUS: ciclo de “vida”
• La infección por baculovirus puede dividirse en 3
fases:
1. Temprana (0 – 6 horas de la infección).
2. Tardìa (6 – 24 horas de la infecciòn).
3. Muy tardía (18 – 24 a 72 horas).
La forma BV se produce en la fase tardía, mientras
que la ODV lo hace en la fase muy tardía.
El ODV adquiere la envoltura a partir del núcleo de
la célula hospedera y es embebida en la matriz de
proteínas del cuerpo de oclusión.
Estos cuerpos de oclusión son liberados cuando las
células se lisan para propagar la infección a otros
hospederos.
La lisis extensiva de las células con frecuencia hace
que el insecto hospedero literalmente se derrita.
• Los baculovirus exhiben un
tropismo muy específico con la
especie de invertebrado que
infectan, con màs de 600 especies
hospederos descritos.
• Los hospederos más comunes son
las larvas de las polillas
(Phthorimaea operculella) “polilla
de la papa”.
• Pueden también infectar moscas,
mosquitos y camarones.
• No se conocen virus de esta
familia que infecten células de
mamíferos o de otros animales
vertebrados.
• Poco antes de la muerte, los
insectos infectados se
vuelven pálidos y flácidos; y
frecuentemente suben a las
partes apicales de las plantas
donde mueren.
• El cuerpo del insecto se
rompe liberando millones de
cuerpos de oclusión, que
contaminan el follaje inferior
permitiendo la transmisión a
otras larvas susceptibles.
• El suelo representa el mayor
reservorio de virus en el
ambiente, los cuerpos de Larvas recién
eclosionadas
oclusión pueden persistir en
suelos ácidos o neutros durante
meses o años antes de que sean
transportados a la superficie de
las hojas por el impacto de gotas
de lluvia, corrientes de aire, o
mediante el movimiento de los
artrópodos desde la superficie
del suelo.
• Los cuerpos de oclusión pueden
aislarse de muestras de suelo
mediante la técnica de Richards
y Christian (1999)
Insecticidas basados en los Baculovirus
(ventajas)
• Los baculovirus tienen varias características únicas que han
generado interés en su uso como insecticidas biológicos.
Dichas características incluyen:
• Alta patogenicidad y virulencia.
• Especificidad al hospedero, con muy bajo riesgo para los
insectos que no son objeto del tratamiento.
• Ausencia de residuos tóxicos en frutos y verduras tratadas.
• Fácil aplicación mediante equipos convencionales de
pulverización.
• Estabilidad en almacenamiento (varios años).
Insecticidas basados en los Baculovirus
(desventajas)
• Algunas limitaciones incluyen:
• La necesidad de emplear sistemas costosos de producción in
vivo.
• Oportunidades comerciales limitadas (mercados
especializados).
• Baja persistencia en condiciones muy soleadas
• Necesidad de aplicar cuando la mayoría de los individuos de la
población plaga este en los estadios tempranos, ya que los
estadios tardíos son más resistentes a la infección.
APLICACIONES DEL INSECTICIDA
• En Brasil, el nucleopoliedrovirus de Anticarsia gemmatalis(AgMNPV) es producido por
varias empresas privadas sujetas a controles de calidad realizados por una agencia
gubernamental (EMBRAPA).
No obstante, en este país el control de A. gemmatalis en soya mediante aplicaciones
de baculovirus actualmente se lleva a cabo sobre un área de ~1.5 millones de
hectáreas por año, lo que le convierte en el virus insecticida más importante del
mundo.
Uno de los virus más efectivos es el nucleopoliedrovirus de Spodoptera exigua, una
plaga polífaga que consume hortalizas y otros cultivos en todo el mundo.
En España, las larvas de S. exigua son una plaga importante en cultivos de
invernadero, especialmente en pimiento, tomate, sandía y calabacín.
Esta plaga ha adquirido resistencia a casi todos los insecticidas de síntesis en el
mercado y, por lo tanto, brotes de la plaga pueden causar pérdidas devastadoras para
los productores de cultivos de invernadero.
Ensayos realizados en el sur de España han demostrado que el nucleopoliedrovirus
de S. exigua es más eficiente que cualquiera de los insecticidas químicos comunes.
BACULOVIRUS DE LA POLILLA DE LA PAPA
La “polilla de la papa”, lepidoptero Phthorimaea operculella
(Zeller).
Sus larvas dañan brotes de la planta, barrenan el tallo, minan
las hojas y atacan a los tubérculos en campo y almacén.
Se diseminó en todo el mundo desde Sudamérica.
