Capítulo 4.
Péptidos
4.1- Clasificación de los péptidos
Un péptido es un compuesto que contiene dos o más aminoácidos unidos por medio de
enlaces de amida entre el grupo amino de cada aminoácido y el grupo carboxilo del
aminoácido vecino.
A cada unidad de aminoácido en el péptido se le llama residuo. Un polipéptido es un
péptido que contiene muchos residuos de aminoácido pero por lo general tiene una masa
molecular de alrededor de 5000. Las proteínas contienen más unidades de aminoácidos,
con masas moleculares que van de alrededor de 6000 a 40 000 000. El término
oligopéptidos se usa de manera ocasional para péptidos que contienen de cuatro a diez
residuos de aminoácidos. La estructura del nonapéptido bradicinina, una hormona
humana que ayuda a controlar la presión arterial, se muestra a continuación en la figura
54.
Figura 54. Estructura de la bradicinina
Los péptidos pueden clasificarse atendiendo a la cantidad de unidades estructurales de
aminoácidos en oligopéptidos (de 2 a 20 aa) y polipéptidos (de 21 a 50 aa) y con más de
50 unidades se consideran proteínas.
A su vez los oligopéptidos pueden clasificarse en dipéptidos, tripéptidos, etc. A los
aminoácidos que se encuentran en los extremos se les denomina N-terminal y C-
terminal. Por ejemplo, el dipéptido alanil-glicina que se muestra en la figura 55.
Figura 55. Fórmula lineoangular de la alanil-glicina
El aminoácido alanina es el grupo N-terminal y la glicina es el C-terminal.
4.2- Nomenclatura de los péptidos
Los nombres de los péptidos reflejan los nombres de los residuos de aminoácido
involucrados en los enlaces de amida, comenzando en el N terminal. Todos con
excepción del último se les dan el sufijo -il de los grupos acilo. Por ejemplo, el siguiente
péptido se nombra alanilserina. El residuo de alanina tiene el sufijo -il debido a que
tiene acilado el nitrógeno de la serina.
La bradicinina (figura 54) se nombra como sigue, sin espacios:
Arginil prolil prolil glicil fenilalanil seril prolil fenilalanil arginina
Y sin dudas es un nombre engorroso, de ahí que se utilice un sistema más abreviado
donde cada aminoácido se nombra con tres letras, como aparece en la tabla 3 de la
página 41. De esta forma el nombre anterior sería:
Arg-Pro-Pro-Gli-Fen-Ser-Pro-Fen-Arg
También, con letras sencillas sería:
RPPGFSPFR
Representación que se utiliza actualmente con frecuencia, sobre todo cuando la
secuencia de aminoácidos es muy larga.
Ejercicio propuesto
4.1- Dibuje las estructuras completas de los siguientes péptidos:
(a) Tre-Fen-Met (b) serilarginilglicilfenilalanina (c) IMQDK (d) ELVIS
4.3- Estructura de los péptidos
En el capítulo anterior se estudió la reacción de aminoácidos para la formación de
péptidos de forma general. En la figura 54 se observó el enlace que une a ambas
unidades estructurales de aminoácidos conocido con el nombre de enlace peptídico. La
estructura que adopta el grupo peptídico que contiene al enlace peptídico se muestra en
la figura 56.
Figura 56. Disposición espacial del grupo peptídico
El enlace peptídico es más rígido y corto que el enlace C-N simple, además, los átomos
que forman el grupo peptídico son coplanares y pueden presentarse en forma cis o trans.
Debido a esas características el doble enlace puede considerarse un híbrido de
resonancia que no permite giro alrededor del enlace C-N, de ahí que se diga que es
rígido. Los ángulos y distancias de enlaces del grupo peptídico se muestran en la figura
57.
Figura 57. Ángulos y distancias de enlaces entre los átomos en el grupo peptídico
Las conformaciones posibles (cis y trans) se pueden observar en la figura 58,
generalmente se encuentran en forma trans, aunque en la prolina las moléculas adoptan
forma cis.
