Amplificación de DNA in vitro:
PCR (Polymerase Chain Reaction)
Laboratorio de Genética
BIOL 3300L
Lic. [Link]. Fredy Terrazas M.
Objetivos
Conocer:
Los fundamentos de la técnica de amplificación de
DNA por PCR
Usos y aplicaciones del PCR
Ventajas y desventajas del PCR
Métodos de secuenciación de DNA
Lic. [Link]. Fredy Terrazas M.
PCR
Polymerase Chain Reaction
Es la amplificación de DNA in vitro por medio de la
polimerización en cadena de DNA utilizando un
termociclador.
El propósito del PCR es hacer muchas copias de un
fragmento de DNA.
Se realiza la amplificación de un segmento específico
de DNA, teniendo poco material disponible.
Lic. [Link]. Fredy Terrazas M.
Polimerasa Chain Reaction: Reacción en
Cadena de la Polimerasa
Fue diseñada por el Dr.
Kary Mullis en 1987.
Ganó el premio Nóbel de
Química en 1993 por su
invento.
Utilizo el PCR para
amplificación del gen de
β-hemoglobina humana, y
el diagnostico prenatal de
anemia falciforme.
Lic. [Link]. Fredy Terrazas M.
Termociclador
La PCR se realiza
en un “Thermo
Cycler”
Termociclador.
Es una máquina
que calienta y enfría
la reacción en
periodos cortos de
tiempo.
Lic. [Link]. Fredy Terrazas M.
El proceso de “PCR” incluye 3 pasos
básicos que se repiten 25 veces o más:
1. Desnaturalización: Consiste en separar la doble hebra de
DNA y convertirla en hebra sencilla.
-Típicamente se usa una temperatura de 95˚C - 97˚C, por 15 a
40 segundos –el tiempo depende del tamaño del genoma-
Lic. [Link]. Fredy Terrazas M.
2. Apareamiento o “anneling”:
Los cebadores “primers” previamente diseñados,
reaccionan con la hebra sencilla de DNA y se pegan
en lugares específicos por complementariedad de
bases. Para esto, se baja la temperatura -ej: 55˚C
por 30 segundos-. La temperatura y el tiempo
puede variar entre cebadores según sea el caso.
Lic. [Link]. Fredy Terrazas M.
3. Polimerización o Extensión.
Una Polimerasa de DNA extiende los “primers”, en el
espacio comprendido entre ambos “primers”, y coloca
dinucleotidos trifosfatados (dNTP’s) de 5’a 3’ leyendo el
DNA de 3’a 5’. De estas forma sintetiza la secuencia
complementaria de las hebras de DNA molde
Se efectúa a 70˚C por 1½ minutos (puede variar según
sea necesario)
Los pasos 1, 2 y 3 se repiten cuantas veces sea necesario.
Lic. [Link]. Fredy Terrazas M.
Lic. [Link]. Fredy Terrazas M.
En el PCR hay una amplificación exponencial
Lic. [Link]. Fredy Terrazas M.
Reactivos necesarios para PCR:
Amortiguador (Buffer): 50mM KCl, 10mM Tris. Cl (pH
8.3 a temperatura ambiente) y 1.5 mM MgCl2.
MgCl2: Puede estar en forma de MgCl2, MgSO4. Se
usa 25mM -Es un cofactor para la función de la
polimerasa-
dNTP’s (Dinucleotidos trifosfatados): dATP, dGTP,
dCTP, dTTP.
-La concentración de dNTPS, es proporcional al tamaño
del fragmento que se desea amplificar. Ej: Si vamos a
amplificar un fragmento de 500pb vs uno de 5500 pb,
necesitamos más concentración de dNTPS para el de
5500pb.
-Generalmente, se usa una concentración de 200µM de
cada uno.
Lic. [Link]. Fredy Terrazas M.
Reactivos necesarios para PCR:
Cebadores “primers”: Son secuencias cortas
de nucleótidos 20-24 nucleótidos de longitud,
complementarias a una región del DNA que se
quiere amplificar. -Se usa a concentración de
1µM-
DNA molde: El DNA a amplificar puede tener
desde 50 a 2,000 nucleótidos de longitud.
