ESPECTROFOTOMETRÍA.

CALIBRACIÓN DEL ESPECTROFOTÓMETRO Y DETERMINACIÓN

DE LA CONCENTRACIÓN DE LA HEMOGLOBINA EN SANGRE.

SPECTROPHOTOMETRY. CALIBRATION OF THE SPECTROPHOTOMETER AND

DETERMINATION OF THE CONCENTRATION OF HEMOGLOBIN IN BLOOD

Ana Carolina Galvis 20202620211, Roger Ferreira 20202620262, Eelen Ramirez 20202620503,
Luz Karime Suarez 20202620334.

Universidad del magdalena, Facultad de ciencias de la salud

Programa de enfermería

RESUMEN

La espectrofotometría es una técnica analítica que permite determinar la concentración de un

compuesto en solución o la cantidad de especies determinadas. Se basa en que las moléculas
absorben las radiaciones electromagnéticas y a su vez que la cantidad de luz absorbida depende
de forma lineal de la concentración. En estos casos, el instrumento que realiza tales medidas es un
espectrofotómetro Podemos dividir los métodos espectrofotométricos en dos grandes grupos según
qué es lo que medimos para cuantificar al analito: La Espectrofotometría de absorción y la de
emisión. En el siguiente laboratorio se realizó un estudio sobre la Espectrofotometría que permitió
el desarrollo de tres procedimientos; primero se realizó el espectro de absorción del rojo de fenol
en medio ácido y en medio alcalino, luego se trabajó en la construcción de una curva de calibración
de rojo de fenol y por último se realizó la cuantificación de la hemoglobina (Hb) en una muestra de
sangre, con la finalidad de adquirir habilidades para el manejo y uso del espectrómetrofotómetro,
aprender a elaborar curvas de calibración, comprobar la relación entre la absorbancia y a
concentración y la interpretación de resultados obtenidos.

Palabras clave: espectrofotometría, concentración, radiación, electromagnéticas, absorción,

espectrofotómetro.

ABSTRAC

Spectrophotometry is an analytical technique that makes it possible to determine the concentration

of a compound in solution or the amount of specific species. It is based on the fact that the
molecules absorb electromagnetic radiation and once the amount of light absorbed depends on the
linear form of the concentration. In these cases, the instrument that performs such measurements is
a spectrophotometer. We can divide the spectrophotometric methods into two large groups
according to what we measure to quantify the analyte: absorption and emission spectrophotometry.
In the following laboratory, a study on Spectrophotometry was carried out, which will involve the
development of three procedures; First, the absorption spectrum of phenol red was carried out in an
acid medium and in an alkaline medium, then we worked on the construction of a phenol red
calibration curve and finally the quantification of hemoglobin (Hb) in a sample was carried out. of
blood, in order to acquire skills for the management and use of the spectrophotometer, learn to
elaborate calibration curves, check the relationship between absorbance and concentration and the
interpretation of the results obtained.

Keywords: spectrophotometry, concentration, radiation, electromagnetic, absorption,

spectrophotometer.