Figura 58. Conformaciones del grupo peptídico
Enlaces disulfuros
Los enlaces de amida (enlaces peptídicos) forman el esqueleto de las cadenas de
aminoácidos a los que llamamos péptidos y proteínas. Es posible un segundo tipo de
enlace covalente entre cualquier residuo de cisteína presente. Los residuos de cisteína
pueden formar puentes disulfuro (también llamados enlaces disulfuro) los cuales pueden
unir dos cadenas o bien unir una sola cadena para formar un anillo.
La oxidación moderada une dos moléculas de un tiol en un disulfuro, formándose un
enlace disulfuro entre las dos moléculas de tiol. Esta reacción es reversible y una
reducción moderada rompe el disulfuro.
De manera similar, dos grupos sulfhidrilo (-SH) de la cisteína se oxidan para formar un
par de aminoácidos enlazados por un disulfuro. A este dímero de la cisteína enlazado
por un disulfuro se le llama cistina. La figura 59 muestra la formación de un puente
disulfuro de una cisteína enlazado a dos cadenas de péptido.
Figura 59. Formación de la cistina
Dos residuos de cisteína pueden formar un puente disulfuro dentro de una cadena de
péptido sencilla, formando un anillo. La figura 60 muestra la estructura de la oxitocina
humana, una hormona peptídica que ocasiona la contracción del músculo uterino e
induce el parto. La oxitocina es un nonapéptido con dos residuos de cisteína (en las
posiciones 1 y 6) que unen parte de la molécula en un anillo grande. Observe que el C
terminal de la oxitocina es una amida primaria (Gli. NH2) en vez de un grupo carboxilo
libre.
Figura 60. Estructura de oxitocina humana
De forma similar se puede representar simplificadamente como lo muestra la figura 61.
Figura 61. Representación de la oxitocina utilizando la nomenclatura de tres letras para
los aminoácidos
4.4- Determinación de la estructura de péptidos
La determinación de la estructura de péptidos consta de varios pasos, el primero de ellos
es la ruptura de los enlaces disulfuro, abriendo el anillo enlazado por un disulfuro y
separando las cadenas de péptido individuales, las que se purifican y analizan por
separado.
Los puentes de cistina se rompen con facilidad reduciéndolos a la forma de tiol
(cisteína). Sin embargo, estos residuos de cisteína reducida tienen una tendencia a
volverse a oxidar y a formar los puentes disulfuro. Una ruptura más permanente
involucra la oxidación del enlace disulfuro con ácido peroxifórmico (figura 62). Esta
oxidación convierte los puentes disulfuro a grupos ácido sulfónico (-SO3H). A las
unidades de cisteína oxidada se les llaman residuos de ácidos cisteico.
Figura 62. Oxidación de una proteína por el ácido peroxifórmico
El ácido peroxifórmico oxida a la proteína y rompe todos los enlaces disulfuro por
medio de la oxidación de la cistina a ácido cisteico.
El segundo paso es la determinación de la composición de los aminoácidos en la cadena
carbonada, una vez que se hayan roto los enlaces disulfuro, se hayan separado y
purificado las cadenas de péptidos individuales.
Primero se determina cuáles aminoácidos están presentes y en qué proporciones. Para
analizar la composición de los aminoácidos, la cadena de péptido se hidroliza por
completo hirviéndola por 24 horas en presencia de HCl de concentración 6 mol/L. La
mezcla resultante de los aminoácidos (el hidrolizado) se coloca en la columna de un
analizador de aminoácidos, cuyo diagrama se muestra en la figura 63.
Figura 63. Analizador de aminoácidos
En el analizador de aminoácidos, los componentes del hidrolizado se disuelven en una
disolución reguladora acuosa y se separan pasándolos a través de una columna de
intercambio iónico. La disolución que emerge de la columna se mezcla con ninhidrina,
la cual reacciona con los aminoácidos para dar el color púrpura de la ninhidrina. Se
registra la absorción de la luz y se imprime como una función del tiempo.
El tiempo requerido para que cada aminoácido pase a través de la columna (su tiempo
de retención) depende de qué tan intensamente interactúa el aminoácido con la resina de
intercambio iónico. El tiempo de retención de cada aminoácido se conoce a partir de la
estandarización con los aminoácidos puros. Los aminoácidos presentes en la muestra se
identifican comparando sus tiempos de retención con los valores conocidos. El área bajo
cada pico es casi proporcional a la cantidad del aminoácido que produce ese pico, por lo
que se puede determinar las cantidades relativas de los aminoácidos presentes.