Ataca también a otras solanáceas: tomate, tabaco,
berenjena, etc.
La biología de las polillas se resume en el siguiente cuadro (días).
BIOLOGIA DE LA POLILLA DE LA PAPA
HUEVOS
DAÑO EN TALLOS ADULTO
PUPA LARVAS EN TUBERCULO
METODOLOGIA DE LA PRODUCCIÓN DE POLILLA
DE LA PAPA
Unidades de oviposición de
Phthorimaea
Conteo de posturas
Control de calidad
Recuperación de pupas 4
días
Desarrollo larval Infestación con posturas
Incubación 1.5 kg papa/1000 posturas
EMPLEO DE BACULOVIRUS PHTHORIAMEA
Se puede emplear en forma de suspensión acuosa (se aplica por
aspersión) o en forma de polvo seco (espolvorear).
El reservorio de los virus son: larvas infectadas frescas, congeladas, secas
o liofilizadas.
FORMULACIÓN LÍQUIDA
Agregar Tritón
al 0.2%
20 larvas Disolver en 1 L de
agua
Para una hectárea de papa se requieren 2000 larvas (36.5 g). Produce entre
el 70 al 100% de mortalidad. El virus puede persistir hasta 60 días luego de
aplicad.
FORMULACIÓN SÓLIDA
Agregar Tritón
al 0.2%
20 larvas Disolver en 1 L de
agua 1 Kg
Silicato de Mg
FUENTE DE BACULOVIRUS PHTHORIAMEA
• Se encuentra en forma natural afectando a las larvas de la polilla de la papa en
condiciones de campo y almacén,
• Larvas infectadas vivas o muertas se hallan sobre tubérculos, en la base de los
brotes, dentro de cocones de seda.
• En laboratorios donde se realiza la crianza masiva de la polilla.
MULTIPLICACIÓN DE BACULOVIRUS PHTHORIMAEA
• Se emplea el método en vivo: utilizando larvas de la polilla obtenidas de
una crianza masal.
• Se requiere de:
1. Una población abundante de larvas o de adultos de la polilla que serán
expuestas a la infección.
2. Substrato alimenticio: tubérculo o follaje.
3. El agente viral: en suspensión acuosa (aplicado al sustrato alimenticio.
• Existen varios métodos de multiplicación en laboratorio.
1. MULTIPLICACIÓN DEL VIRUS CON LARVAS SOBRE
TUBÉRCULOS.
a. Se inicia preparando la suspensión acuosa: 10
larvas infectadas, trituradas y diluidas en un litro
de agua.
b. Sumergir por un minuto, uno a dos Kg de
tubérculos (en una malla), secar en sombra.
c. Colocarlos en bolsas de papel.
d. Introducir 300 a 500 larvas (procedentes de la
crianza masal).
e. Después de 2 a 3 semanas cosechar las larvas
enfermas (fuera y dentro del tubérculo)
f. Estas larvas infectadas sirven para ….?
METODOLOGIA DE LA PRODUCCION DE TALCO VIRAL: Baculovirus
12-24 horas
3- 4 días
Infestación con posturas y
Tratamiento de tubérculos y tubérculos tratados
posturas Recuperación de larvas
0.2 g/500 ml agua/0.2 ml adherente enfermas
Producto final
Triturado de larvas
Control de calidad
Molienda 14 días Secado Preparación del talco viral
INFECCIÓN DE TUBÉRCULOS
SECADO DE TUBÉRCULOS
SECADO DE TUBÉRCULOS TRATADOS
DISTRIBUCIÓN DE TUBÉRCULOS
• INFESTACIÓN DE TUBÉRCULOS CON POSTURAS TRATADAS
FECHADO DE TAPERS INCUBACIÓN
RECUPERACIÓN DE LARVAS POR ACCION FÍSICA
• LARVAS ENFERMAS RECUPERADAS POR ACCIÓN DEL CALOR
RECUPERACIÓN MECANICA DE LARVAS ENFERMAS
PREPARACIÓN DEL
TALCO VIRAL
30 L de agua y 30 Kg de
silicato
TRITURACIÓN DE LARVAS: 13 g LARVAS x 40 minutos
INSUMOS PARA LA PRODUCCION DE BACULOVIRUS
PRERACIÓN DE
Baculovirus
phthorimaea AGREGADO DE SILICATO DE MAGNESIO
MEZCLA MECANICA DEL PRODUCTO
DISTRIBUCIÓN DEL PREPARADO
• DISTRIBUCION DEL PREPARADO
MOLIENDA DEL TALCO VIRAL CON RODILLOS
SECADO
• MOLIENDA CON MOLINO
CONTROL DE CALIDAD DEL PRODUCTO FINAL
TUBÉRCULOS TRATADOS Y NO TRATADOS
CAPACITACION A PRODUCTORES
ADOPCIÓN DEL PRODUCTO
APLICACIÓN DE 125 gr de
Baculovirus
phthorimaea/11.5KG DE PAPA
TUBERCULOS TRATADOS
TUBÉRCULOS TRATADOS Y ALMACENADOS
MUESTREO DE TUBÉRCULOS TRATADOS.
