UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN
MARCOS
Universidad del Perú, DECANA DE AMÉRICA
FACULTAD DE MEDICINA
ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE
NUTRICIÓN
MÉTODOS DE DETERMINACIÓN DE LA
AMILASA
BIOQUÍMICA
ALUMNA:
Torres Iglesias, Silvana Tamara
2021
“Métodos de determinación de la amilasa”
Torres Iglesias, Silvana Tamara
Profesora: Vargas Chávez, Marlene
Curso de Bioquímica.
Facultad de Medicina – EAP de Nutrición
Universidad Nacional Mayor de San Marcos
1- Introducción
La amilasa es una enzima sintetizada por el por el páncreas y las
glándulas salivares para facilitar la digestión de carbohidratos a través de
la ruptura de los enlaces α-1-4 glucosídicos (Prieto et al., 2019). La
importancia clínica de esta enzima es que su presencia en niveles
elevados en el suero de las personas es un indicio de pancreatitis aguda,
lo cual se observa entre las 24 y 30 horas posteriores al ataque. Así
mismo, la excreción urinaria de esta enzima se ve aumentada,
persistiendo incluso de 3 a 5 días. Otras manifestaciones que se asocian
con el incremento de la amilasa son el caso de parotiditis bacteriana,
paperas e intervenciones quirúrgicas en regiones próximas al páncreas.
En este sentido, el método cinético y el método espectrofotométrico son
útiles en la determinación experimental de la actividad de la amilasa en el
suero y orina, siempre teniendo en cuenta los cuidados necesarios para
que los resultados sean verídicos.
2- Contenido
a) Determinación colorimétrica
El método se basa en la capacidad que tiene la enzima amilasa para
desdoblar el almidón, obteniendo como producto de la hidrólisis
(participación del agua en el desdoblamiento de una molécula) la dextrina
y la maltosa. Es importante mencionar que el color azul del almidón
remanente que será leído fotométricamente se debe a la reacción de este
compuesto con el reactivo de iodo (Valtek, s.f).
Los reactivos usados en este método son los correspondientes a buffer
sustrato y reactivos de color. Respecto al primero, están el almidón
soluble (550 mg/l), es buffer fosfato con un pH de 7 (100 mmol/l) y
preservantes y estabilizantes. Respecto al segundo, están el iodo
(10mEq/l) y el ácido clorhídrico (20 mmol/l). Es importante mencionar que
estos deben estar conservados a una temperatura entre 2° y 8° C, no
estar vencidos y no estar expuestos a la luz directa, pues esto afectaría
los resultados de manera significativa. Otro cuidado necesario es no
realizar la succión de la pipeta con la boca, pues la saliva cuenta también
con la enzima amilasa.
Las muestras corresponden a orina, suero o plasma heparinizado libre de
hemolisis (deterioro de los glóbulos rojos). La heparina es usada para
reducir la capacidad de coagulación de la sangre, solo debe ser usada
esta puesto que otros coagulantes interfieren con la reacción. Además, se
debe tener en consideración que la enzima amilasa es estable durante
varios meses solo si está a una temperatura de 4° C, pues en caso de
estar a temperatura ambiente solo contara con estabilidad por 7 días.
El equipo requerido es un espectrofotómetro, el cual permite medir la
cantidad absorbida por esta (absorbancia) o la cantidad de luz que pasa
a través de ella (transmitancia). En este caso, el espectrofotómetro debe
tener la capacidad de leer absorbancia a 600nm de longitud de onda.
Otros instrumentos son las pipetas, el baño termorregulado o mas
conocido como baño María, gradillas y tubos de ensayo.
En esta técnica se usarán dos tubos, uno de referencia y uno
desconocido. En el de referencia se usarán 0.50 ml de buffer sustrato y
posteriormente serán preincubados a una temperatura de 37° C de 3 a 5
minutos. La incubación se dará en un tiempo exacto de 7 minutos y medio
a 37° C. Luego, se le agregara 4 ml de agua desionizada y 0.50 ml de
reactivo de color. En el desconocido se usarán 0.50 ml de buffer sustrato
y se pondrá en preincubación bajo las mismas condiciones que el de
referencia (Valtek, s.f). Luego se le agregara una muestra de 0.010 ml y
se incubara por 7 minutos y medio exactos a 37. Tambien se le agregara
agua desionizada y reactivo de color a iguales cantidades que el de
referencia. Finalmente, en ambos casos se debe mezclar por inversión y
leer a 600 nm (rango 580-620 nm).
En el caso de los cálculos se usa la siguiente fórmula:
Ejercicio:
Absorbancia de referencia de 0.03
Absorbancia de desconocido a 0.01
Amilasa (U/dl) = 0.03-0.01x 1000 = 666.66 U/ dl
0.03
Recordar: 1 U/dl corresponde a la cantidad de enzima que es capaz de
hidrolizar 10 mg de almidón en treinta minutos en las condiciones del
ensayo.
En el caso de la orina:
Los valores con 24 horas se deben a que este el tiempo recomendando
para trabajar en la orina.