La figura 64 muestra un perfil de trazado estándar de una mezcla equimolar de
aminoácidos, seguida por un perfil de trazado producido por el hidrolizado de la
bradicinina humana (Arg-Pro-Pro-Gli-Fen-Ser-Pro-Fen-Arg).
Figura 64. Resultado del analizador de aminoácidos para determinar la composición de
la bradicinina humana
Los picos de la bradicinina humana para la prolina, arginina y fenilalanina son mayores
que aquellos en la mezcla equimolecular estándar, debido a que la bradicinina tiene tres
residuos de arginina y dos de fenilalanina.
Otro de los pasos a seguir es la secuenciación del péptido y el análisis de los residuos
terminales. El analizador de aminoácidos determina los aminoácidos presentes en un
péptido, pero no revela su secuencia; es decir, el orden en el que se unen entre sí. La
secuencia del péptido se destruye en el paso de la hidrólisis.
Para determinar la secuencia de los aminoácido debe romper sólo un aminoácido de la
cadena y dejar el resto de la cadena intacta. El aminoácido roto puede separarse e
identificarse, y el proceso puede repetirse en el resto de la cadena. El aminoácido puede
romperse a partir de cualquier extremo del péptido (del N terminal o del C terminal), y
consideraremos un método usado para cada extremo. A este método general en la
secuenciación de péptidos se le llama análisis de los residuos terminales.
Secuenciación a partir del N-terminal. Degradación de Edman
El método más eficiente para la secuenciación de péptidos es la degradación de Edman.
Un péptido se trata con isotiocianato de fenilo, seguido por una hidrólisis ácida. Los
productos son la cadena de péptido acortada y un derivado heterocíclico del aminoácido
N-terminal llamado feniltiohidantoína.
Esta reacción se lleva a cabo en tres etapas. Primero, el grupo amino libre del
aminoácido
N-terminal reacciona con el isotiocianato de fenilo para formar una feniltiourea.
Segundo, la feniltiourea se cicla para formar una tiazolinona y se libera la cadena de
péptido acortada. Tercero, la tiazolinona se isomeriza a la feniltiohidantoína más
estable.
El derivado de la feniltiohidantoína se identifica por medio de la cromatografía,
comparándolo con los derivados de feniltiohidantoína de los aminoácidos estándar. Esto
proporciona la identidad del aminoácido N-terminal original. El resto del péptido se
queda intacto después de la ruptura y se usan degradaciones de Edman posteriores para
identificar al resto de los aminoácidos adicionales en la cadena. Este proceso es
adecuado para la automatización y se han desarrollado varios tipos de secuenciadores
automáticos.
La figura 65 muestra los primeros dos pasos en la secuenciación de la oxitocina. Antes
de la secuenciación, la muestra de oxitocina se trata con ácido peroxifórmico para
convertir el puente disulfuro a residuos de ácido cisteico.
En teoría, las degradaciones de Edman podrían secuenciar un péptido de cualquier
longitud. Sin embargo, en la práctica los ciclos de degradación repetidos ocasionan algo
de hidrólisis interna del péptido, con pérdida de la muestra y la acumulación de
subproductos. Después de alrededor de 30 ciclos de degradación, el análisis posterior
preciso se vuelve imposible. Un péptido pequeño como la bradicinina puede
determinarse por completo por medio de la degradación de Edman, pero las proteínas
más grandes deben romperse en fragmentos más pequeños antes de que se puedan
secuenciar por completo.
Figura 65. Los primeros dos pasos en la secuenciación de la oxitocina. Cada
degradación de Edman rompe el aminoácido N-terminal y forma su derivado de
feniltiohidantoína. El péptido acortado está disponible para el siguiente paso
Ejercicio propuesto
4.2- Represente el tercer y el cuarto paso en la secuenciación de la oxitocina, para ello
use la figura 65 como guía.
Análisis del residuo C-terminal
La secuenciación de varios aminoácidos de un péptido comenzando desde el C terminal
pueden identificarse usando la enzima carboxipeptidasa, la cual rompe el enlace
peptídico C-terminal. Los productos son el aminoácido C-terminal libre y un péptido
acortado. La reacción posterior rompe el segundo aminoácido que ahora se ha vuelto el
nuevo C terminal del péptido acortado. Con el tiempo, el péptido completo se hidroliza
en sus aminoácidos individuales.