INTRODUCCION
El estudio a nivel bioquímico de cualquier PRIMERA PARTE: ESPECTRO DE
biomolécula requiere la utilización de ABSORCIÓN DEL ROJO DE FENOL EN
técnicas analíticas que permitan su MEDIO ÁCIDO Y EN MEDIO ALCALINO.
determinación cualitativa y cuantitativa, así
como su caracterización físico-química y 1. Prenda el espectrómetrofotómetro 20
biológica. Uno de los métodos más sencillos, minutos antes de empezar la practica
accesibles, útiles y utilizados es la 2. Prepare una solución patrón de rojo
espectrofotometría. Esta es una técnica fenol en un tubo de ensayo limpio y
analítica que permite determinar la seco de la siguiente forma: se
concentración de un compuesto en solución. adiciona 5ml de solución de rojo
Se basa en que las moléculas absorben las fenol al 2.5mg %. 5ml de agua
radiaciones electromagnéticas y a su vez que destilada y 0,1 mL de HCl 0,1N.
la cantidad de luz absorbida depende de 3. En otro tubo de ensayo prepare un
forma lineal de la concentración. blanco con 10mL de agua destilada y
Dicha técnica, se realiza a través del
0,1 mL de HCL 0,1N.
espectrofotómetro. Este un instrumento con 4. Vierta las soluciones patrón y blanco
el que se apoya la espectrofotometría para en las cubetas del espectrofotómetro.
medir la cantidad de intensidad de luz 5. Para la lectura de la transmitencia en
absorbida después de pasar a través de una el espectrofotómetro, escoja
solución muestra. Además, permite calcular
la transmitancia y con base a esta, se obtiene
inicialmente una longitus de onde de
absorbancia de la muestra. 380nm. Introduzca la cubeta
correspondiente al blanco en el
A través de este laboratorio se podrá
espectrofotometro y la transmitancia a
profundizar más en la temática ya antes
mencionada y se podrá observa de forma un 100% ( 100% T ).
práctica el uso de esta técnica tan importante 6. Saque la cubeta del blanco e
en nuestro campo profesional introduzca la de la muestra patron.
Anote la lectura que registra el
equipo.
MATERIALES Y MÉTODOS 7. Repita el paso 5 y 6 variando la
Para realizar la práctica se emplearon los longitud de onda del
siguientes materiales: espectrofotómetro desde 380 a
Laboratorio: Tubos de ensayo con 620nm con intervalos de 20nm.
anticoagulante, gradilla para tubos de 8. Con los datos de la transmitancia
ensayo, pipetas, micropipetas automáticas, calcule la absorbancia utilizando la
puntas desechables, espectrofotómetro, siguiente fórmula: A = 2 -log %T.
torundas de algodón, guantes, jeringas,
9. Repita el procedimiento
pipeteador manual, hojas milimetradas, regla,
curvígrafo, lápiz. reemplazando el HCl 0,1N por una
solución de NaOH 0,1N y anote los
Reactivos: Agua destilada, alcohol
datos en la siguiente tabla.
antiséptico al 70%, solución patrón de
Ferricianuro de potasio, solución de rojo de
fenol 2.5mg%, HCL 0.1N, NaOH 0,1N.

PROCEDIMIENTO
SEGUNDA PARTE: CONSTRUCCION DE destilada o solución salina NaCI
UNA CURVA DE CALIBRACION DE ROJO 0,9% como lo indica la tabla.
DE FENOL. 4. Lea la absorbancia (A) la muestra a
450nm frente al blanco (como en la
1. Prepare tres patrones de rojo de segunda parte de la práctica).
fenol, de concentración distinta, a 5. La concentración de hemoglobina de
partir de una solución de rojo de la muestra se calcula a partir de la
fenol de concentración 2,5mg%, siguiente formula:
siguiendo las indicaciones de la Concentración de Hb = A x 37,5.
tabla. 6. Consulte en el CD-ROOM la
2. Calcule la concentración final del rojo simulación “Análisis Fotométrico del
de fenol en cada tubo. Utilizando la rojo de fenol”.
siguiendo fórmula:

C2 = c1 x v1 RESULTADOS
V2
PRIMERA PARTE
3. Mezcle suavemente los tubos y (λ) MEDIO ACIDO MEDIO ALCALINO
dejarlos en reposo por 5 minutos.
4. Seleccione en el espectrofotómetro
la máxima para el rojo de fenol en %T A %T A
medio ácido y realice las lecturas del
% de transmitancia a cada tubo, 380 96 0.017 94.9 0.022
cuadrando el 100% T con el blanco. 400 90.1 0.045 97.8 9.661
Realice la lectura del %T de una
solución de rojo fenol de 420 85.9 0.066 97.5 0.010
concentración desconocida (muestra
440 85.2 0.069 96.2 0.016
problema)
5. Realice el mismo procedimiento con 460 88.8 0.051 93.8 0.027
rojo de fenol en medio básico (con
NaOH 0,1N) 480 94.3 0.025 89.5 0.048
6. Anote la lectura de cada muestra en
500 98.6 6.123 83.1 0.080
la siguiente tabla y calcule el valor de
la absorbancia de cada una de ellas 520 - - 74.3 0.129

540 99.7 1.304 63.5 0.197

TERCERA PARTE: CUANTIFICACIÓN DE 560 98.0 8.773 52.9 0.276
LA HEMOGLOBINA (Hb) EN UNA
MUESTRA DE SANGRE 580 - - 79.4 0.100

1. Prepare u tubo de ensayo con 2,5 mL 600 - - 96.7 0.014

de solución patrón de Ferricianuro de
potasio (biosyntems). 620 - - 99.1 3.926
2. Obtenga una muestra de sangre
Tabla 1.
venosa en un tubo con
anticoagulante (EDTA). Espectro de absorción del rojo de fenol, en el
3. Adicione 1º mL de sangre a la que podemos observar que la mayor
solución patrón y mezcle bien por 3 absorbancia se encuentra una longitud de
minutos a temperatura ambiente onda de 400 en medio al alcalino y 560 en
(tubo problema).Repita el medio ácido.
procedimiento con 10 mL de agua
 TERCERA PARTE

