La 

cromatografía de intercambio iónico.

DEFINICIÓN:

La cromatografía de intercambio iónico (o cromatografía iónica) es un proceso

que permite la separación de iones y moléculas polares basadas en las
propiedades de carga de las moléculas. Puede ser usada en casi cualquier tipo
de molécula cargada, incluyendo proteínas grandes, nucleótidos y aminoácidos y
azúcares pequeños.

IMPOTANCIA:

Es una poderosa técnica para determinar bajas concentraciones y es

especialmente útil en estudios del medio ambiente (la calidad del agua). Entre
otras aplicaciones como industria alimentaria, farmacéuticas.

FASES:

Se compone de dos fases

 Fase Estacionaria: insoluble, lleva en la superficie cargas

electrostáticas fijas, que retienen contraiones móviles que pueden
intercambiarse por iones de la fase móvil.
 Fase Móvil: en cromatografía de intercambio iónico suele ser una
disolución acuosa con cantidades moderadas de metanol u otro
disolvente orgánico miscible con agua que contiene especies iónicas en
forma, generalmente de buffer.

PRINCIPIO:

La cromatografía de intercambio iónico conserva los analitos basándose en las

interacciones de Coulomb. La fase estacionaria muestra en la superficie
grupos funcionales iónicos (R-X) que interactúan con iones de carga opuesta
del analito.

Las moléculas cargadas se adhieren a los intercambiadores de forma

reversible de modo que dichas moléculas pueden ser unidas o desunidas
cambiando el ambiente iónico.
Esto quiere decir que:

 las partículas cargadas negativamente se unen a la matriz sólida

cargada positivamente y son retenidas.

 Las partículas cargadas positivamente son rechazadas por la matriz

sólida cargada positivamente y son eluidas.

 La elución de las partículas cargadas negativamente se consigue

cambiando e ph del solvente hasta igualarlo a su punto isoeléctrico o
hasta invertir su carga neta.

Técnicas de la cromatografía:

Este tipo de cromatografía se subdivide a su vez en dos técnicas.

R-X+ es el analito presente en la columna (Grupo funcional) ya sea cargado

negativamente o positivamente , C+ es el catión, A- es el anión, M+ es la
muestra y B+ es el ion de la muestra

 La cromatografía de intercambio catiónico retiene cationes cargados

positivamente debido a que la fase estacionaria muestra un grupo
funcional cargado negativamente,

Ejemplo:

Estructuras de resinas intercambiables

De cationes:
A) Resina de poliestireno -el grupo sulfónico, SO3-
intercambiador de cationes fuertemente acido),
B) Resina de carboximetil celulosa-Grupo carbolilo e
hidroxilo fenólico -  intercambiadores catiónicos
débilmente ácidos)
C) Resina de poliestireno, ácido Para realizar una
cromatografía de intercambio iónico débil y quelante
  La cromatografía de intercambio aniónico retiene aniones cargados
negativamente usando grupos funcionales cargados positivamente.

ejemplo:

Estructuras de resinas intercambiables

De aniones.

A) Resina de poliestireno-
intercambiadores aniónicos base
fuerte

(B) Resina de dietilaminoetil celulosa-

intercambiadores aniónicos ácido débil

La elección entre intercambiadores fuertes o débiles está basada en el

efecto del pH sobre la carga y la estabilidad.
Por ejemplo, si se va a cromatografiar una sustancia débilmente ácida
que necesita pH muy altos o muy bajos para su ionización, se requiere
un intercambiador fuerte debido que este funciona a pH extremos. Pero
si la sustancia es lábil, es preferible la utilización de intercambiadores
débiles.

FUNCIONAMIENTO DE LA TÉCNICA:

1. Una muestra es introducida, de forma manual o con autosampler dentro de

un ciclo de muestras de volumen conocido.

2. Una solución acuosa tamponada conocida como fase móvil lleva la muestra

del ciclo de muestras a la columna de cromatografía que contiene un analito
en fase estacionaria.
Este analito es típicamente una resina o matriz de gel que consiste
en agarosa o celulosa unidos mediante enlace covalente a grupos funcionales
cargados como puede ser una resina de intercambio catiónico.