Se incuba un péptido con la enzima carboxipeptidasa y se monitorea la aparición de los
aminoácidos libres. En teoría, el aminoácido cuya concentración aumenta primero debe
ser el C terminal y el siguiente aminoácido en aparecer debe ser el segundo residuo del
extremo. En la práctica, diferentes aminoácidos se rompen a distintas velocidades,
haciendo difícil determinar los aminoácidos después del C terminal y en ocasiones el
segundo residuo en la cadena.
Ruptura del péptido en cadenas más cortas. Hidrólisis parcial
Antes de que pueda secuenciarse una proteína grande, debe romperse en cadenas más
pequeñas, no mayores a 30 aminoácidos. Cada una de estas cadenas acortadas se
secuencia y después se deduce la estructura completa de la proteína ajustando las
cadenas cortas como las piezas de un rompecabezas.
La ruptura parcial puede lograrse usando ácido diluido con tiempos de reacción cortos o
bien usando enzimas, como la tripsina y la quimotripsina, que rompen enlaces
específicos entre los aminoácidos. La ruptura catalizada por un ácido no es muy
selectiva, conduciendo a una mezcla de fragmentos cortos que resulta de la ruptura en
varias posiciones.
Las enzimas son más selectivas, obteniendo rupturas en puntos predecibles en la cadena.
La tripsina rompe la cadena en los grupos carboxilo de los aminoácidos básicos lisina y
arginina; y la quimotripsina rompe la cadena en los grupos carboxilos de los
aminoácidos aromáticos fenilalanina, tirosina y triptófano.
Un ejemplo es la hidrólisis parcial de la oxitocina. La oxitocina podría secuenciarse de
manera directa por medio del análisis del C-terminal y una serie de degradaciones de
Edman, pero ofrece un ejemplo sencillo de cómo puede armarse una estructura a partir
de los fragmentos. La hidrólisis parcial catalizada por un ácido de la oxitocina (después
de la ruptura del puente disulfuro) forma una mezcla que incluye los siguientes
péptidos:
Ile-Gln-Asn-Cis Gln-Asn-Cis-Pro Pro-Leu-Gli .NH 2 Cis-Tir-Ile-Gln-Asn Cis-Pro-Leu-Gli
Después se analizan por dónde deben unirse los aminoácidos para determinar la
secuencia:
Cis-Tir-Ile-Gln-Asn
Ile-Gln-Asn-Cis
Gln-Asn-Cis
Cis-Pro-Leu- Gli
Pro-Leu-Gli .NH2
Estructura completa
Cis-Tir-Ile-Gln-Asn-Cis-Pro-Leu-Gli .NH2
En los dos residuos de Cis en la oxitocina pueden estar involucrados puentes disulfuro,
enlazando dos de estas unidades de péptido o formando un anillo. Si medimos la masa
molecular de la oxitocina, podemos demostrar que sólo contiene una de estas unidades
de péptido; por lo tanto, los residuos de Cis deben unir la molécula en un anillo.
Ejercicios propuestos
4.3- Muestre dónde rompería la tripsina y la quimotripsina el péptido siguiente:
Tir-Ile-Gln-Arg-Leu-Gli-Fen-Lis-Asn-Trp-Fen-Gli-Ala-Lis-Gli-Gln-Gln .NH2
4.4- Después de tratarla con ácido peroxifórmico, la hormona peptídica vasopresina se
hidroliza de manera parcial y se recuperan los fragmentos siguientes. Proponga una
estructura para la vasopresina.
Fen-Gln-Asn Pro-Arg-Gli .NH2 Cis-Tir-Fen
Asn-Cis-Pro-Arg Tir-Fen-Gln-Asn
Síntesis de péptidos en disolución
La síntesis de péptidos requiere de la formación de enlaces de amida entre los
aminoácidos apropiados en la secuencia apropiada. Con ácidos y aminas sencillos se
formaría un enlace amida simplemente convirtiendo el ácido a un derivado activado
(como un haluro de acilo o anhídrido) y adicionando la amina.