SEGUNDA PARTE

TUBO DE ENSAYO 1 2 3 BLANCO

TUBO SOLUCION MUESTRA SOLUCION
Solución de rojo fenol 10 5 1 0
PATRON SALINA
C=2,5mg/100%
Agua destilada (ml) 0 5 9 10 Blanco 2,5 mL (--- 10μL

HCl 0,1N (ml) 0.1 0.1 0.1 0.1 Muestra 1 2,5 mL 10μL (---

Volumen final 10.1 10.1 10.1 10.1 Muestra 2 (--- 10μL 2,5 mL

Concentración final 2.47 1.23 0.24 0

Tabla 3.1
Tabla 2.1
0,588; con la que se determina la
a. Calcule la concentración final del rojo concentración de Hemoglobina:
de fenol en cada tubo. [Hb]=A x 37,5
[Hb]= 0,588 x 37,5
Concentración final de tubo 1 [Hb]= 22,05 g/dL

c2 = 2,5mg x 10ml = 25 mg = 2,47 mg

10,1ml 10,1 Este resultado se compara con la tabla de
Concentración final de tubo 2 valoración de la concentración de
hemoglobina en sangre según la relación
c2 = 2,5mg x 5ml = 12.5 mg = 1.23 mg edad-género:
10,1ml 10,1 La persona escogida es una mujer de 17
Concentración final tubo 3 años de edad, nos pudimos dar cuenta
que tiene
c2 = 2,5mg x 5ml = 12.5 mg = 0.24 mg
10,1ml 10,1 Tabla 3.2

Concentración final blanco EDAD HOMBRES MUJERES

c2 = 2,5mg x 0 = 0 12-14 años 12,3 a 16,0 g/dL 11.5 a 15,0 g/dL
10,1ml 15 - 17 años 11.7 a 16,6 g/dL 11,7 a 15,3 g/dL
18 - 74 años 13,5 a 17,5 g/dL 12,0 a 16,0 g/dL