3. Los analito objetivos (aniones o cationes) son conservados en la fase

estacionaria pero pueden ser eliminados incrementando la concentración de
especies de similar carga que pueden desplazar los iones analitos de la fase
estacionaria. Por ejemplo, en la cromatografía de intercambio catiónico, los
analitos cargados positivamente pueden ser desplazados agregando iones
de sodio cargados positivamente.

4. Los analitos de interés pueden entonces ser detectados de varias maneras,

típicamente por conductividad o por absorción de luz UV o Visible, donde se
registra la señal obtenida respecto al tiempo de retención.

5. El resultado son unos cromatográmas donde la posición de los máximos nos

indica el ión presente (carácter cualitativo) y su área nos indica que cantidad
existente de dicho ión (carácter cuantitativo).

Para controlar un sistema de Cromatografía de Iones (CI),

usualmente es necesario un Sistema de Datos Cromatográficos
(Chromatography Data System, CDS). donde se registra la señal

ESQUEMA GENERAL DEL EQUIPO DE CROMATOGRAFÍA IÓNICA

En la figura se muestra un esquema de los principales componentes del
equipo.
La alimentación externa para la fase móvil es exclusivamente agua de baja
conductividad (< 0,054 μSiemens/cm) que pasa por una trampa de iones de
modo de asegurarnos que el detector sólo responda a los analitos presentes en
la muestra.
Luego, una bomba la impulsa a la cámara del EG (generador de eluyente) en
donde se genera la FM (fase móvil) por migración iónica de cargas desde un
reservorio; pasa por el desgasificador que elimina los gases liberados durante
el proceso electrolítico y llega posteriormente al inyector.
Allí ingresa la muestra al sistema y luego alcanza la entrada de la columna; a
la salida de la misma la tenemos separada en sus analito componentes.

Entonces pasa por el supresor el cual disminuye casi de un modo total la señal
de la FM. Es en estas condiciones que los analitos de la muestra llegan al
detector. La señal eléctrica es procesada generando picos cuyas áreas son
proporcionales a su concentración.
La FM que sale del detector es recirculada pasando en contracorriente por el
supresor y seguidamente por la trampa de iones para proveerlos de agua en
forma permanentemente, permitiendo que el proceso electrolítico en ambos
compartimientos sea continuo.
MATERIALES
o Columna de vidrio
o Matriz de intercambio iónico
o Eluyente
o Muestra a fraccionar
o Colectores.

ETAPAS:

1- Equilibrio: El primer paso es el equilibrio de la fase estacionaria con las

condiciones iniciales deseadas. Cuando el equilibrio se ha logrado, toda la fase
estacionaria se encuentra asociada a iones complementarios (que pueden ser
cloro o sodio). Por ejemplo, un intercambiador catiónico sulfonado asociado a
Na+ producto de la disociación de NaOH.
2- Aplicación y Lavado: El paso siguiente es sembrar la muestra a la cual
queremos filtrar a través de la columna mediante un lavado específico. Para
ello es necesario aplicar un buffer con el mismo pH y fuerza iónica que el
buffer inicial para que todas las proteínas cargadas se unan al intercambiador.
Por ejemplo: A la forma sódica de la resina lavada se le añade una solución
ácida (pH=3) de la mezcla de aminoácidos; a dicho pH los aminoácidos se
encuentran en forma de cationes con carga neta positiva. Los aminoácidos
catiónicos tienden a desplazar algunos de los iones ligados a las partículas de
resina. A pH 3 los aminoácidos más básicos se unirán a la resina de forma más
estrecha que los más ácidos.

3- Elusión: Las moléculas captadas por el intercambiador son eluídas debido

a cambios en la composición del buffer. La elusión puede realizarse de dos
formas diferentes; la más usual consiste en aumentar progresivamente la
concentración de un contra ión, de modo de desplazar el equilibrio de unión de
la macromolécula hacia la forma libre. El contraión es normalmente una sal,
disuelta en eluyente (NaCl, KCl, etc).