HONGOS ENTOMOPATOGENOS
• Son de gran importancia dentro de los
agroecosistemas por su capacidad natural
para regular las poblaciones de insectos, la
cual depende de la susceptibilidad del
hospedero o de la asociación patógeno-
hospedero.
• Entre los m.o. fúngicos de más amplio uso
contra insectos plaga en la agricultura
están: Beauveria bassiana, Metarhizium
anisopliae.
• Estos presentan una estabilidad genética y
fenotípica aceptable para el escalado en
procesos de producción.
• Son seguros al hombre y otras especies no
diana del ecosistema y su rango de
hospederos no muy estrecho para su uso.
HONGOS ENTOMOPATÓGENOS
• El rango de hospederos sobre los
que tienen efecto patogénico es
dependiente de la especie y del
aislado en cuestión.
• En general Metarhizium y
Beauveria actúan sobre varios
órdenes de insectos:
a. Lepidópteros: Mocis, Spodoptera.
b. Coleópteros: Cosmopolites,
Pachnaeus.
c. Ortópteros : locusta, Schistocerca.
CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS MÁS IMPORTANTES DE
HONGOS ENTOMOPATÓGENOS
• Beauveria bassiana.
• Colonia: La colonia en
APD a los 14 días es
algodonosa a
polvorienta, blanca. A
medida que va pasando
el tiempo se vuelve
amarillenta, cremosa. El
revés es de color rojizo al
centro y amarillento
alrededor.
• Conidióforos: donde
nacen células
conidiógenas en grupos
grandes.
CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS MÁS IMPORTANTES DE
HONGOS ENTOMOPATÓGENOS
• Células conidiógenas: están
agrupadas formando grupos
compactos grandes y a veces
solitarias. En forma de botellitas de 3
a 6 x 3 µm. En algunos casos se
ramifican formando células
conidiógennas secundarias. Al final de
cada célula se forma un raquis que
sostiene las conidias.
• Raquis: Hasta de 20 µm de longitud y
1 um de diámetro, denticulado, que
sostiene una conidia en cada
dentícula.
• Conidias: hialinas, globosas a
subglobosas, de 2 a 3 x 2.3 µm que se
insertan sucesivamente en el raquis
en forma opuesta.
Mecanismo patogénico
• Las etapas en el desarrollo de una micosis pueden simplicarse en 10
pasos:
1. Adhesión al tegumento
2. Germinación del conidio
3. Penetración por la cutícula
4. Multiplicación en el hemocele
5. Producción de toxinas
6. Muerte del insecto
7. Colonización
8. Emergencia del micelio fuera del insecto
9. Esporulación del hongo
10. Diseminación.
Mecanismo patogénico
• Inician su proceso infectivo en los insectos
cuando las esporas son retenidas por
contacto en la superficie del integumento,
mientras encuentran un espacio propicio
para establecer la asociación patógeno-
hospedero y formar los túbulos germinales
y a veces el apresorio, que facilitarán la
invasión del hongo.
• Se ha sugerido que iones Ca+2 y
Mg+2 reducen las fuerzas de repulsión
electrostática de la superficie del insecto,
por lo que pueden afectar su hidrofobicidad
y promover la adhesión pared celular
fúngica-cutícula.
Mecanismo patogénico
• En cuanto al mecanismo especifico de
acción, los hongos entomopatógenos
actúan principalmente por contacto,
cuando el hongo es capaz de penetrar
dentro del insecto e invadirlo,
provocándole la muerte por micosis.
• Además la mayoría de estos hongos
producen sustancias líticas y toxinas
que ayudan a la penetración y a inhibir
los mecanismos de defensa de los
insectos entre otras formas de actuar.
Mecanismo patogénico
• La germinación de la espora se inicia con el hinchamiento de
la misma, que es favorecido por una humedad alta (70%
durante 14h); la germinación es disparada por mensajeros
que generalmente son carbohidratos presentes en las
proteínas cuticulares del insecto .