Sin embargo, la formación de amidas no es fácil con los aminoácidos. Cada aminoácido
tiene un grupo amino y un grupo carboxilo. Si se activa el grupo carboxilo, reacciona
con su propio grupo amino. Si se mezcla algunos aminoácidos y se adiciona un reactivo
para acoplarlos, forman cada secuencia posible, también, algunos aminoácidos tienen
cadenas laterales que podrían interferir con la formación de los péptidos. Por ejemplo, el
ácido glutámico tiene un grupo carboxilo extra y la lisina tiene un grupo amino extra.
Como resultado, la síntesis de péptidos siempre involucra reactivos activadores para
formar los enlaces peptídicos correctos y grupos protectores para bloquear la formación
de enlaces incorrectos.
Los químicos han desarrollado muchas maneras de sintetizar péptidos, que se agrupan
en dos grupos principales. El método en disolución involucra la adición de reactivos a
las disoluciones de cadenas de péptido en crecimiento y la purificación de los productos
conforme se necesite.
El método en fase sólida involucra la adición de reactivos a las cadenas de péptidos en
crecimiento unidas a partículas de polímeros sólidos. Se disponen de muchos reactivos
distintos para cada uno de estos métodos, pero sólo se considerará un conjunto de
reactivos para el método en disolución y un conjunto para el método en fase sólida. Los
principios generales son los mismos sin importar los reactivos específicos.
Métodos en disolución
La estructura de la alanilvalilfenilalanina es la siguiente:
Si se aplica el método de síntesis en disolución, que comienza en el N terminal y
finaliza en el C terminal, o de izquierda a derecha conforme se dibuja el péptido, el
primer paso principal es el acoplamiento del grupo carboxilo de la alanina al grupo
amino de la valina. Esto no puede realizarse simplemente activando el grupo carboxilo
de la alanina y adicionando la valina. Si se activa el grupo carboxilo de la alanina,
reaccionaría con otra molécula de la misma alanina.
Para prevenir las reacciones secundarias, el grupo amino de la alanina debe protegerse
para hacerlo no nucleofílico. Un aminoácido reacciona con cloroformiato de bencilo
(también llamado cloruro de benciloxicarbonilo) para formar un uretano, o un éster de
carbamato, que se elimina con facilidad al final de la síntesis. Este grupo protector se ha
usado por muchos años y ha adquirido varios nombres. Se le llama grupo
benciloxicarbonilo, grupo carbobenzoxi (Cbz, por sus siglas en inglés) o sólo grupo Z.
A continuación se presenta la ecuación de la reacción:
El grupo amino en el Z-Ala está protegido como la amida no nucleofílica en la mitad de
un éster de carbamato. El grupo carboxilo puede activarse sin reaccionar con el grupo
amino protegido. Cuando se trata con cloroformiato de etilo convierte al grupo
carboxilo en un anhídrido mixto del aminoácido y el ácido carbónico, está muy activado
hacia el ataque nucleofílico.
Paso 1: activar el grupo carboxilo con cloroformiato de etilo.
Cuando se adiciona el segundo aminoácido (valina) al aminoácido protegido, la alanina
activada, el grupo amino nucleofílico de la valina ataca al grupo carbonilo activado de
la alanina, desplazando al anhídrido y formando un enlace peptídico. (Algunos
procedimientos usan un éster del nuevo aminoácido para evitar reacciones que compitan
a partir de su grupo carboxilato).
Paso 2: formar un enlace de amida para acoplar el siguiente aminoácido.
Hasta este punto se ha protegido el N en el dipéptido Z-Ala-Val. La fenilalanina debe
adicionarse al C terminal para completar el tripéptido Ala-Val-Fen. La activación del
grupo carboxilo de la valina, seguida por la adición de la fenilalanina, forma el
tripéptido protegido.
Para preparar un péptido más grande, se repite estos dos pasos en la adición de cada
residuo de aminoácido:
1. Activar el C terminal del péptido en crecimiento por medio de la reacción con
cloroformiato de etilo.