Las macromoléculas de una mezcla se irán desplazando de manera secuencial,

de acuerdo a la fuerza de unión: las que posean menos densidad de carga
eluiran antes, mientras que para las de mayor carga neta el tiempo de retención
será mayor. La otra manera es realizar un cambio en el PH del solvente; esta
técnica se emplea con intercambiadores débiles. La lógica es que al cambiar el
PH, de modo de acercarnos al PI de cada proteína, la carga neta de esta irá
disminuyendo y en algún punto dejara de interaccionar con la matriz. Sin
embargo, esta técnica posee sus desventajas. Dado que es este caso las
proteínas se eluiran a un PH igual a su PI su solubilidad estará disminuida y
pueden precipitar. Además, La disminución del pH protonará a los grupos
negativos de los aminoácidos, por lo que su carga neta tenderá a ser positiva,
por lo cual se necesitaran intercambiadores cationicos ( portadores de grupos
con cagas negativas) que van a unir estos cationes de forma reversible; en
contraposición el aumento del PH provocara una desprotonación de los grupos
positivos de los aminoácidos, por lo cual su carga neta tendera a ser negativa;
necesitándose asi intercambiadores anionicos que unan reversiblemente cargas
negativas.
4- Regeneración: Por último, se remueven las partículas que aún están
asociadas al intercambiador. Los iones que se adhieren a los sitios activos de
la resina son de muy diferente tipo y pueden ser removidos total o
parcialmente durante el proceso de regeneración. Una vez agotadas las resinas,
se pueden regenerar a su forma inicial para reanudar la operación de
intercambio. Así, el intercambio iónico es un proceso cíclico y no continuo. La
regeneración de las resinas se hace según reacciones inversas.

FACTORES QUE AFECTAN LA RETENCIÓN:

Tiempo de retención (Tr): Es el tiempo que un compuesto tarda en salir de la

columna En la cromatografía de intercambio iónico la retención está basada en
la atracción entre iones del soluto y la carga complementaria de la fase
estacionaria. Los intercambiadores iónicos favorecen la unión de iones de
mayor carga y radio inferior. Cuando la retención de los compuestos se ve
afectada, se favorece la elusión de ellos para ser recolectados en una serie de
fracciones

PH: Los intercambiadores iónicos se clasifican en ácidos o básicos, fuertes o

débiles. Las resinas ácidas fuertes siguen ionizadas incluso en disoluciones
muy ácidas, en cambio las resinas ácidas débiles se protonan a un pH próximo
a 4 y pierden su capacidad de intercambio catiónico, reduciéndose así, el
tiempo de retención. Los grupos muy básicos de amonio cuaternario siguen
siendo catiónicos a cualquier valor de pH. Los básicos débiles de amonio
terciario se desprotonan en disoluciones moderadamente básicas y pierden
entonces su capacidad, reduciéndose también el tiempo de retención.

Cargas: La fuerza de enlace de la muestra depende de la magnitud de la

carga. La fuerza de retención es mayor y, por consiguiente la de elusión es
menor, mientras más cargado se encuentre el compuesto, ya sea negativa
(aniones) o positivamente (cationes).
Los iones polivalentes se unen con mayor fuerza a la fase estacionaria que los

monovalentes.

Gradiente: Aumentando la concentración de la fase móvil, los iones compiten

cada vez más favorablemente con la muestra por los sitios activos cargados de
la fase estacionaria
Esquema del gradiente del Buffer con contraiones cargados negativamente.
Se presenta un gráfico con el poder de elusión (fuerza iónica) y el porcentaje
de proteína eluída, que muestra una gradiente directamente proporcional.

 Porosidad: El tamaño del poro de la resina al que se une el compuesto

móvil por intercambio iónico influye directamente en la capacidad de unión.
En membranas cuyo tamaño de poro es pequeño (menor de 600Å) no hay
espacio suficiente para unir el ión dentro de dichos poros por lo que la
cantidad de intercambiador por unidad de superficie es menor. Sin embargo,
en membranas con tamaño de poro mayor (mayor de 600Å) se puede unir el
compuesto móvil dentro de dichos poros, con lo que se incrementa la cantidad
de intercambiador por unidad de superficie. La porosidad busca una mayor
superficie de intercambio.
Donde existe mayor porosidad (derecha), se puede unir el compuesto móvil dentro de estos poros
incrementando la cantidad de intercambiador de superficie.
Potencial analítico de la cromatografía iónica
Que analiza la cromatografía iónica:

- Aniones inorgánicos y orgánicos: Fluoruros, cloruros, nitritos, bromuros,

nitratos, fosfatos, sulfatos, bromatos, cloritos, cloratos, acético, cítrico,
tartárico, láctico, sórbico, benzoico…
- Azúcares y polialcoholes: Monosacáridos, disacáridos, oligosacáridos,
polisacáridos.
- Cationes: Sodio, amonio, potasio, calcio, magnesio…

Determinación de cationes por cromatografía iónica

Se pueden determinar los cationes siguientes: Ca2+, Mg2+, Na+, K+, NH4+,
Li+, Ba2+, Sr2+, es decir, calcio, magnesio, sodio, potasio, amonio, litio,
bario y estroncio. El método de determinación cromatográfica de estos iones
viene descrito en la norma UNE-EN ISO 14911. Es aplicable a cualquier tipo
de aguas.