• La hidratación de la espora es favorecida por la acción
antidesecante de su cubierta mucilaginosa, que además
funciona como protector ante la presencia de polifenoles
tóxicos y enzimas, secretadas por sistema inmune del insecto.
• Después del hinchamiento de la espora tiene lugar la
formación del tubo germinativo mediante el proceso de
polarización típico del crecimiento apical de los hongos, que
estimula la síntesis de la pared celular.
Mecanismo patogénico
• Los iones H+ y Ca2+ entran en la punta de la hifa a través de un
mecanismo de transporte pasivo y son expulsados por
mecanismos dependientes de energía. Este flujo trans-celular
permanece constante y mantiene el desarrollo del tubo
germinativo y la formación del apresorio , una estructura
especializada formada en el tubo germinativo .
• El tubo germinativo rastrea y reconoce la superficie del insecto
para la localización de sitios receptores, habilitando a la hifa
para la penetración de la cutícula. El apresorio sirve para el
anclaje de la espora y ejerce una presión hacia el interior del
insecto.
Mecanismo patogénico
• Paralelamente, el hongo excreta
gran cantidad de enzimas :
proteasas, quitinasas,
quitobiasas, lipasas,
lipooxigenasas y otras enzimas
hidrolíticas, que van degradando
la cutícula y proporcionan a su
vez nutrientes al hongo.
• Una vez dentro del insecto, el
hongo prolifera formando
cuerpos hifales secundarios, que
se ramifican en la procutícula.
Mecanismo patogénico
• Posteriormente, los cuerpos hifales se encuentran
con la capa epidérmica y y se diseminan a través del
hemocele. Así, invaden diversas estructuras como
tejidos musculares, cuerpos grasos, tubos de
Malpighi, mitocondrias, hemocitos, retículo
endoplásmico y membrana nuclear.
• Al agotarse los nutrientes, el hongo inicia un
crecimiento miceliar invadiendo todos los órganos
del hospedero. Finalmente, las hifas penetran la
cutícula desde el interior del insecto y emergen a la
superficie iniciando la formación de esporas cuando
la humedad relativa es adecuada.
Mecanismo patogénico
• La micosis induce a síntomas fisiológicos
anormales en el insecto: convulsiones,
carencia de coordinación, comportamientos
alterados y parálisis.
• La muerte sobreviene por una combinación
de efectos que comprenden el daño físico de
tejidos, toxicosis, deshidratación de las
células por pérdida de fluido y consumo de
nutrientes .
• En su acción además intervienen varios
factores que pueden favorecer o no la
actividad antagónica del microorganismo
como son temperatura, pH, humedad
relativa y la presencia de otros
microorganismos, entre otras.
Métodos de aislamiento
• Se usan métodos clásicos
de aislamiento.
• Se recolectan, en el
campo, insectos
micosados o
sospechosos de micosis
(insectos momificados).
• Se realizan siembras en
medios para hongos
(APD,ASG) con
antibióticos y se incuban
a 23-27 ºC (de 72 horas
hasta 14 días).
Métodos de reproducción
• Para la selección del método de reproducción es importante tener en
cuenta no sólo la factibilidad tecnológica y económica, sino el
mecanismo de acción ya que en el producto final deben estar presentes
las estructuras infectivas y los metabolitos activos de forma estable y con
su mayor potencial biológico.
Selección de la cepa adecuada
Selección de un medio de cultivo con un balance de nutrientes que
permita obtener un desarrollo del hongo con el máximo potencial
patógenico y con eficiencia económica.
La posibilidad tecnológica y económica de escalar el proceso a nivel de
producción.
Formulación que permita periodos de almacenamiento prolongados,
facilidad de aplicación y estabilidad en condiciones de campo.
La estabilidad en el medio ambiente, puede ser, incluso más importante
que la patogenicidad de la cepa en condiciones de laboratorio, por lo
cual se llegan a soluciones de compromiso
Métodos de reproducción
• En general se emplean cuatro formas de producción;
1. Cultivos sobre soportes sólidos en bandejas, frascos o
bolsas.
2. Cultivos líquidos agitados en zaranda.. (Fermetación
sumergida)
3. Cultivos líquidos en condiciones estáticas (frascos)
4. Cultivos bifásicos, donde se realiza el inóculo en forma
líquida agitado o estático y posteriormente se pasa al
soporte sólido.
• Cada uno de los métodos tiene ventajas y desventajas, por
lo cual la decisión depende de varios factores: la calidad del
producto final y su factibilidad tecnológica y económica son
lo más importante.