2. Acoplar el siguiente aminoácido.
El paso final en la síntesis en disolución es desproteger el N terminal del péptido
completado. El enlace de amida del N-terminal debe romperse sin romper ninguno de
los enlaces peptídicos en el producto. El grupo benciloxicarbonilo es en parte una amida
y en parte un éster bencílico, y la hidrogenólisis del éster bencílico se lleva a cabo en
condiciones moderadas que no rompen los enlaces peptídicos. Esta ruptura moderada es
la razón del uso del grupo benciloxicarbonilo (a diferencia de algún otro grupo acilo)
para proteger el N terminal.
Ejercicio propuesto
4.5- Demuestre cómo sintetizaría Ala-Val-Fen-Gli-Leu comenzando con Z-Ala-Val-
Fen.
El método en disolución funciona bien para péptidos pequeños y se han sintetizado
muchos péptidos por medio de este proceso. Sin embargo, se requiere un gran número
de reacciones químicas y purificaciones incluso para un péptido pequeño. Aunque los
rendimientos individuales son excelentes, con un péptido grande, el rendimiento general
se vuelve tan pequeño que es inservible y se requieren varios meses (o años) para
completar tantos pasos. Las cantidades grandes de tiempo requeridas y los bajos
rendimientos generales se deben en gran medida a los pasos de purificación. Para los
péptidos y proteínas grandes, por lo general se prefiere la síntesis de péptidos en fase
sólida.
Síntesis de péptidos en fase sólida
En 1962, Robert Bruce Merrifield de la Rockefeller University desarrolló un método
para la síntesis de péptidos sin tener que purificar los intermediarios. Realizó esto
uniendo las cadenas de péptidos en crecimiento a perlas sólidas de poliestireno. Después
de adicionar cada aminoácido, se lavan los reactivos en exceso enjuagando las perlas
con un disolvente. Este método conduce a la automatización y Merrifield construyó una
máquina que puede adicionar varias unidades de aminoácido mientras funciona sola.
Usando esta máquina, Merrifield sintetizó la ribonucleasa (124 aminoácidos) en sólo
seis semanas, obteniendo un rendimiento general del 17 %. El trabajo de Merrifield en
la síntesis de péptidos en fase sólida fue premiado con el Premio Nobel de Química en
1984.
Tres reacciones son cruciales para la síntesis de péptidos en fase sólida. Estas reacciones
unen el primer aminoácido al soporte sólido, protegen cada grupo amino hasta que es
tiempo de reaccionar y forman los enlaces peptídicos entre los aminoácidos.
Unión del péptido al soporte sólido. La mayor diferencia entre la síntesis de péptidos en
disolución y en fase sólida es que la síntesis en fase sólida se realiza en la dirección
opuesta: comenzando con el C terminal y yendo hacia el N terminal, de derecha a
izquierda como escribimos el péptido. El primer paso es unir el último aminoácido (el C
terminal) al soporte sólido.
El soporte sólido es una perla de poliestireno especial en la que algunos de los anillos
aromáticos tienen el grupo clorometilo. Este polímero, con frecuencia llamado resina
de
Merrifield, se prepara por medio de la copolimerización del estireno con un bajo
porcentaje de p-(clorometil) estireno.
Como otros haluros de bencilo, los grupos clorometilo en el polímero son reactivos
hacia el ataque SN2. El grupo carboxilo de un aminoácido N-protegido desplaza el
cloruro, formando un éster de aminoácido del polímero. De hecho, el polímero actúa
como la parte de alcohol de un grupo protector éster para el extremo carboxilo del
aminoácido C-terminal. El grupo amino debe protegerse o atacaría a los grupos
clorometilo.
De nuevo el aminoácido terminal se fija al polímero, la cadena se construye sobre el
grupo amino de este aminoácido.
Uso del grupo protector ter–Butiloxicarbonilo (Boc) El grupo benciloxicarbonilo
(grupo Z) no puede usarse con el proceso en fase sólida debido a que el grupo Z se
elimina por medio de una hidrogenólisis en contacto con un catalizador sólido. Un
péptido unido a un polímero no puede lograr el contacto íntimo con un catalizador
sólido requerido para la hidrogenólisis. El grupo N-protector usado en el procedimiento
de Merrifield es el grupo ter-butiloxicarbonilo, abreviado Boc o t–Boc. El grupo Boc es
similar al grupo Z, excepto que tiene un grupo ter-butilo en lugar del grupo bencilo.