El fundamento de la determinación de los cationes es la separación por

cromatografía líquida con una columna de separación que utiliza como fase
estacionaria un intercambiador catiónico de baja capacidad. Como fase móvil
se emplean, generalmente, soluciones acuosas de ácidos débiles mono o
dibásicos (eluyente). Para la determinación se inyecta la muestra de agua en la
corriente de disolvente y pasa a través de la columna cromatográfica de
intercambio iónico. Los iones se van separando en función de sus afinidades
relativas por la columna.
La detección se efectúa con un detector conductimétrico. Es esencial que los
eluyentes tengan una conductividad lo suficientemente baja. Por esta razón,
con frecuencia se combina el detector conductimétrico con un sistema
supresor (una columna supresora cambiadora de aniones) que disminuya la
conductividad del eluyente y transforme los cationes separados en sus
correspondientes bases.
Algunos ejemplos de eluyentes que se utilizan en el proceso son la
combinación de ácido clorhídrico/DAP (clorhidrato de ácido DL-2,3-
diaminopropiónico) o el ácido metanosulfónico.
Determinación de aniones por cromatografía iónica
Se pueden determinar los aniones siguientes: Cl–, SO42-, NO3–, PO43-, F–,
NO2–, I–, Br–, SO32-, S2-, ClO3–, SCN–, S2O32-, ClO2–, es decir, cloruro,
sulfato, nitrato, fosfato, fluoruro, nitrito, yoduro, bromuro, sulfito, sulfuro,
clorato, tiocianato, tiosulfato y clorito. El método para la determinación de
estos aniones viene descrito en la norma UNE-EN ISO 10304, que tiene
diversas partes, para aguas residuales y para aguas poco contaminadas, por lo
que se puede aplicar, con particularidades, a aguas de muy distinta
procedencia. De todos los métodos de análisis de aniones, sólo la
cromatografía iónica proporciona una técnica instrumental única que se puede
utilizar para hacer una medida secuencial y rápida. También se usa la
cromatografía líquida con supresión química de la conductividad, utilizando
en este caso una columna supresora cambiadora de cationes tras la separación.
También se debe atenuar la conductividad de fondo del eluyente, que en este
caso suele ser una solución de carbonato de sodio o carbonato-bicarbonato.
Los iones separados por la columna cromatográfica pasan posteriormente a
una columna supresora, en la cual se transforman en su forma ácida de alta
conductividad, y el disolvente carbonato-bicarbonato se convierte en ácido
carbónico débilmente conductor.

APLICACIONES:
Aplicaciones en el medio ambiente e industriales:
Permite el testeado cuantitativo de los electrolitos y aditivos patentados de los
baños de electrochapado o en pruebas menos precisas de testeo de UV.

• Tratamiento de agua (Ablandamiento)

Agua potable, de mar, residuales, de lluvia
• Determinación de ultratrazas en plantas de energía,
• Control de calidad y análisis de impurezas,
• Análisis elemental (Wickbold & Schoeninger),
• Industrias de alimentos y bebidas (Purificación del fibrinógeno de la
leche)
• Hidrometalurgia
• Acabado textil
• Insutrias agroindustriales Determinación de pesticidas

Aplicaciones clínicas
• Medir los niveles de Hemoglobina glicosilada (HbA1c),
porfirinas y para purificar agua y producir agua desionizada en
pequeñas cantidades.

Ventajas:
 Alta capacidad
 Alta resolución
 Paso concentrador: Se puede sembrar un gran volumen para luego
eluirlo en un menor volumen.
 Con una misma columna se puede utilizar a diferentes pH y obtener
diversos perfiles de elución.

Desventajas:
 Las muestras deben estar desalinizadas antes de ser aplicadas a este tipo
de cromatografía