El mínimo va de 10-100 ng. y el máximo entre
400-500 ng.
Polimerasa: Generalmente se usa 2 unidades
por reacción.
Lic. [Link]. Fredy Terrazas M.
ADYUVANTES DE LA PCR
Son elementos que mejoran el rendimiento y la
especificidad de la PCR.
Se usa DMSO, glicerol o BSA.
El adyuvante más utilizado es el BSA. A
concentraciones por encima de 0.8 µg/µl el BSA
incrementa la eficiencia de la PCR ya actúa como
una proteína captadora de iones que pueden ser
inhibidores de la Taq polimerasa
Lic. [Link]. Fredy Terrazas M.
Polimerasa
•En un principio, la polimerasa de DNA que
se utilizaba era de la bacteria E. coli, pero
esta es sensitiva a alta temperatura, por lo
que había que añadir enzima fresca al
comenzar el tercer ciclo.
•Se reemplazo la enzima por la de la
bacteria “Thermus aquaticus” conocida
como Taq pol
Lic. [Link]. Fredy Terrazas M.
Análisis de la Muestra
La detección del producto de la
PCR se realiza normalmente
mediante corrido
electroforético.
Dependiendo del tamaño de la
amplificación y la resolución
que deseemos utilizaremos
diferentes medios (agarosa,
poliacrilamida) a distintas
concentraciones.
Lic. [Link]. Fredy Terrazas M.
Análisis de la Muestra
• La posterior visualización se puede realizar con
bromuro de etidio (lámpara de luz UV), tinción de
plata, fluorescencia, radioactividad
Ladder: pesos conocidos
1: Fragmento a 1857 pb
2 y 4: Fragmento a 800 pb
3: No hay producto
5: Multiples bandas (primers
inespecíficos se pegan a
varios sitios)
Lic. [Link]. Fredy Terrazas M.
Análisis de la Muestra
En algunos casos, los productos
amplificados poseen secuencias que son
reconocidas por endonucleasas
Hibridación, Southern Blot
Lic. [Link]. Fredy Terrazas M.
Se puede amplificar directamente de:
ADN genómico
cDNA (RT-PCR)
Aplicaciones
Detección de agentes infecciosos como: hepatitis B
y C, papiloma virus, HIV, entre otros
Análisis de DNA de cualquier organismo vivo o
muerto, análisis de fósiles
Mutagénesis dirigida (cambios en la información
contenida a través de “primers” con mutaciones)
Investigación forense
Pruebas de paternidad
Lic. [Link]. Fredy Terrazas M.
Aplicaciones
Criminalística
Ejemplo de un caso de
criminalística resuelto
utilizando electroforesis en
gel vertical de acrilamida.
Si se observan los patrones
bandas podrá comprobarse
como los perfiles obtenidos
en las manchas de sangre
encontradas en el sombrero
(Hat) y pantalón (Jeans) del
sospechoso (S) coinciden
con el perfil genético de la
víctima (V)
Lic. [Link]. Fredy Terrazas M.
Utilidad del PCR
Lic. [Link]. Fredy Terrazas M.
Ventajas del “PCR”
A partir de una muestra pequeña de ADN se puede obtener
una cantidad considerable para el estudio que se vaya a
realizar.
El producto se puede utilizar para clonar, secuenciar y
análisis.
Se puede amplificar ADN de cualquier organismo vivo o
muerto.
Sus aplicaciones son múltiples: medicina forense,
diagnósticos, análisis prenatales, etc.
Lic. [Link]. Fredy Terrazas M.
Desventajas del “PCR”
Se puede reproducir solamente partes del genoma en
donde se conoce por lo menos una mínima secuencia de
20 – 40 pb.
Se necesitan “primers” específicos que sean
complementarios al fragmento que se desea sintetizar.
La polimerización puede tener errores al sintetizar el ADN
Puede contaminarse con otro ADN (puede ser del mismo
investigador o de cualquier otro)
Lic. [Link]. Fredy Terrazas M.