Como otros ésteres ter-butílicos, el grupo protector Boc se elimina con facilidad en
condiciones ácidas.
El cloruro de ácido del grupo Boc es inestable, por lo que se usa el anhídrido, di-ter-
butildicarbonato, para unir el grupo al aminoácido.
El grupo Boc se rompe con facilidad cuando se trata con ácido trifluoroacético (TFA)
por tiempos de reacción cortos, CF3COOH. La pérdida de un catión ter-butilo
relativamente estable del éster protonado forma un ácido carbámico inestable. La
descarboxilación del ácido carbámico forma el grupo amino desprotegido del
aminoácido. La pérdida de un protón del catión ter-butilo forma isobutileno.
Las personas que sintetiza péptidos por lo general no prepara sus propios aminoácidos
protegidos con Boc, debido a que usan todos los aminoácidos en la forma protegida,
compran y usan aminoácidos protegidos con Boc comercialmente disponibles.
Uso de DCC como un agente de acoplamiento de péptidos La reacción final necesaria
para el procedimiento de Merrifield es la condensación que forma el enlace peptídico.
Cuando una mezcla de una amina y un ácido se trata con N, N´-diciclohexilcarbodiimida
(abreviada DCC), la amina y el ácido se acoplan para formar una amida. La molécula de
agua perdida en esta condensación convierte el DCC en la N, N´ -diciclohexilurea
(DCU).
El mecanismo para el acoplamiento con DCC no es tan complicado como parece. El ion
carboxilato se adiciona al carbono muy electrofílico de la diimida, formando un
derivado de acilo activado del ácido. Este derivado activado reacciona rápidamente con
la amina para formar la amida. En el paso final, la DCU sirve como un grupo saliente
excelente. Los anillos de ciclohexano se miniaturizan para una mayor claridad.
En el paso final de la síntesis, el enlace de éster con el polímero se rompe por medio del
HF anhidro. Debido a que éste es un enlace de éster, se rompe con mayor facilidad que
los enlaces de amida del péptido.
Resumen de la síntesis de péptidos en fase sólida
1. Va de C a N. Unir el C terminal protegido con Boc a la primera perla.
2. Acoplar cada aminoácido eliminando (con TFA) el grupo Boc del N terminal,
después adicionar el siguiente aminoácido protegido con Boc con la DCC.
3. Romper (con HF) el péptido finalizado con la perla del polímero.
Un ejemplo de la síntesis de péptido en fase sólida es la síntesis del tripéptido:
Ala-Val-Fen
La síntesis en fase sólida se lleva a cabo en la dirección opuesta a la síntesis en
disolución.
El primer paso es la unión del aminoácido C-terminal N-protegido (Boc-fenilalanina) al
polímero.
El ácido trifluoracético (TFA) rompe el grupo protector Boc de la fenilalanina para que
el grupo amino pueda acoplarse con el aminoácido siguiente:
El segundo aminoácido (valina) se adiciona en la forma Boc N-protegida para que no
pueda acoplarse consigo mismo. La adicción de DCC acopla el grupo carboxilo de la
valina con el grupo -NH2 libre de la fenilalanina.
Para acoplar el aminoácido final (alanina), primero se desprotege la cadena cuando se
trata con ácido trifluoroacético. Después se adicionan la Boc-alanina N-protegida y la
DCC.
Para preparar un péptido más grande, la adición de cada aminoácido siguiente requeriría
la repetición de dos pasos:
1. Usar el ácido trifluoroacético para desproteger el grupo amino en el extremo de la
cadena en crecimiento.
2. Adicionar el siguiente Boc-aminoácido, usando DCC como agente de acoplamiento.
Una vez que se complete el péptido, se debe eliminar el grupo protector Boc final y se
debe romper el péptido del polímero. El HF anhidro rompe el enlace de éster que une al
péptido con el polímero y también elimina al grupo protector Boc. En nuestro ejemplo,
ocurre la reacción siguiente:
Ejercicios propuestos
4.6- Proponga la síntesis del péptido Leu-Gli-Ala-Val-Fen comenzando con Boc-Ala-
Val-Fen-P.
4.7- Demuestre cómo usaría la síntesis de péptidos en fase sólida para preparar Ile-Gli-
Asn.