La cantidad de amilasa fuera de los rangos de referencia es un indicio de
una posible pancreatitis aguda, incluso llegando verificar si esta es
crónica. Sin embargo, es importante mencionar que también podría
deberse a una parotiditis bacteriana, paperas e intervenciones quirúrgicas
en regiones próximas al páncreas.
Los valores de referencia son los siguientes:
b) Determinación cinética
Este método se fundamenta a través de la hidrolisis del 2-cloro-p-
nitrofenial-α-D-maltotriósido gracias a la α-amilasa, lo que trae como
consecuencia la liberación de 2-cloro-p-nitrofenol (CNP), formándose de
esta manera 2-cloro-nitrofenil-α- D-maltósido, maltotriosa y glucosa. Es
importante mencionar que el 2-cloro-p-nitrofenol absorbe 405 nm y la
velocidad con la que aparcera el color es directamente proporcional a la
actividad enzimática( Wiener, s.f).
El reactivo usado en este método es una solución conformada por acetato
de calcio a 6mmol/l, tiocianato de potasio 900 mmol/l, 2-cloro-p-nitrofenilα-
D-maltotriósido, cloruro de sodio 70 mmol/l y buffer MES pH 6 a 100
mmol/l. Para que el reactivo conserve su estabilidad hasta su fecha de
vencimiento es necesario que este refrigerado a una temperatura entre
los 2° a 10° C. Es importante mencionar que su uso diagnóstico es “in
vitro” lo que supone un método rápido.
En el caso de que la absorbancia del reactivo tenga valores superiores a
405 nm, esto sería considerado como un indicio de deterioro del mismo.
La muestra puede ser de suero, plasma heparinizado u orina, al igual que
en el método fotométrico. La recolección se dará de diferente forma según
sea el tipo de muestra. En el caso del suero este debe ser obtenido de
manera usual, en el caso del plasma este debe ser heparinazado (evitar
la coagulación) y en el caso de la orina puede ser una muestra ocasional.
Es importante mencionar que en el caso de la orina debe usarse el ácido
clorhídrico como conservador debido a que el pH ácido inactiva la enzima
irreversiblemente. En este sentido, la conservación de la orina se dará
óptimamente a un pH DE 7, lo cual se logrará con hidróxido de sodio. Bajo
estas condiciones, la orina puede conservarse refrigera hasta 10 días sin
pérdida de la actividad enzimática.
El material requerido es un espectrofotómetro, Cubetas
espectrofotométricas de caras paralelas, baño maría, cronómetro,
espectrofotómetro, micropipetas y pipetas. Las condiciones de la reacción
serán tener una temperatura de 25, 30 o 37°C, una longitud de onda de
405 nm y un tiempo de 2 minutos.
El procedimiento consiste colocar el reactivo (2 ml), preincubarlo de 3 a
4 minutos y luego agregar la muestra (100 ul) en una cubeta, todo esto a
una temperatura entre los 25 a 30°C. Luego, se debe mezclar
inmediatamente y leer la absorbancia en un plazo de 1 y 2 minutos. En el
caso de usar temperatura de 37°C se recomienda disminuir los volúmenes
usando 1 ml de Reactivo y 20 ul de Muestra (Wiener, s.f).
El cálculo de los resultados se dará de la siguiente manera:
𝐴𝑚𝑖𝑙𝑎𝑠𝑎 (U/l) = ∆A/min x factor
Dónde:
Ejercicio:
Absorbancia 1: 1009 nm
Absorbancia 2: 1379 nm
Muestra de 100 ul
Tiempo: 1 minuto
1379 − 1009
𝐴𝑚𝑖𝑙𝑎𝑠𝑎 = x 1.628 = 602.36 U/l
1
Valores de referencia
Dentro de las consideraciones finales en este método se menciona que
se debe evitar el contacto con elementos de goma como tampones ya que
deterioran el reactivo. Además, el rango útil de lectura será de hasta 0,250
D.O. En caso de tener valores superiores se debe diluir la muestra con
una solución fisiológica y corregir los resultados.
3- Conclusiones:
- El diagnóstico clínico no debe realizarse únicamente con los resultados de
un único ensayo, sino que debe considerarse al mismo tiempo los datos
clínicos del paciente.
- Los resultados pueden verse interferidos al tener contacto con la saliva al
momento de tomar la muestra, pues esta contiene amilasa.
- En ambos métodos se producen productos mediante hidrólisis usando la
enzima amilasa.
- En ambos casos se debe usar estrictamente la anticoagulante heparina, ya
que otros interfieren con los resultados experimentales.
Referencias
Prieto, D., Prieto, R., Tabernilla, O. y García, Y. (2019). Importancia
del diagnóstico de enzima alfa amilasa salival. Revista Científica
Estudiantil, 2(1). Recuperado de
[Link]
Valtek. (s.f). Set de reactivos para la determinación colorimétrica de
la actividad de Amilasa en suero y orina.
Wiener Lab. (s.f). Método cinético a 405 nm para la determinación de
amilasa en suero, plasma u orina. Sustrato CNPG3. Recuperado de
[Link]
[Link]/VademecumDocumentos/Vademecum%20espanol/amilas
a405aa_liquida_sp.pdf