Materiales Para PCR
ADN molde (ADN en estudio)
Termociclador “Thermo cycler”
Primer Forward y Reverse
Microcentrífuga
dNTP’s (dATP, dTTP, dCTP,
Micropipetas de 2, 20 y 200 ul
dGTP de [25 μM] c/u)
Microtubos para “PCR”, estériles
10X buffer para PCR (Solución
Puntas estériles amortiguadora para “PCR”)
Agua destilada, desionizada y MgCl2 (25 mM)
estéril
BSA
Polimerasa Taq
Lic. [Link]. Fredy Terrazas M.
Fenotipo Puertorriqueño
Lic. [Link]. Fredy Terrazas M.
Herencia del DNA mitocondrial
•Amplificaremos una region hipervariable. Genoma de
16571 pares de bases: Hebra pesada (H), Hebra liviana
(L). Primer Directo H34, primer reverso L15829
Lic. [Link]. Fredy Terrazas M.
Procedimiento para extracción del DNA
genómico (previamente realizado)
Se realizó un frotis bucal
El contenido del hisopo “swab” se resuspende en 1000ul de NaCl 0.9%
Centrifugar por 5 minutos a 7K
Descarta sobrenadante
Resuspender el precipitado “pellet” en 500ul de chelex al 10%
Incubar a 100˚C por 20 minutos
Centrifugar por 5 minutos a 7K
Tomar el sobrenadante ( DNA en solución)
Dejar la muestra a -20 grados hasta cuando se va a trabajar con ella
Nota: El chelex actúa como agente desestabilizador de membranas y quelante.
Lic. [Link]. Fredy Terrazas M.
Diagrama de la extracción del DNA genómico
(previamente realizado)
Lic. [Link]. Fredy Terrazas M.
Procedimiento para amplificar el DNA (PCR)
Añada los siguientes reactivos en el orden indicado:
Cantidad (ul) Componente
10.3 Agua estéril (dH2O)
3.0 MgCl2 25mM
Mix 1
0.5 BSA 100X
17.3 1.5 2.5 Mm de dNTPs
1.0 Primer H34. 5’-3’
1.0 Primer L15829. 3’-5’
Mix 2 2.5 Buffer 10X
2.7
0.2 Taq pol
5.0 DNA en estudio
Total: 25 ul
Lic. [Link]. Fredy Terrazas M.
Condiciones para reacción en el
termociclador:
1 ciclo : 94°C por 2.5 minutos.
32 ciclos: 94 °C por 30 segundos
54 °C por 1 minutos
72 °C por 70 segundos
1 ciclo: 72 °C por 10 minutos
Lleve a reaccionar en el termociclador.
Lic. [Link]. Fredy Terrazas M.
Secuenciación de DNA
Método enzimático de terminación de cadena
(método dideoxi de Sanger)
Polimerización interrumpida de ADN
Se lleva a cado polimerización de ADN en
presencia de derivados dideoxi que detienen
la polimerización en diferente momento,
obteniéndose fragmentos de diferente tamaño.
Se examinan en electroforesis, se “lee”
secuencia directamente del gel
Lic. [Link]. Fredy Terrazas M.
Método dideoxi de Sanger
Lic. [Link]. Fredy Terrazas M.
Método dideoxi de Sanger (2)
Lic. [Link]. Fredy Terrazas M.
Método dideoxi de Sanger (3)
Lic. [Link]. Fredy Terrazas M.
Método secuenciación automática
Lic. [Link]. Fredy Terrazas M.
Electroferograma de la secuenciación
automática
Lic. [Link]. Fredy Terrazas M.
Geles de secuencia
Secuencia automática Secuencia Manual
Lic. [Link]. Fredy Terrazas M.
Direcciones de animaciones
Dirección PCR
[Link]
mples/molecularbiology/[Link]
Dirección de secuenciación
[Link]
EstructuraDelGenoma/animaciones/secuenci
[Link]
Lic. [Link]. Fredy Terrazas M.