Tabla 2.2
TUBO MEDIO ACIDO MEDIO BASICO
C2 T% A C2 T% A
1 2,47 74.7 2,47 74.7
2 1.23 91.5 1.23 91.5
3 0.24 95.7 0.24 95.7
M.P 0 95.2 0 95.2
 • En segundo lugar, dado que la
DISCUSION concentración de Hb en la sangre analizada
fue de 22,05 g/dL en la estudiante de 17
En el experimento de lectura del espectro de años, que comparado con la tabla donde el
absorción para soluciones coloreadas, en rango a esta edad de Hb en sangre de una
este caso en medio acido (HCl) tomado una mujer es de 11,7 a 15,3 g/dL por lo que se
coloración amarilla y en medio alcalino puede deducir que está por encima de dicho
(NaOH) tomado una coloración violeta, se rango, la causa en este caso podría ser
obtuvieron los datos que correspondieron deshidratación hipertónica, lo que genera
debidamente a cada rango de longitud de mayor pérdida de líquidos, con relación a los
onda, teniendo en cuenta que la tramitación cuerpos solutos en el plasma. Otras causas
la adquirimos directamente del que deberían someteterce a puebas
espectrofotómetro y la absorbancia a partir especificas son: Uso de tabaco;
de la aplicación de la fórmula: A=2-log %T; lo • Deshidratación;
que determino lo siguiente: • Enfisema pulmonar;
• La mayor absorbancia del medio • Fibrosis pulmonar;
acido de onda optima es 440 nm, debido a la • Policitemia;
longitud de onda en la cual el mayor número • Tumor en los riñones;
de fotones incidentes se absorben • Uso de anabolizantes o de la
determinados por la diferencia en los niveles hormona eritropoyetina
de energía disponibles de las sustancias
presentes en la muestra. De igual manera en
el medio alcalino el punto de mayor CONCLUSION
absorbancia de onda es 560 nm, esta El punto de mayor absorbancia o espectro de
variabilidad que se presentan en el punto de absorción normalizado, es característico
mayor absorbancia entre una sustancia y otra para cada compuesto particular, no cambia
es lo que permite diferenciarlas en entre con la concertación y es como la “huella
ellas, según la interacción partículas entre la digital” química del compuesto.
materia (muestra) y la radiación La práctica cumplió la obtención de la
electromagnética a la que se expone. experiencia i habilidad por parte los
Por otro lado hubo una serie de contrastes estudiantes en el uso del espectrofotómetro.
con los resultados que, en primer lugar, es Se hace necesario el conocimiento y la
congruente con la cantidad de radiación indagación en el estudio y la aplicación de la
absorbida por la solución de 2,5mL de espectrofotometría en la determinación de
ferricianuro de potasio y 10mL de sangre, ya ciertos compuestos que conforman una
que debería ser directamente proporcional al muestra biológica en el ámbito de laboratorio
número de centros absorbentes de la clínico, apreciando las variaciones de
solución anterior pero en este caso no fue Transmitancia y Absorbancia con respecto a
asi, debido a que se obtuvo una su medio y concentración, además de todos
concentración muy alta; esto se evidencia en los factores externos que pueden o no
el efecto de concentración (ley Lamber Beer); modificar el resultado, mostrándola sensibles
el cual expresa que solo debe cumplirse en a pequeñas variaciones como el tamaño de
soluciones diluidas y además afirma que la las celdas o las concentraciones del reactivo.
totalidad de luz que emana de una muestra
puede disminuir debido a tres fenómenos de PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS
la física, que serían los siguientes:
1. El número de materiales de absorción en 1. Realice una gráfica con los datos de la
su trayectoria, lo cual se denomina tabla 1; así, %T Transmitancia vs longitud de
concentración onda (λ); y otra de Absorción vs longitud de
2. Las distancias que la luz debe atravesar a onda. ¿Qué diferencia encuentra entre los
través de las muestra. Denominamos a este dos gráficos?
fenómeno, distancia del trayecto óptico.
2. ¿Cuál es el valor máximo de absorbancia R: / Por la fórmula [ ] = A x Hto, donde Hto es
para el rojo de fenol en medio ácido y en el coeficiente de absorbancia específica, por
medio alcalino? ¿Qué conclusión saca de lo que tenemos que:
esta diferencia? Proteína diluida: en la que tenemos A = 0,82
R:/ Con respecto a la longitud de la onda, el y Hto = 6, de modo que:
valor máximo de absorbancia para el Rojo de [ ] = A x Hto
Fenol en medio ácido es de 0,157; mientras [ ] = 0,82 x 6
que el valor máximo del Rojo de Fenol en [ ] = 4.92 mg/mL
medio alcalino es de 0,446. La diferencia
radica en la capacidad de absorbancia que
posee la muestra, haciendo posible su BIBLIOGRQFIA
diferenciación según la coloración que toma. https://aulavirtual.agro.unlp.edu.ar/pluginf
ile.php/43546/mod_resource/content/3/Esp
3. ¿Cuál es el fundamento de la ectrofotometría%202019%20versión
determinación de la hemoglobina por %20final.pdf
espectrofotometría? https://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-
R:/ El fundamento de esta técnica es la mol/pdfs/08_ESPECTROFOTOMETRIA.pdf
oxidación del ion ferroso de la hemoglobina a
hierro férrico por el reactivo ferrocianuro de
potasio. La reacción produce, además,
metahemoglobina la cual reacciona con el
cianuro de potasio para generar
cianometahemoglobina, este último producto
puede ser medido por espectrofotometría,
siendo su concentración directamente
proporcional a la concentración de
hemoglobina en la muestra de sangre.

4. ¿Cuál es la utilidad diagnostica de la

determinación de hemoglobina en sangre?
R: / La utilidad diagnostica de la
determinación de hemoglobina en sangre
parte de la relación salud/enfermedad, esta
se evalúa por prueba de espectrofotometría,
la cual mide la concentración de Hb en
sangre, lo cual se compara con unos valores
normales preestablecidos según la edad y el
género. A niveles bajos indica posibles
patologías como: anemia, cirrosis, linfoma,
leucemia, hipotiroidismo, insuficiencia renal,
talasemia, entre otras; y a niveles elevados
responde a: uso del tabaco, deshidratación,
enfisema pulmonar, fibrosis pulmonar,
policitemia, entre otras.

5. El coeficiente de absorción específica de

una proteína es 6. Calcúlese la concentración
en mg/mL si una disolución de esta presenta
una absorbancia de 0,82 en una cubeta de 1
cm de paso óptico.